Potensi Daya Hambat Ekstrak Etanol Daun Binahong (Anredera cordifolia (Tenore) Steenis) terhadap Proliferasi Sel Kanker Lidah Manusia (SP-C1) In Vitro

Transkripsi

1 Potensi Daya Hambat Ekstrak Etanol Daun Binahong (Anredera cordifolia (Tenore) Steenis) terhadap Proliferasi Sel Kanker Lidah Manusia (SP-C1) In Vitro Inhibitor Potential Of Ethanol Extract Binahong (Anredera cordifolia (Tenore) Steenis) Leaves Against Human Tongue Cancer Cell (SP-C1) Proliferation in vitro Abstract Nita Yulia Hidayati 1, Ana Medawati 2, Supriatno 3 1 Program Studi Pendidikan Dokter Gigi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Muhammadiyah Yogyakarta, 2 Bagian Biomedik Program Studi Pendidikan Dokter Gigi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Muhammadiyah Yogyakarta, 3 Departemen Ilmu Penyakit Mulut Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Gadjah Mada Anredera cordifolia (Tenore) Steenis is traditional medicine which used by Indonesian people. It has the active substances of anticancer included saponin triterpenoid, alkaloid, polyphenol, flavonoids and fenolat acid. The aim of the study was to examine the inhibitor potential of ethanol extract Anredera cordifolia (Tenore) Steenis s leaves against human tongue cancer cells (SP-C1) proliferation. The design was pure laboratory experimental. This study used the culture of human oral tongue cancer cell (SP-C1) which was incubated by ethanolic extract of Anredera cordifolia (Tenore) Steenis s leaves in various concentrations (0, 50, 100, 200, 300, 400, 500 ), as control was carried out by Dulbecco s Modified Eagle Medium (DMEM) medium. Cytotoxic effect was evaluated by MTT assay. Anredera cordifolia (Tenore) Steenis s leaves can reduce the number of SP-C1 cell. The highest potential of extract ethanol Anredera cordifolia (Tenore) Steenis was occurred at 400 πg/ml which inhibited 74,72%. The result was ethanol extract of Anredera cordifolia (Tenore) Steenis s leaves could inhibit SP-C1 cell proliferation. Key words: Anredera cordifolia (Ten.) Steenis, human tongue Cancer cell (SP-C1), proliferation, MTT assay Abstrak Binahong (Anredera cordifolia (Tenore) Steenis) merupakan tanaman obat yang banyak digunakan oleh masyarakat Indonesia. Binahong memiliki zat aktif antikanker dalam bentuk saponin triterpenoid, alkaloid, polifenol, flavonoid dan asam fenolat. Penelitian ini bertujuan untuk mengkaji daya hambat ekstrak etanol daun binahong terhadap proliferasi sel kanker lidah manusia (SP-C1). Desain penelitian ini adalah eksperimental laboratoris murni. Penelitian ini menggunakan biakan sel kanker lidah (SP-C1) yang diinkubasikan dengan ekstrak etanol daun binahong dalam berbagai konsentrasi (0, 50, 100, 200, 300, 400, 500 ) selama 24 jam, sebagai kontrol digunakan biakan sel SP-C1 dalam media Dulbecco s Modified Eagle Medium (DMEM). Uji aktivitas sitotoksik dilakukan dengan metode MTT Assay. Pemberian ekstrak etanol daun binahong cenderung menurunkan jumlah sel kanker lidah (SP-C1). Potensi daya hambat proliferasi tertinggi ekstrak etanol daun binahong terjadi pada konsentrasi 400 πg/ml sebesar 74,72%. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun binahong dapat menghambat proliferasi sel kanker lidah manusia (SP-C1). Kata kunci: Daun Binahong, sel kanker lidah manusia (SP-C1), proliferasi, MTT assay

