METODOLOGI PENELITIAN

Transkripsi

1 III. METODOLOGI PENELITIAN A. BAHAN DAN ALAT Bahan-bahan yang digunakan dalam pembuatan low fat fruity yogurt adalah adalah susu skim bubuk, angkak komersial dari Pasar Petak Sembilan Jakarta, gula pasir, tepung maizena, buah strawberi, kultur starter Streptococcus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus, dan Bifidobacterium bifidum. Bahan-bahan yang digunakan dalam analisis antara lain: APDA (Acidified Potato Dextrose Agar), BGLBB (Brilliant Green Lactose Bile Broth), larutan pengencer KH 2 PO 4, MRSA (deman Rogosa Sharpe Agar), dan media deman Rogosa Sharpe Broth (MRSB), PCA (Plate Count Agar), air destilata, K 2 SO 4, HgO, Na 2 S 2 O 3, H 2 SO 4, H 3 BO 3, NaOH, HCl, kristal kaliumhidrogenftalat (KHP), kristal kalium dihidrogenfosfat (KH 2 PO 4 ), asam tartarat, indikator fenolftalein, indikator campuran metil merah dan metilen biru dalam etanol, DPPH, metanol proanalysis, dan larutan standar asam askorbat. Alat-alat pendukung yang digunakan dalam pembuatan low fat fruity yogurt adalah cup plastik, gelas pengaduk, gelas piala, inkubator, hot plate, labu Erlenmeyer, pipet Mohr, ose, kain saring dan termometer. Instrumen yang digunakan dalam analisis adalah cawan petri, buret, cawan alumunium, cawan porselin, labu lemak, labu Kjeldahl, desikator, gegep, pinset, pembakar bunsen, kuvet, hand refraktometer, autoklaf NX-20, neraca analitik Zeta SA-120, ph-meter Toledo RS-23, viskometer Brookfield, tanur listrik SE-1092, oven pengering Memert A230, destilator XM-50, dan spektrofotometer UV-VIS Spectronic 20 D+. B. METODE PENELITIAN Penelitian ini dibagi menjadi tiga tahap, yaitu: (1) Penentuan konsentrasi maksimum ekstrak angkak yang tidak menghambat pertumbuhan bakteri asam laktat, (2) Formulasi low fat fruity yogurt dengan ekstrak angkak dan buah segar dan, (3) Pengkuran kapasitas antioksidan dan evaluasi kandungan gizi untuk pemenuhan persyaratan SNI low fat fruity yogurt. Diagram alir penelitian dapat dilihat pada Gambar Konsentrasi Maksimum Ekstrak Angkak yang Tidak Menghambat Pertumbuhan Mikroba a. Ekstraksi Zat Pigmen Angkak (modifikasi Jenie et al. 1994) Ekstraksi pigmen angkak dilakukan dengan menggunakan air sebagai pelarut dengan perbandingan angkak dan air adalah 1: 10 (b/v) yang dilakukan dalam rotary shaker dengan kecepatan 300 rpm selama 1 jam. Hasil ekstraksi kemudian disaring dengan menggunakan kain saring sehingga didaptkan ekstrak angkak dalam bentuk filtrat. Ekstrak angkak siap digunakan. 12

2 Angkak Tahap I Ekstraksi Ekstrak Angkak Penentuan Aktivitas Antimikroba Ekstrak Angkak Konsentrasi Ekstrak Angkak yang Tidak Menghambat Pertumbuhan BAL Susu skim Pencampuran Pasteurisasi Pendinginan Kultur Starter Fermentasi Low fat yogurt Tahap II Penentuan Formula Konsentrasi Angkak Low FatYogurt dengan formula konsentrasi ekstrak angkak terpilih Uji Organoleptik (Rating dan Rangking) Penentuan Formula Penambahan Buah Segar Uji Organoleptik (Rating dan Rangking) Low Fat Fruity Yogurt probiotik yang disukai oleh konsumen Analisis Kimia, Fisik dan Mikrobiologi Tahap III Low Fat Fruity Yogurt yang memenuhi SNI dan memiliki kapasitas antioksidan Gambar 7. Diagram alir penelitian 13

