Ekspresi LMP1 EBV pada keberhasilan terapi dan tiga tahun ketahanan hidup penderita karsinoma nasofaring

Transkripsi

1 Laporan Penelitian Ekspresi LMP1 EBV pada keberhasilan terapi dan tiga tahun ketahanan hidup penderita karsinoma nasofaring Bambang Hariwiyanto Bagian Ilmu Kesehatan Telinga Hidung Tenggorok Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada Rumah Sakit Dr. Sardjito Yogyakarta - Indonesia ABSTRAK Latar belakang: Karsinoma nasofaring (KNF) merupakan keganasan epitel kepala leher yang paling sering didapatkan. Virus Epstein Barr merupakan salah satu faktor penyebab KNF mengekspresikan beberapa protein, di antaranya latent membrane protein 1 (LMP1) yang mempunyai peran antiapoptosis, angiogenesis yang berpengaruh terhadap hasil terapi, kekambuhan, metastasis dan harapan hidup. Tujuan: Untuk mengetahui adanya perbedaan hasil terapi dan perbedaan ketahanan hidup tiga tahun antara penderita KNF yang mengekspresikan LMP1 dan yang tidak mengekspresikan LMP1 pascaterapi. Metode: Penelitian ini menggunakan nested case control, dilanjutkan dengan analisis ketahanan hidup selama tiga tahun (overall survival analysis) Kaplan Meier dan analisis perbedaan tiga tahun ketahanan hidup antara ekspresi LMP1 menggunakan tes log rank. Ekspresi LMP1 diperiksa secara imunohistokimia. Hasil: Terdapat perbedaan hasil terapi bermakna (p<0,001; OR 27,6), serta perbedaan ketahanan hidup tiga tahun bermakna (p=0,002) antara penderita KNF yang mengekspresikan LMP1 positif (>7,2) dengan penderita KNF yang mengekspresikan LMP1 negatif (<7,2), log rank sebesar 13,55. Kesimpulan: Ekspresi LMP1 dapat memprediksi keberhasilan terapi dan ketahanan hidup KNF. Kata kunci: karsinoma nasofaring, LMP1, terapi, ketahanan hidup ABSTRACT Background: Nasopharyngeal carcinoma (NPC) is the most frequent among head and neck malignancy. Epstein Barr virus (EBV) infection is one of the important cause of NPC, expressed some protein, one of them is LMP1. The roles of LMP1 are antiapoptosis and angiogenesis. Expression of LMP1 is able to influence the therapy result, recurrences, metastasis and survival rate. Purpose: To differentiate therapy result and three years survival rate between LMP1 1

2 positive expression and LMP1 negative expression in NPC post treatment. Methods: This research is using nested case control followed by overall survival analysis Kaplan Meier and log rank test statistical analysis. The LMP1 expression was measured by immunohistochemistry method. Results: There was a significant therapy result difference (p<0.001; OR 27.6) and significant three years survival rate (p=0.002) difference between LMP1 positive expression (>7.2) compared to LMP1 negative expression (<7.2), the log rank test result was Conclusion: LMP1 expression can be used to predict the therapy result, recurrences, metastasis and survival rate. Key words: nasopharyngeal carcinoma, LMP1, therapy, survival rate Alamat korespondensi: Bambang Hariwiyanto, Bagian Ilmu Kesehatan THT FK UGM. Jl. Sekip Utara I, Yogyakarta. rska45@yahoo.com PENDAHULUAN Karsinoma nasofaring (KNF) merupakan keganasan epitelial yang di beberapa negara Asia, frekuensi kejadiannya cukup tinggi dibandingkan dengan keganasan lain di kepala leher, terutama pada pria. 1 KNF mempunyai perangai berbeda dibandingkan dengan keganasan pada kepala leher yang lain, karena sifatnya yang sangat invasif dan sangat mudah bermetastasis. 2-5 Epidemiologi KNF sangat unik, yaitu sangat jarang ditemukan di populasi dunia, tetapi banyak ditemukan di beberapa negara Asia Tenggara. Kekerapan kasus baru KNF di bagian Selatan Cina sebanyak kasus/ penduduk per tahun, sedangkan di Indonesia 5,68 kasus/ penduduk per tahun. Perbandingan antara pria dan wanita sebesar 2-3:1, 80% pasien terdiagnosis pada umur tahun dan sudah pada stadium lanjut. 6,7 Stadium dini KNF gejalanya tidak khas, sehingga pasien datang berobat ke rumah sakit ketika sudah timbul benjolan di leher yang merupakan anak sebar dari tumor primernya. 6-8 Di Bagian THT RS Dr. Sardjito, Yogyakarta (antara bulan Januari 2004 sampai dengan bulan April 2005, didapatkan 108 kasus baru KNF dengan stadium III (23,15%) dan stadium IV (66,85%), dan tidak didapatkan penderita KNF dengan stadium I atau II. 8 2