2 PENDAHULUAN Kanker merupakan salah satu penyebab utama kematian di seluruh dunia. Di dunia, kanker merupakan penyebab kematian nomor 2 setelah penyakit kardiovaskular. 1 Di seluruh dunia, rongga mulut merupakan salah satu dari sepuluh lokasi tubuh yang paling sering terserang kanker. Kanker mulut menempati peringkat ketiga sesudah kanker lambung dan kanker rahim. 2 Di antara kanker rongga mulut, kanker lidah adalah kanker yang paling sering ditemui. 3 Kanker lidah manusia mempunyai karakteristik penyakit yang sukar disembuhkan dan termasuk salah satu masalah kesehatan utama di dunia. Belum ada prognosis yang pasti untuk kanker lidah, bahkan dalam tahapan awal prognosisnya belum dapat diprediksi. 4 Penyebab kanker lidah masih belum jelas namun faktor yang berkaitan dengan kanker lidah meliputi karsinogen kimia yaitu nikotin dalam rokok yang bersifat karsinogenik dan alkohol sebagai zat pelarut karsinogenik, karsinogen fisika yaitu kesehatan gigi yang buruk, trauma radiasi, trauma mekanik seperti penyangga gigi, gigi tiruan yang kurang pas, terdapat sesuatu yang bergesekan dengan lidah sehingga menimbulkan transformasi ganas dan kebiasaan mengunyah pinang dapat menjadi faktor pemicu karsinogen, dan yang terakhir adalah karsinogen biologi yaitu infeksi treponema paliidium, HPV (Human Papilloma Virus) dan timbulnya kanker lidah jenis tertentu. Faktor genetik, kerentanan individual, diferensiasi nutrisi dan etnis juga berkaitan dengan timbulnya kanker lidah. 5 Perawatan untuk kanker lidah masih terbatas. Sampai saat ini perawatan kanker lidah masih dilakukan secara konvensional seperti kemoterapi, radioterapi, pembedahan dan kombinasi. 6 Perawatan yang paling umum untuk kanker lidah adalah operasi. Namun terapi radiasi pasca operasi dianjurkan untuk pasien dengan tumor yang besar dan primer (T3, T4), margin bedah positif, adanya invasi perineural (PNI), beberapa node positif, atau ekstensi ekstrakapsular (ECS). 7 Namun perawatan tersebut belum menunjukkan hasil yang signifikan. Oleh sebab itu

3 diperlukan strategi terapi baru untuk menghambat pertumbuhan sel secara efektif dan efisien tanpa resiko efek samping yang besar. 8 Salah satu alternatif perawatan yang dapat dipilih adalah dengan menggunakan tanaman obat. Salah satu tanaman yang menarik untuk diteliti adalah tanaman binahong (Anredera cordifolia (Tenore) Steenis). Tanaman binahong mengandung zat antikanker yaitu saponin triterpenoid, alkaloid, polifenol dan asam fenolat. 9 Di dalam polifenol terdapat kandungan flavonoids yang bersifat sebagai antioksidan yang dapat menurunkan resiko penyakit kronis termasuk kanker dengan target chemopreventif. 10 Senyawa flavonoid dapat menghambat proliferasi melalui inhibisi proses oksidatif yang dapat menyebabkan inisiasi kanker. Mekanisme ini terjadi karena adanya penurunan enzim xanthin oksidase, siklooksigenase (COX) dan lipooksigenase (LOX) yang diperlukan dalam proses prooksidasi sehingga menunda siklus sel. 11 Belum banyak literatur maupun penelitian ilmiah yang mengungkapkan khasiat tanaman binahong. Secara empiris, masyarakat memanfaatkannya untuk membantu proses penyembuhan beragam penyakit. 12 Penelitian ini bertujuan untuk mengkaji potensi daya hambat ekstrak etanol daun binahong (Anredera cordifolia (Tenore) Steenis) terhadap proliferasi sel kanker lidah manusia (SP-C1). BAHAN DAN METODE Desain penelitian ini adalah eksperimental laboratoris murni. Variabel pengaruh : konsentrasi ekstrak etanol daun binahong (Anredera cordifolia (Tenore) Steenis), 0, 50, 100, 200, 300, 400 dan 500 πg/ml. Variabel terpengaruh: daya hambat proliferasi sel kanker lidah manusia (sel SP-C1). Variabel terkendali: Konsentrasi ekstrak etanol daun binahong, jenis biakan sel yang digunakan, jumlah sel yang digunakan, waktu pengamatan daya hambat proliferasi, kondisi inkubasi, alat ukur daya hambat proliferasi menggunakan ELISA reader, temperatur ruang, media pertumbuhan sel, tempat pengambilan daun binahong.