3 b. Penentuan Aktivitas Antimikroba Ekstrak Angkak (Kusumaningrum et al. 2009) Uji aktivitas antimikroba ekstrak angkak terhadap pertumbuhan bakteri asam laktat dilakukan dengan menggunakan metode difusi sumur. Pada cawan petri berisi media MRSA dengan kultur bakteri asam laktat dibuat lima lubang. Di setiap lubang diteteskan larutan ekstrak angkak dengan berbagai macam konsentrasi. Ekstrak yang digunakan adalah ekstrak angkak steril yang dibuat dengan cara melakukan filtrasi ekstrak angkak pada membran milipore dengan ketebalan 0.2 µm. Filtrasi dilakukan dengan menghubungkan pada alat rotovapour. Konsentrasi ekstrak angkak steril yang diujikan adalah 0 (kontrol negatif), 5, 10, 20 dan 30%. Kemudian diinkubasi selama 1 hari. Dan diamati apakah terbentuk zona penghambatan di sekitar sumur. 2. Formulasi Low Fat Fruity Yogurt dengan Ekstrak Angkak dan Buah Segar a. Pemeliharaan Kultur (Hariyadi et al. 2001) Pemeliharaan kultur dilakukan dengan metode pendinginan. Pemeliharaan kultur tersebut dapat dilakukan dengan cara menusukkan kultur pada media agar chalk semisolid MRSA lalu diinkubasi pada suhu 37 o C selama 1 hari. Kultur dapat ditumbuhkan kembali dengan menginokulasikan 1 ose kultur dari agar chalk semisolid pada MRSB dan diinkubasi pada suhu 37 o C selama 1 hari. Diagram alir pemeliharaan kultur dapat dilihat pada Gambar 8. Diambil 1 loop dan diinokulasikan ke dalam MRSA Chalk Semisolid Diinkubasi 37 o C selama 1 hari Disimpan dalam refrigerator Diambil 1 loop untuk penyegaran Diinokulasikan pada MRSB Diinkubasi 37 o C selama 1 hari Kultur Stok Gambar 8. Diagram alir pemeliharaan kultur 14

4 b. Pembuatan Kultur Induk dan Kultur Kerja (Hariyadi et al. 2001) Pembuatan kultur induk dilakukan dengan menggunakan kultur murni pada MRSB. Sebanyak 5% kultur murni ditambahkan ke dalam susu skim 10% sebanyak 100 mldan selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 o C selama 1 hari. Kultur induk siap digunakan untuk membuat kultur kerja. Pembuatan kultur kerja Streptococcus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus, Bifidobacterium bifidum dilakukam dengan cara menginokulasikan masing-masing 5% kultur induk ke dalam susu skim 12% sebanyak 100 ml. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 o C selama 1 hari. Kultur kerja ini siap untuk digunakan dalam pembuatan yogurt. Apabila tidak langsung digunakan, kultur kerja dapat disimpan dalam refrigerator. Diagram alir pembuatan kultur induk dan kultur kerja dapat dilihat pada Gambar 9. Ditambahkan ke dalam 50 ml susu skim 10% steril Diinkubasi pada suhu 37 o C selama 1 hari Kultur induk 5 % Kultur induk ditambahkan ke dalam 100 ml susu skim 10% steril Diinkubasi pada suhu 37 o C selama 1 hari Kultur kerja Gambar 9. Diagram alir pembuatan kultur induk dan kultur kerja c. Penetapan Konsentrasi Ekstrak Angkak Untuk mendapatkan formula ekstrak angkak, maka dilakukan uji organoleptik secara subjektif dengan panelis terbatas. Konsentrasi ekstrak angkak yang diujikan dimulai dari 1.0, 2.5, 5.0, 7.5, 8.0, 9.0 dan 10%. Tiga konsentrasi ekstrak angkak yang paling disukai akan dipilih untuk formulasi lebih lanjut. d. Formulasi Konsentrasi Ekstrak Angkak Setelah mendapatkan tiga konsentrasi ekstrak angkak terpilih, tahap selanjutnya adalah melakukan uji organoleptik untuk mendapatkan formula yogurt dengan konsentrasi ekstrak angkak yang paling disukai oleh panelis. Uji organoleptik dilakukan 15

