bio.unsoed.ac.id L PENDAHULUAN II. PEMBUATAN MEDIUM KULTUR kimia yang terdapat pada resep media dasar. Bahan kimia media seperti hara makro, Oleh:

Transkripsi

1 PEMB UATAII MEDIUM KULTUR JARINGAFT A.IYGGREK.) Oleh: Dr. Murni Dwiati, M.Si**) L PENDAHULUAN Perbanyakan tanaman dengan sistem Kultur Jaringan dilaksanakan dalam suatu laboratorium yang aseptik, baik peralatan maupun bahan-bahannya. Peralatan sederhana yang masih sederhana dapat digunakan yaitu almari penabur {ent kns) buatan sendiri ataupun dengan peralatan laboratorium kulturjaringan khusus yang lebih canggih seperti Laminar Air Flow Cabinet. Salah salu faktor penentu keberhasilan pelaksanaan kerja kultur jaringan adalah pemberian nutrisi dalam jumlah dan perbandingan yang benar pada medium kultur. Medium yang dipergunakan pada kultur in vitro tumbuhan ada bermacam-macam. Pemilihan medium tergantung pada jenis tanaman yang digunakan, selera, tujuan serta perhitungan masing-masing peneliti (Sherrington, L984 dalam Indrianto, 2AA2). Pada dasarnya tidak ada satu macam medium kultur yang dapat memberikan pertumbuhan optimal untuk semua sel, penggantian medium atau salah satu komponen medium seringkali diperlakukan untuk merespon setiap type pertumbuhan dan satu macam eksplan. II. PEMBUATAN MEDIUM KULTUR Sebelum membuat medium, terlebih dahulu kita harus menentukan medium apa yang akan dibuat. Jenis medium dengan komposisi ursur kimia yang befbeda dapat digunakan untuk media tumbuh dari jaringan tanaman yang berbeda pula. Misalkan, medium Vacin Went saogat baik untuk media tumbuh Anggreh tetapi tidak cocok untuk media tumbuh tanaman yang lain. Unfuk menanam eksplan dari tanaman keras sering menggunakan medium WPM, sedangkan untuk tanaman semusim (sayuran dan tanaman hias) sering menggunakan medium MS. Medium Knudson C hanya cocok untuk menanam eksplan kelapa Kopyor dan Anggrek. Guna membuat medium kultur jaringan, dilakukan penimbangan setiap bahan kimia yang terdapat pada resep media dasar. Bahan kimia media seperti hara makro,.) Disampaikan dalam rangka Unsoed Fair di Graha Widya Tama pada tanggat 17-2A **) Dosen tetap Fakultas Biologi Unsoed Page L

2 sukrosa, agar-agar dapat ditimbang, sedangkan untuk bahan media seperti hara mikro, besi (Fe), Vitamin, hormon dan mio inositol karena ukuran sangat kecil maka harus dilakukan dengan cara membuat larutan stok supaya takaran sesuai dengan resep yang ditentukan. Untuk pembuatan larutan stok harus dilakukan dengan cermat, jangan terlalu pekat karena dapat teriadi pengendapan apabila disirnpan dalam lemari es, apabila terjadi pengendapan harus dipanaskan dulu sebelum digunakan dan apabila terkontaminasi mikoorganisme tidak dapat digunakan kembali Carapembuatan larutan stok, media MS, stok hara mikro. Cara pembuatan larutan stok mikronutrien pada medium MS mikronutriefi yang diperlukan jumlahnya sangat sedikit, maka stok mikronutrien harus dibutat dalam satu wadah sebagai stok campuran. Di bawah ini akan dibuat larutan stok (Ari Indrianto, 1990) dengan volume 500 ml (100 kali konsentrasi). Dalam contoh ini sengaja dibuat 100 kali konsentrasi dengan tujuan ffipaya dalam panimbangan komponen bahan kimia tidak mengalami kesesulitan sebab berat bahan kimia tersebut sangat kecil (CoCl2.6H2O beratnya 4,025 mili gram). Apabila konsentrasi dikalikan 100 maka penimbangan menjadi 2,5 mili gram sehingga tidak telalu kecil dan tidak sulit untuk ditimbang. Langkah-langkah pembuatannya ialah sebagai berikut : (a) Menimbang bahan-bahan kimia mikronutrien dengan timbangan analitik masingmasing sebanyak : MnSO+.HzO ZnSO+.4HzO HrBO: KJ NaMoO+.2HzO CUSO+.5HzO CoClz.6ItO 2.230,A mg 860,0 mg 620,0 mg 83,0 mg 25,0 mg 2,5 mg 2,5 mg (b) Bahan-bahan tersebut dimasukkan salu per satu ke dalam gelas piala 500 ml yang berisi air suling sebanyak 300 ml. Setiap kali dimasukkan bahan kimia harus segera dilarutkan (botol erlenmeyer digoyang-gayaflg pelan-pelan dengna arah memutar). Kemudian bahan-bahan berikutnya dimasukkan. Apabila semua bahan kimia