4 Metode uji proliferasi yang digunakan adalah MTT assay. Sel yang masih hidup terlihat berserabut dan sel yang mengalami hambatan proliferasi tidak berserabut yang diamati menggunakan mikroskop inverted. Objek dalam penelitian ini adalah biakan sel kanker lidah manusia (SP-C1) yang mengalami hambatan proliferasi. Bahan penelitian adalah Biakan sel kanker lidah manusia (sel SP-C1), ekstrak etanol daun binahong, media Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), Foetal Bovine Serum (FBS) 10%, Phosphat Buffer Saline (PBS), Stop Solution Powder, distilotid water, tripsin EDTA 0,25%, larutan MTT Assay, penisilin-stretomicin, fungizon 1%, dimethylsulphoxide (DMSO), aquadest dan etanol 70%. Alat penelitian berupa almari pengering, tabung dan corong buchner, plate 96 well, neraca digital, stirrer digital, tabung dan vacuum evaporator, mikroskop inverted, mikroskop cahaya, tabung eppendorf, mikropipet, water bath, flasks dan ELISA reader. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Penelitian Pengujian Terpadu (LPPT) Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. Daun binahong diperoleh di jalan Wates km. 9. Determinasi daun binahong dilakukan pengumpulan dan penentuan jenis daun binahong yang akan diekstraksi. Ekstraksi adalah pemisahan satu atau beberapa bahan dari suatu padatan atau cairan. Pembuatan ekstrak etanol daun binahong: daun dicuci menggunakan air mengalir, kemudian dikeringkan menggunakan almari pengering pada suhu 45 o C selama 48 jam. Daun binahong yang sudah kering dijadikan serbuk. Pembuatan ekstrak etanol daun binahong menggunakan cara maserasi yaitu dengan merendam 129,17 gram serbuk simplisia daun binahong dalam 700 ml etanol 70% selama 24 jam, kemudian dilakukan penyaringan sebanyak 2 kali menggunakan kertas saring, tabung dan corong Buchner, setelah itu dilakukan pemisahan zat aktif daun binahong dan etanol 70% menggunakan tabung dan vacuum evaporator dengan suhu 60 o C, kemudian diuap menggunakan water bath hingga

5 ekstrak menjadi kental. Kemudian dibuat stok 50 mg dan diencerkan menjadi konsentrasi 50, 100, 200, 300, 400, 500. Pembiakan sel kanker lidah manusia (sel SP-C1) menggunakan median Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM). Sel sebanyak /well dimasukkan ke dalam plate 96 well, kemudian diberi berbagai konsentrasi dan diinkunbasi selama 24 jam. Sel yang telah diinkubasi kemudian diberi larutan MTT assay dan diinkubasi selama 24 jam, setelah itu sel dibaca menggunakan ELISA reader dengan panjang gelombang 550 nm. Data hasil penelitian diuji normalitas menggunakan saphiro-wilk, jika datanya normal dilakukan uji oneway ANOVA untuk mengetahui nilai signifikan antara variabel pengaruh dan terpengaruh. Selanjutnya untuk mengetahui signifikansi perbedaan rerata antara tiap kelompok variabel pengaruh terhadap variabel terpengaruh dilakukan uji LSD. HASIL Hasil penelitian mengenai potensi daya hambat proliferasi ekstrak etanol daun binahong (Anredera cordifolia (Tenore) Steenis) terhadap sel kanker lidah manusia (sel SP- C1) dilakukan dengan mengamati morfologi sel antara sel kanker hidup dan mati dibawah mikroskop cahaya dan dibaca menggunakan ELISA reader (BioRad Microplate reader dengan panjang gelombang 550nm). Pemberian ektrak etanol daun binahong pada sel kanker lidah manusia menunjukkan adanya penurunan jumlah sel. Hambatan proliferasi mulai terlihat pada konsentrasi 50 dan terus meningkat hingga konsentrasi 400. Perbandingan antara jumlah sel pada kontrol sel dan konsentrasi 400 dapat dilihat pada gambar 1. A dan Gambar 1. B.