5 dengan menggunakan uji rating dan rangking hedonik. Skala penerimaan uji rating berkisar antara 1-7. e. Formulasi Konsentrasi Penambahan Buah Segar Setelah mendapatkan formula dari ekstrak angkak yang paling disukai, tahap selanjutnya adalah melakukan penambahan buah segar dalam bentuk potongan buah. Buah segar yang digunakan dalam penelitian ini adalah buah strawberi. Penambahan buah segar dilakukan untuk meningkatkan penerimaan panelis terhadap yogurt yang telah dihasilkan sebelumnya. Penambahan buah segar dilakukan pada tiga macam konsentrasi, yaitu 10%, 20%, dan 30%. Kemudian dilakukan uji organoleptik dengan menggunakan uji rangking dan rating hedonik untuk menentukan konsentrasi penambahan buah segar yang paling disukai oleh panelis. Penyajian sampel pada uji organoleptik dilakukan dalam keadaan dingin. Skala penerimaan uji rating berkisar antara 1-7. f. Uji Organoleptik (Adawiyah dan Waysima 2009) a. Uji Rating Hedonik Uji rating digunakan bila uji sensori bertujuan menentukan dalam cara bagaimana suatu atribut sensori tertentu bervariasi di antara sejumlah contoh (jumlah contoh bervariasi dari tiga hingga enam contoh). Pada uji rating hedonik, panelis diminta untuk menilai atribut sensori dari yogurt (rasa, warna, aroma, tekstur) dan keseluruhan sifat sensori yogurt berdasarkan tingkat kesukaannya. Skala pengukuran yang digunakan dapat berupa skala kategori atau skala garis. Data yang diperoleh diolah dan dianalisis menggunakan ANOVA (Analysis of Variance). Persyaratan jumlah minimum panelis untuk uji rating hedonik menurut American Srandard Testing Material (ASTM) adalah 70 panelis tidak terlatih. Dalam penelitian ini, digunakan panelis tidak terlatih sebanyak 70 orang. Taraf signifikansi yang digunakan adalah 5%. Dalam penelitian ini, uji rating hedonik yang dilakukan menggunakan skala kategori 7-point dengan deskripsi sebagai berikut: 1 = sangat tidak suka 2 = tidak suka 3 = agak tidak suka 4 = netral 5 = agak suka 6 = suka 7= sangat suka b. Uji Rangking Hedonik Uji ranking hedonik digunakan untuk membandingkan kesukaan panelis terhadap atribut sensori tertentu (rasa, warna, dan aroma) dan keseluruhan sifat sensori produk sari tempe. Panelis akan menerima tiga atau lebih contoh berkode 16

6 dan diminta untuk mengurutkan dari yang paling disukai hingga yang paling sedikit disukai atau kurang disukai. Contoh disajikan secara bersamaan agar panelis dapat membandingkan antarcontoh. Panelis diminta memberi skor 3 bagi contoh yang paling disukai, skor 2 bagi contoh yang lebih kurang disukai daripada contoh 3, skor 1 bagi contoh yang tidak disukai daripada contoh 2, demikian seterusnya hingga semua contoh diberi skor. Data yang diperoleh dianalisis dengan Friedman Test. Persyaratan jumlah minimum panelis untuk uji ranking hedonik menurut ASTM adalah 50 panelis tidak terlatih. Dalam penelitian ini, digunakan panelis tidak terlatih sebanyak 70 orang. Taraf signifikansi yang digunakan dalam penelitian ini adalah 5%. 3. Evaluasi Kandungan Gizi untuk Pemenuhan Persyaratan SNI a. Analisis Kimia 1. Nilai ph (Faridah et al. 2009) Sebelum dilakukan pengukuran, ph-meter dinyalakan dan distabilkan terlebih dahulu selama menit. Selanjutnya ph-meter dikalibrasi dengan menggunakan larutan buffer ph 4 dan ph 7. Elektroda dibilas dengan akuades dan dikeringkan dengan kertas pengering. Sebanyak 20 ml sampel dimasukkan ke dalam gelas piala 100 ml. Elektroda ph-meter dibilas dengan air destilata, dikeringkan, dan dicelupkan ke dalam sampel. Angka yang tertera pada layar menunjukkan nilai ph yogurt. Sealanjutnya, elektroda kembali dibilas dengan air destilata, dikeringkan, dan dapat digunakan kembali untuk pengukuran ph sampel. 2. Total Asam Tertitrasi (Latimer dan Horwitz 2007) Pengukuran total asam tertitrasi menggunakan prinsip asam basa dengan metode titrimetri. Sebanyak 10 ml sampel dimasukkan ke dalam erlenmeyer, kemudian ditambahkan 3 tetes indikator fenolftalein 1%. Sampel dititrasidengan larutan NaOH 0.1 N yang telah distandardisasi sampai terbentuk warna merah muda. Persen total asam tertitrasi terhitung sebagai asam laktat. VxNx 90xFP Wx1000 TAT (%) asam laktat = x100% Keterangan : W = bobot cuplikan NaOH (ml) V = volume larutan NaOH (ml) N = normalitas larutan NaOH FP = faktor pengenceran 17