3 dimasukkan secara bersamaan, dapat terjadi presipitat (endapan). Apabila bahan kimia tersebut ada yang sukar dilarutkan, dapat menggunakan alat magnetic stirer. (c) Larutan yang sudah jadi kemudian ditambah air suling sampai volume menjadi 500 ml' (d) Botol-botol tersebut ditutup dengan rapat, kemudian diberi label : Mikronutrien 100 kali,5 mul. (e) Untuk membuat I liter medium memerlukan 5 ml stok, dan untuk membuat 50 ml medium memerlukan 2,5 ml stok. Untuk larutan stok besi karena komponen Na2.EDTA dan FezSO+.7H2O sukar larut di dalam air suling, maka perlu ditambahkan beberapa tetes HCl, dan kemudian dipanaskan Stok Zat Pengatur tumbuh Penentuan zat pengatur tumbuh yang akan digunakan memerlukan pengetahuan tentang cara menghitung dosisnya. Hal ini sangat penting karena apabila perhitungannya keliru dapat berakibat fatal bagi pertumbuhan jaringan. Seperti telah diuraikan di muka bahwa zat pengatur tumbuh dengan dosis yang terlalu tinggi justru akan mnghambat pertumbuhan kalus. Zat pengatur tumbuh hanya diperlukan dalam jumlah sedikit sekali. Biasanya zat pengatur tumbuh ini dibuat dengan kepekaan 1-10 mg/ml. Menurut Indrianto (1990), cara membuat larutan stok IAA, NAA, 2,4-D sebanyak 100 ml dengan dosis 1000 ppm (l mg/l ml) adalah sebagai berikut: (l) Bahan sebanyak 100 mg ditimbang dan setiap bahan dituangkan ke dalam gelas piala 100 ml yang berisi air suling kira-kira 70 ml. (2) Sambil diaduk, diteteskan sedikit larutan KOH I N dengan hati-hati sampai larut benar (ernih). (3) Larutan dipindahkan dalam labu takar 100 ml dan ditambah air suling sampai volume menjadi 100 ml. (4) Memindahkan larutan ke dalam wadah stok, kemudian ditutup rapat-rapat, dan diberi label IAA (1 mg/ml), NAA (1 mg/ml), 2,+D (1 mg/ml), atai IBA (1 mdml). Selanjutnya disimpan dalam almari es. (5) Untuk membuat perlakuan auksin pada media I ml stok setara dengan I mg auksin. 'l Disampaikan dalam rangka Unsoed Fair di Graha Widya Tama pada tanggal 17'20 *') Dosen tetap Fakultas Biologi Unsoed Page 3

4 Sisa dari larutan stok dapat disirnpan dan dapat digunakan lagi apabila membuat medium yang lain. Jika larutan stok yang tersedia tadi dalam dosis 1000 ppm, dan diumpamakan pembuatan medium yang baru memerlukan larutan stok dengan dosis 2 ppm sebanyak 500 ml, maka larutan stok yang akan kita ambil dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut : VlMl: Vl= MI: V2 : M2 : Y2l'/12 volume larutan stok yang dicari (x) dosis larutan stok yang tersedia volume medium yang akan dibuat dosis medium yang akan dibuat Maka perhitungannya adalah sebagai berikut : VlMl : VZl,l2 x,1000: x = l mvliter Berarti sntuk membuat medium dengan volume 500 ml, kita mengambil larutan stok sebanvuk t 500 r 1= 0,5m1 ' CaraMembuat Medium MS Kornposisi hormon datrarn media sangat bervariasi, tergantung dari spesies atau varietas tanaman yang dikembangbiakan, eksplan yang dipakai, dan tujuan dari kultur. Oleh karena itu, penambahan zat pengatur tumbuh tidak dapat dkerapkan kadamya.tidak dapat diterapkan kadarnya.ikut ini dijelaskan tahap-tahap pembuat rnediurn yang diperjelas dengan skema pembuatan medium MS (Gambar- 20) Keterangan Gambar : l. Menyiapkanalat-atat yang akan,etrigunakan, yaitu : timbangan analitik, tabung erlenmeyer, gelas ukur, gelas piala, pipet, pengaduk kaca, stirer, kompor gas, kerta ph, botol medikurn, ahrminitlrn foil, kapas (boleh tidak)- 2. Bahan kimia makro nutrien dan setiap larutan stok sudah dipersiapkan dengan dosis 1 mg/mt. 3. Aquades sebanyak kurang lebih 300 ml dalam labu erlenmeyer dipersiapkan.