6 Gambar 1. A Gambar 1. B Gambar 1. A. kontrol sel. Gambar 1. B. konsentrasi 400. Pada Gambar 1 A, terlihat banyaknya sel yang masih berserabut menandakan banyaknya sel yang masih hidup. Pada konsentrasi 400 terlihat banyaknya sel yang mengalami hambatan proliferasi. Rerata, simpangan baku dan presentase hambatan proliferasi sel kanker pada lidah manusia (sel SP-C1) dapat dilihat pada tabel 1. Tabel 1. Rerata, simpangan baku dan presentase hambatan proliferasi sel kanker pada lidah manusia (sel SP-C1) setelah perlakuan dengan ekstrak etanol daun binahong (Anredera cordifolia (Tenore) Steenis). Konsentrasi Rata-rata & Std. Deviasi Presentase hambatan proliferasi (%) kontrol ± πg/ml ± πg/ml ± πg/ml ± πg/ml ± πg/ml ± πg/ml ± Pada tabel 1 dapat dilihat bahwa hambatan proliferasi yang paling poten adalah pada konsentrasi 400 yaitu mampu menghambat proliferasi sebesar 74,72% dan mengalami penurunan pada konsentrasi 500 yaitu menghambat proliferasi sebesar 71.11%. Hal ini disebabkan karena sel mengalami kejenuhan pada konsentrasi 500 πg/ml. Grafik presentase kematian sel dapat dilihat pada gambar 2.

7 Presentasi kematian sel (%) Presentasi kematian sel Gambar 2. Grafik presentase jumlah kematian sel (%) Analisis statistik potensi daya hambat proliferasi ekstrak etanol daun binahong (Anredera cordifolia (Tenore) Steenis) terhadap sel kanker lidah manusia dimulai dengan uji normalitas menggunakan Saphiro-wilk. Hasil uji normalitas dapat dilihat pada tabel 2. Table 2. Hasil tes uji normalitas Saphiro-Wilk dari berbagai konsentrasi Konsentrasi Statistic Df Signifikan Control Hasil data uji normalitas pada tabel 2 menunjukkan bahwa data terdistribusi normal karena memiliki signifikan lebih dari 0,05 ( P>0,05). Selanjutnya dilakukan uji oneway ANOVA untuk mengetahui perbedaan bermakna antara variabel pengaruh dan variabel terpengaruh. Hasil uji oneway ANOVA dapat dilihat pada tabel 3. Tabel 3. Hasil Uji Anova Satu Jalur Proliferasi Sum of Squares DF Mean Square F Sig. Antar Kelompok Dalam Kelompok Total

8 Hasil uji Anova satu jalur pada tabel 3 menunjukkan bahwa nilai signifikansi P=0,000. Hal tersebut menunjukkan bahwa nilai signifikansi kurang dari 0,05 (P<0,05) sehingga dapat disimpulkan bahwa terdapat perbedaan yang bermakna. Selanjutnya untuk mengetahui signifikansi perbedaan rerata antara masing-masing konsentrasi ekstrak etanol daun binahong (Anredera cordifolia (Tenore) Steenis) dilakukan uji statistik LSD (Least Significant Different). Hasil uji statistik LSD dapat dilihat pada Tabel 4. Table 4. Hasil Uji Statistik LSD Kelompok Control *.000 *.000 *.000 *.000 * *.000 *.000 *.000 * * *.000 *.000 *.000 * *.000 *.000 * *.004 * *.000 *.000 * *.000 *.000 *.001 * *.000 *.000 *.004 * Hasil uji LSD pada tabel 4 memperlihatkan adanya tanda (*) dibelakang angka berarti terdapat perbedaan rata-rata antara masing-masing konsentrasi ekstrak etanol daun binahong, jika nilai signifikansi menunjukkan p<0.05. DISKUSI Kanker rongga mulut merupakan suatu pertumbuhan sel kanker pada rongga mulut yang meliputi bibir dan mukosa bibir, lidah, palatum, gingival, dasar mulut dan mukosa pipi. Sebagian besar kanker mulut dimulai di lidah dan dasar mulut. Hampir semua kanker mulut berasal dari sel epitel skuamosa. 2 Tanaman Binahong merupakan tanaman obat potensial yang dapat mengatasi berbagai penyakit. Hampir semua bagian dari tanaman binahong dapat dimanfaatkan sebagai terapi herbal seperti batang, akar, bunga, dan daun. 13 Tanaman binahong mengandung zat