7 3. Total Padatan Terlarut (Latimer dan Horwitz 2007) Pengukuran TPT menggunakan Hand Refractometer (0-39 Brix). Sebelum digunakan alat dibersihkan terlebih dahulu dengan alkohol dan dilap hingga kering. Sampel yang akan diukur kemudian diletakkan secukupnya pada tempat pembacaan. Kemudian nilai TPT ditunjukkan oleh angka yang didapat pada batas garis biru dan putih. 4. Kadar Air (Latimer dan Horwitz 2007) Cawan aluminium dikeringkan dalam oven selama 15 menit,didinginkan dalam desikator selama 10 menit, kemudian ditimbang (A). Sejumlah sampel dengan bobot tertentu (B) dimasukkan ke dalam cawan. Cawan beserta isinya dikeringkan dalam oven 100 o C selama 6 jam. Cawan dipindahkan ke dalam desikator untuk didinginkan, kemudian ditimbang. Cawan beserta isinya dikeringkan kembali sampai diperoleh bobot konstan (C). Kadar air contoh dapat dihitung dengan persamaan berikut: B ( C A) Kadar Air (% bb) = x100% B Ket: bb = basis basah 5. Kadar Abu (Latimer dan Horwitz 2007) Cawan yang dipersiapkan untuk pengabuan contoh dikeringkan dalam oven selama 15 menit, lalu didinginkan dalam desikator dan ditimbang (A). Sampel dengan bobot tertentu (B) dimasukkan ke dalam cawan (B), kemudian dibakar dalam ruang asap sampai tidak mengeluarkan asap lagi. Selanjutnya, dilakukan pengabuan di dalam tanur listrik pada suhu o C selama 4-6 jam sampai terbentuk abu berwarna putih dan memiliki bobot yang tetap. Abu beserta cawan didinginkan dalam desikator, kemudian ditimbang (C). Kadar abu contoh dapat dihitung dengan persamaan berikut: Kadar Abu (% bb) = C A x 100% Kadar Abu (% bk) = Ket: bk = basis kering B Kadarabu (% bb ) 100 Kadarair (% bb ) 6. Kadar Lemak (Latimer dan Horwitz 2007) Labu lemak disediakan sesuai dengan ukuran alat ekstraksi soxhlet yang digunakan. Labu dikeringkan dalam oven dengan suhu o C selama 15 menit, kemudian didinginkan dalam desikator lalu ditimbang (A). Sejumlah sampel yogurt 18