5 Makro nutrien Stok mikronutrien Sukrosa Tambahkan aq uades sampai mendekati 1000 ml UkurpH BilaPH kurang tambah KOH Bila ph lebih tambah HCL Tambahkan aquades sampai volume menjadi 1000 ml Masukkan AGAR-AGAR, panaskan sampai larut sambil diaduk dengan pengaduk kaca Tuangkan larutan dalam erlenmeyer atau botol kultur Tutup botol dengan kapas dan alumunium foil, Ialu STER{LISASI Gambar 20. Skemapembuatan medium MS volume I liter ': Oi**p"if* dalam rangka Unsoed Fair di Graha Widya Tama pada tanggal **) Dosen tetap Fakultas Biologi Unsoed Page 5

6 4, Menimbang komponen-komponen bahan kimia makro nutrien, kemudian dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer tadi satu per satu sambil digoyangkan s cara memutar datar sehingga bahan kimia yang dituangkan sungguh-sungguh 5. larut. Mengambil larutan stok besi, mikro nutrien,vitamin dan hormon yang dosisnya 1000 ppm, sehingga untuk I liter medium harus diambil l0 ml larutan stok. Labu erl enmeyer di goyan gkan. 6. Menimbang mio-inositol dan sukrosa, kemudian dimasukkan ke dalam labu satu per satu sambil digoyang-goyangkan sampai larut. 7. Aquades dituangkan sampai kurang lebih menjadi 900 ml(mendekati 1000 ml). g. ph-nya diukur dengan menggunakan kertas ph, dan dilihat angkanya pada skala warna. Bila ph masih dibawah 5,7 mak,a perlu ditambah KOH 1-2 tetes, tetapi bila ph sampai mencapai 6,0 (melebihi 5,8) maka ditambah HCI 1 tetes. 9. Menuangkan aquades hingga volume mencapai 1000 ml. 10. Memasukkan agar-agar ke dalam labu. 11. Erlenmeyer dipanaskan di atas kompor gas sambil diaduk dengan pengaduk kaca sampai mendidih dan agarnya larut semua. 12. Dituang ke dalam botol medium kurang lebih 5-10 ml perbotol, tergantung besar kecilnya botol. 13. Botol medium ditutup dengan aluminium foil, dan diusahakan supaya benar-benar tertutup rapat. 14. Memasukkan botol-botol medium tersebut ke dalam autoklaf dan disterilisasi dengan suhu 120oC, dantekanan 1,5 kg/cm2 selama 15 *2A menit. 15. Botol-botol yang mediumnya sudah steril diangkat, kemudian disimpan di tempat yang sejuk sampai siap untuk penanaman eksplan. Penutup Proses pembuatan medium kultur harus dilakukan dengan cermat agar unsur yang tersedia bagi eksplan anggrek tidak rusak oleh proses pemanasan, dan proses pengaturan media. Karena apabila pengaturan ph dilakukan dengan sembarangan, serta tidak tepat pada 5,8, maka media tidak dapat memadat, unsur hara yang semula tersedia menjadi bentuk yang

7 tidak tersedia. unsur-unsur hara ini tidak dapat diserap oleh eksplan anggrek' Akibatnya eksplan tidak dapat tumbuh. Daftar Pustaka Hendaryono, D.P.S. dan Ari wijayani,l994. Teknik Kultur Jaringan' Pengenalan dan Petunjuk Perbanyakan Tanaman secara vegetatif - Modern, Penerbit Kanisius - Jakarta. Nugroho, A dan Sugito, H Pedoman Pelsl{sanaan Tebtik Kultur Jaringan' Penebar swadaya. Jakarta-.l Disampaik* dulffi di c*t u Widya Tama pada ta$ggal **) Dosen tetap Fakultas Biologi Unsoed PageT