9 antikanker yaitu saponin triterpenoid, alkaloid, polifenol dan asam fenolat. 9 Di dalam polifenol terdapat kandungan flavonoids yang bersifat sebagai antioksidan yang dapat menurunkan resiko penyakit kronis termasuk kanker dengan target chemopreventif. 10 Senyawa flavonoid dapat menghambat proliferasi melalui inhibisi proses oksidatif yang dapat menyebabkan inisiasi kanker. Mekanisme ini terjadi karena adanya penurunan enzim xanthin oksidase, siklooksigenase (COX) dan lipooksigenase (LOX) yang diperlukan dalam proses prooksidasi sehingga menunda siklus sel. 11 Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun binahong (Anredera cordifolia (Tenore) Steenis) memiliki potensi daya hambat proliferasi sel kanker lidah manusia (sel SP-C1) yang dilihat dari penurunan jumlah sel yang hidup. Pada konsentrasi terkecil yaitu 50, ekstrak etanol daun binahong mampu menghambat proliferasi sel SP- C1 sebesar 18,29% dan terus meningkat hingga konsentrasi ,72%. Pada konsentrasi 500 terjadi penurunan daya hambat menjadi 71,11%. Konsentrasi ekstrak etanol daun binahong (Anredera cordifolia (Tenore) Steenis) yang paling efektif adalah konsentrasi 400 dan mengalami kejenuhan pada konsentrasi 500. Kecepatan reaksi akan bertambah tinggi seiring meningkatnya konsentrasi substrat, sehingga tercapai suatu keadaan yang enzimnya mengalami penjenuhan oleh substrat. Substrat yag berinteraksi dengan semua enzim dalam sel dikatakan penjenuhan, tetapi reaksi tersebut masih berjalan lambat menuju target menyebabkan terjadinya perubahan metabolik di dalam sel. 14 Hambatan pertumbuhan sel dalam penelitian ini disebabkan adanya hambatan siklus sel pada sel kanker lidah manusia (sel SP-C1). Hambatan siklus sel dipengaruhi oleh protein antara lain cyclin, cyclin dependent kinase (CDK) dan CDK inhibitor. CDK berperan mengatur siklus sel melalui fosforilasi protein. CDK diaktifkan oleh cyclin sehingga terjadi ikatan yang membentuk kompleks CDK-cyclin yang akan mengontrol siklus sel tersebut. 15 Setiap cyclin disintesis pada akhir fase siklus sel. Cyclin E disintesis pada akhir fase G1 dan

10 awal fase S, cyclin A disintesis pada fase S dan G2, dan cyclin B disintesis pada fase G2 dan M. Perpindahan antara tahapan fase dimungkinkan jika sintesis cyclin telah terjadi. Regulasi siklus sel dipengaruhi juga oleh faktor penghambat yaitu CDK inhibitor (CKIs). CDK inhibitor mempunyai fungsi menghambat aktivitas CDKs. Protein yang bersifat sebagai CKIs yang menghambat multiple antara lain p21 dan p27, sedangkan yang spesifik adalah p15, p16, p18 dan p Hasil penelitian yang telah dilakukan memperlihatkan bahwa Ekstrak etanol daun binahong (Anredera cordifolia (Tenore) Steenis) memiliki potensi daya proliferasi sel kanker lidah manusia (Sel SP-C1). Sesuai hipotesis yang dikemukakan bahwa ekstrak etanol daun binahong (Anredera cordifolia (Tenore) Steenis) dapat menghambat proliferasi sel kanker lidah manusia (Sel SP-C1). KESIMPULAN Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa ekstrak etanol daun binahong (Anredera cordifolia (Tenore) Steenis) dapat menghambat proliferasi sel kanker lidah manusia (Sel SP-C1). Potensi daya hambat yang paling efektif adalah konsentrasi 400. SARAN 1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut menggunakan ekstrak etanol daun binahong (Anredera cordifolia (Tenore) Steenis) terhadap sel kanker lidah manusia (sel SP-C1) secara in vivo. 2. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut menggunakan bahan herbal lainnya pada sel kanker lidah manusia (sel SP-C1). 3. Perlu dilakukan penelitian menggunakan ekstrak etanol daun binahong (Anredera cordifolia (Tenore) Steenis) pada sel kanker lainnya.