8 dengan bobot atau volume tertentu (B) diteteskan pada kapas bebas lemak yang dimasukkan dalam kertas saring. Kertas saring beserta isinya dimasukkan ke dalam ekstraksi soxhlet dan dipasang pada alat kondensor. Pelarut heksana dituangkan ke dalam labu lemak secukupnya dan dilakukan refluks selama 5 jam sampai pelarut yang turun kembali menjadi bening. Pelarut yang tersisa dalam labu lemak didestilasi dan kemudian labu dipanaskan dalam oven pada suhu 105 o C. Setelah dikeringkan sampai mencapai bobot tetap dan didinginkan dalam desikator, labu beserta lemak ditimbang (C). Kadar lemak contoh dapat dihitung dengan persamaan berikut: Kadar Lemak (% bb) = C A x 100% Kadar Lemak (% bk) = B Kadarlemak (% bb ) 100 Kadarair (% bb ) 7. Kadar Protein (Latimer dan Horwitz 2007) Sampel sebanyak ± mg dimasukkan kedalam labu Kjeldahl, ditambah dengan 1 ± 0.1 g K 2 SO 4, 40 ± 10 mg HgO dan 2 ± 0.1 ml H 2 SO 4 pekat. Sampel didestruksi selama 30 menit hingga cairan menjadi jernih. Isi labu dipindahkan ke dalam alat destilasi dan dibilas 5-6 kali dengan air destilata sebanyak 1-2 ml, kemudian ditambahkan 8-10 ml campuran larutan 60 % NaOH- 5%Na 2 S 2 O 3. Labu tersebut disambungkan dengan alat destilasi dan kondensor yang telah dilengkapi dengan penampung yang berisi larutan H 3 BO 3. Destilasi dilakukan sampai diperoleh volume destilat sebanyak 15 ml, kemudian destilat dititrasi dengan HCl 0.02Nsampai larutan berubah warna dari hijau menjadi abu-abu (titik akhir). Indikator yang digunakan dalam titrasi ini adalah campuran dua bagian 0.2% metil merah dalam etanol dan satu bagian 0.2% metilen biru dalam etanol. Sebelum digunakan, HCl terlebih dahulu distandarisasi menggunakan NaOH dengan indikator fenolftalein. NaOH sebelumnya distandarisasi menggunakan larutan kaliumhidrogenftalat (KHP) dengan indikator fenolftalein. Kadar protein contoh dapat dihitung dengan persamaan: Kadar Nitrogen (%) = mlhclconto h mlhclblanko x HCl x gramsampel Kadar Protein (% bb) = Total Nitrogen (%) x faktor konversi Ket : faktor konversi = 6.38 (untuk yogurt) Kadar Protein (% bk) = Kadarprotein (% bb ) 100 Kadarair (% bb ) x 100% 8. Kadar Karbohidrat (by difference) Kadar karbohidrat dihitung secara by difference dengan menggunakan persamaan : Kadar Karbohidrat (% bb) = 100% - (P + A + Ab +L) Kadar Karbohidrat (% bk) = Kadarkarbo hidra t (% bb ) 100 Kadarair (% bb ) 19

9 Ket : P= kadar protein (% bb) A= kadar air (% bb) Ab= kadar abu (% bb) L= kadar lemak (% bb) 9. Kapasitas Antioksidan Metode DPPH (Molyneux 2002) Analisis kapasitas antioksidan yang dilakukan dalam penelitian ini menggunakan metode spektrofotometri, yaitu metode reduksi DPPH (2,2-difenil-1- pikrilhidrazil). Larutan-larutan yang dibutuhkan adalah larutan DPPH 1 mm dalam metanol proanalysis, metanol, larutan standar asam askorbat, dan sampel. Analisis kapasitas antioksidan terdiri atas dua tahap, yaitu a) pembuatan kurva standar asam askorbat dan b) penentuan kapasitas antioksidan sampel. a. Pembuatan Kurva Standar Asam Askorbat Seri larutan standar asam askorbat dibuat dengan konsentrasi 0 ppm, 50 ppm, 100 ppm, 200 ppm, dan 500 ppm. Larutan blanko dibuat dengan mencampurkan 8 ml metanol dengan 2 ml larutan DPPH. Larutan standar dibuat dengan mencampurkan 7 ml metanol dan 2 ml larutan DPPH dengan 1 ml standar asam askorbat pada masing-masing konsentrasi. Larutan didiamkan pada suhu ruang selama 30 menit untuk selanjutnya diukur absorbansinya (A) menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 520 nm. Pengukuran dilakukan secara duplo dengan dua kali ulangan. Selanjutnya dibuat kurva standar asam askorbat dengan memplotkan hubungan antara konsentrasi asam askorbat dan (A blanko A sampel). b. Penentuan Kapasitas Antioksidan Sampel Larutan blanko dibuat dengan mencampurkan 8 ml metanol dengan 2 ml larutan DPPH. Larutan sampel dibuat dengan mencampurkan 7 ml metanol dan 2 ml larutan DPPH dengan 1 ml sampel. Larutan didiamkan pada suhu ruang selama 30 menit untuk selanjutnya diukur absorbansinya (A) menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 520 nm. Pengukuran dilakukan secara duplo dengan dua kali ulangan. Selanjutnya diperoleh nilai (A blanko A sampel) yang akan disubstitusikan pada persamaan kurva standar asam askorbat untuk menentukan AEAC (AscorbicAcid Equivalent Antioxidant Capacity). Nilai yang diperoleh menunjukkan jumlah mg asam askorbat yang ekivalen dengan 1 ml sampel. 20

10 b. Analisis Fisik 1. Viskositas Salah satu parameter sifat fisik yang menentukan mutu yogurt adalah viskositas. Pengukuran nilai viskositas dengan menggunakan Brookfield viskometer. Sebanyak 100 ml sampel dimasukkan dalam wadah sampel. Dengan menggunakan spindle 3 dan speed 12, dilakukan pengukuran viskositas sampel. Pengukuran dilakukan selama 2 menit hingga diperoleh pembacaan jarum pada posisi yang stabil. Rotor berputar dan jarum akan bergerak sampai diperoleh nilai viskositas sampel. Pembacaan nilai viskositas dilakukan setelah jarum stabil. c. Analisis Mikrobiologi (Fardiaz 1988) 1. Total Mikroba Sampel sebanyak 10 ml ditambahkan 90 ml larutan pengencer. Kemudian sampel diencerkan sampai dengan pengenceran Sebanyak 1 ml sampel yang telah diencerkan (pengenceran 10-5, 10-6, 10-7 ) dimasukkan ke dalam masing-masing dua cawan petri steril (duplo). Selanjutnyam dituangkan 15 ml media PCA yang telah didinginkan suhunya hingga o C dan digoyangkan secara mendatar diatas meja membentuk angka delapan supaya sampel menyebar rata. Cawan berisi agar yang sudah membeku diinkubasi dengan posisi terbalik pada suhu 30 o C selama 2 hari. Total mikroba ditetapkan dengan SPC (Standard Plate Count). Koloni yang dihitung berkisar antara koloni dan dinyatakan dalam CFU/ml. 2. Uji Koliform Sampel sebanyak 10 ml ditambahkan 90 ml larutan pengencer. Kemudian sampel diencerkan sampai dengan pengenceran 10-4 dengan menggunakan medium BGLBB dan tabung Durham didalam masing-masing media BGLBB. Setelah seluruh sampel diencerkan pada empat tingkat pengenceran maka tabung diinkubasikan pada suhu 37 o C selama 2 hari. Dihitung jumlah tabung positif yang ditandai dengan adanya pembentukan gas pada tabung Durham. Kemudian hasil pengamatan dicocokkan dengan tabel APM kombinasi 3 seri, dihitung dan dinyatakan dalam APM/ml. 3. Total Bakteri Asam Laktat Sampel sebanyak 10 ml ditambahkan 90 ml larutan pengencer. Kemudian sampel diencerkan sampai dengan pengenceran Sebanyak 1 ml sampel yang telah diencerkan (pengenceran 10-6, 10-7, 10-8 ) dimasukkan ke dalam masing-masing dua cawan petri steril (duplo). Selanjutnya dituangkan media MRSA steril yang telah didinginkan hingga suhunya o C sebanyak 15 ml dan digoyangkan secara mendatar di atas meja supaya contoh menyebar rata. Cawan berisi agar yang sudah membeku, diinkubasi dengan posisi terbalik pada suhu 37 o C selama 2 hari. Total 21

11 bakteri ditetapkan dengan SPC (Standard Plate Count). Koloni yang dihitung berkisar antara koloni dan dinyatakan dalam CFU/ml. 4. Total Kapang Khamir Contoh dengan beberapa pengenceran tertentu dimasukkan dalam cawan petri steril. Untuk setiap pengenceran digunakan dua cawan (duplo). Kemudian, ke dalam cawan tersebut dituang media APDA steril yang telah didinginkan hingga suhunya o C sebanyak 15 ml dan digoyangkan secara mendatar di atas meja supaya contoh menyebar rata. Cawan berisi agar yang sudah membeku, diinkubasi dengan posisi terbalik pada suhu 30 o C selama 2 hari. Total kapang khamir ditetapkan dengan SPC (Standard Plate Count). Koloni yang dihitung berkisar antara koloni dan dinyatakan dalam CFU/ml. 22