11 DAFTAR PUSTAKA 1. Damayanthi, E,. Kustiyah, L., Kardinah, Roosita, K. (2011). Efektivitas Jus Tomat dan Minuman Bekatul terhadap Pengecilan Ukuran Lesi Kista Payudara. Indonesian Journal of Cancer, 5(1). h Sudiono, J. (2008). Pemeriksaan Patologi Diagnosis Neoplasma Mulut. Jakarta: EGC. 3. Bello, I., Soini, Y., Salo, T. (2010). Prognostic evaluation of oral tongue cancer: Means, Markers and perspectives. Elsevier. h Bockelman, C., Hagstrom, J., Makinen, L., Santti, Hayry, V., Lundin, J., Atula., Ristimaki., Haglund. (2011). High CIP2A immunoreactivity is an independent prognostic indicator in early-stage tongue cancer. British Journal Of Cancer, (104). h Densen, Wan. (2011). Onkologi Klinik. Jakarta: Balai Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia 6. Supriatno., Yuletnawati., Widiasto. (2010). Effect of intratumoral injection of mutant type p27 KIP1 followed by in vivo electroporation on radiotherapy-resistant human oral tongue cancer xenografts. Molecular Medicine Report. h Shim, SJ., Cha, J., Koom, WS., Kim, GE., Lee, CG., Choi, EC., Keum, KC. (2010). Clinical outcomes for T 1-2 N 0-1 oral tongue cancer patients underwent surgery with and without postoperative radiotherapy. Diakses tanggal 27 April Supriatno. (2007). Oligonukleotid S-Phase Kinase Associated Protein-2 (SKP2) Antisense Menginduksi Hambatan Proliferasi dan Peningkatan Aktivitas Apoptosis Pada Sel Kanker Leher dan Kepala. Kemajuan Terkini Riset. Yogyakarta: Universitas Gadjah Mada. h Ekaviantiwi., Fachriyah., Kusrini. (2013). Identifikasi Asam Fenolat Dari Ekstrak Etanol Daun Binahong (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis) dan Iji Aktivitas Antioksidan. Chem Info, 1 (1), h Meiyanto., Susidarti., Handayani., Rahmi. (2008). Ekstrak Etanolik Biji Buah Pinang (Areca catechu L.) mampu menghambat proliferasi dan memacu apoptosis sel MCF-7. Majalah Farmasi, 19 (1). h Ren, W., Qiao, Z., Wang, H., Zhu, L., Zhang, L. (2003). Flavonoids: Promising Anticancer Agent. Medicinal Research Review, 23(4). h Sukandar, E., Qowiyyah., Minah. (2010). Influence of ethanol extract of binahong (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis) leaves on renal failure rat model. Jurnal Medika Planta. 13. Ying, LY., Hernawan, I., Hendarti, H Inhibition effect of Binahong (Anredera Cordifolia (Ten.) Steenis) leaf extracttowards polybacteria of recurrent aphthous stomatitis. Oral Medicine Dental Journal, 3(2). h Murray RK, Granmer DK, Mayes PA, Rodwell VW. (2001). Harper s Biochemistry. Edisi 25. London: Prentice Hall International Inc. h King, R.J.B. (2000). Cancer Biology. Edisi 2. London: Pearson Eduation Limited. 16. Andrijono., Aziz, M.F., Saifuddin, A.B. (2006). Onkologi Ginekologi. Edisi 1. Cet. 1. Jakarta: Yayasan Bina Pustaka Sarwono Prawirohardjo.