3 Diagnosis KNF ditegakkan dengan pemeriksaan klinis, dilengkapi dengan pemeriksaan nasoendoskopi, CT scan nasofaring dan hasil pemeriksaan histopatologi yang merupakan baku emas. Untuk penegakan stadium KNF dilengkapi pemeriksaan USG abdomen dan bone survey. Protokol terapi KNF stadium III dan IV di RS Dr. Sardjito menggunakan protokol A atau B. Protokol A menggunakan kemoterapi dengan regimen 5-flurouracil dan cisplatinum sebanyak empat siklus, dilanjutkan radioterapi sebanyak 6500 cgy. 2 Pada protokol B dilakukan kemoterapi 5-flurouracil dan cisplatinum sebanyak tiga siklus dilanjutkan dengan radioterapi sebanyak 7000 cgy dan diakhiri dengan brachytherapi menggunakan Co-60 sebanyak 1200 cgy. 2 Infeksi Epstein Barr virus (EBV) merupakan salah satu penyebab terjadinya KNF, virus tersebut masuk ke dalam tubuh manusia, mengadakan replikasi di epitel orofaring dan dapat bersifat menetap (persisten), tersembunyi (laten) dan sepanjang masa (long life). 9,10 Pada KNF, EBV mengekspresikan beberapa protein yang salah satunya adalah latent membrane protein 1 (LMP1) yang merupakan protein membran integral, mengandung 386 asam amino, mempunyai struktur kompleks, mengandung enam transmembran domain yang menghubungkan domain terminal pendek N dengan terminal panjang C (cytoplasmic). Terminal panjang terdiri atas asam amino no.187 dan berakhir pada asam amino no.386. Salah satu asam amino tersebut berhubungan dengan nuclear factor kapa beta (NFķß) yang merupakan salah satu faktor transkripsi yang berperan pada terjadinya keganasan. Keberadaan dan peran NFķß di sitoplasma dikendalikan oleh protein inhibitor NFķß (Iķß). Gangguan pengendalian NFķß menyebabkan pelepasan NFķß ke dalam nukleus yang menjadi aktif dan menyebabkan terhalangnya proses apoptosis, sehingga dapat mempengaruhi hasil terapi, kekambuhan dan metastasis NFķß yang aktif dapat menyebabkan tumor resisten terhadap obat antitumor termasuk radioterapi dengan cara mengaktifkan protein inhibitor apoptosis (IAPs). 14 Tujuan penelitian ini adalah menganalisis perbedaan hasil terapi, serta ketahanan hidup tiga tahun (3 years 3

4 overall survival analysis) dan adanya perbedaan ketahanan hidup tiga tahun antara KNF yang mengekspresikan LMP1 dengan KNF yang tidak mengekspresikan LMP1 pascaterapi lengkap. METODE Metode penelitian ini adalah nested case control, dengan analisis perbedaan hasil terapi terhadap ekspresi LMP1 menggunakan tes Chi square. Penelitian ini dilanjutkan dengan analisis kesintasan ketahanan hidup (overall survival analysis) Kaplan Meier terhadap penderita KNF selama tiga tahun pascaterapi lengkap dan tepat waktu, dengan tanggal dan waktu hasil terapi ditegakkan sebagai titik nol (zero point). Analisis perbedaan ketahanan hidup tiga tahun terhadap ekspresi LMP1 menggunakan tes log rank. Penelitian dilakukan di Bagian THT RS Dr. Sardjito, sejak bulan Januari 2004 sampai dengan Desember Pengumpulan sampel secara berurutan (consecutive sampling) terhadap sampel yang memenuhi kriteria inklusi yang salah satu di antaranya adalah: 1) alamat penderita jelas dan mudah dihubungi; 2) jenis histopatologi KNF adalah WHO tipe II atau III, stadium III atau IV tanpa metastasis jauh; 3) telah menjalani terapi yang sesuai dengan protokol terapi, baik protokol A maupun protokol B; 4) selama penelitian penderita melakukan kontrol sesuai dengan jadwal. Semua jaringan biopsi penderita KNF calon sampel disimpan di laboratorium Patologi Anatomi (PA) sejak tahun 2003 dan diperiksa ekspresi LMP1nya menggunakan imunohistokimia, sebelum penelitian ini dimulai (nested). Evaluasi hasil terapi dilakukan 8 12 minggu pascaterapi. Penderita dinyatakan sembuh apabila: 1) hasil pemeriksaan CT scan tidak didapatkan penambahan volume tumor dan metastasis; 2) ada pemeriksaan nasoendoskopi tidak didapatkan masa yang ulseratif, ireguler; 3) hasil biopsi dinyatakan negatif. Selanjutnya penderita dievaluasi saat kontrol di poliklinik THT atau kunjungan rumah setiap 3 6 bulan pascaterapi, dicatat keadaan penderita sudah meninggal atau masih hidup. Pemeriksaan ekspresi LMP1 jaringan biopsi penderita KNF sebelum terapi, dilakukan secara imunohistokimia menggunakan antibodi monoklonal CS1-4

5 4 yang diproduksi oleh Novocastra. Pembacaan hasil imunohistokimia menggunakan mikroskop Olympus seri BX41 pembesaran 200x dan dilakukan uji kesepakatan (tes kappa) oleh dua orang ahli PA di Bagian Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran (FK) UGM. Ekspresi LMP1 dihitung secara kuantitatif dengan skoring, berdasarkan jumlah dan intensitas warna protein yang terekspresi di setiap lapangan pandang. Ekspresi LMP1 dikatakan positif (+) apabila tampak granula berwarna coklat pada membran sel. Penilaian ekspresi LMP1 adalah: 1) skor (0) bila ekspresi LMP1<1%; 2) skor (+) bila ekspresi LMP1 antara 1-25%; 3) skor (++) bila ekspresi LMP1 antara 26-50%; skor (+++) bila ekspresi LMP1 antara 51-75%; dan ekspresi LMP1 (++++) bila ekspresi LMP %. Intensitas warna protein dinilai dengan; 1) skor 1 bila warna kuning muda (lemah); 2) skor 2 bila warna kuning kecoklatan (sedang); dan skor 3 bila warna coklat (kuat). Bila intensitas warna pada lapangan pandang heterogen, skor setiap ekspresi LMP1 pada setiap intensitas warna dihitung secara independen, kemudian dijumlahkan. 15 HASIL Didapatkan 56 orang penderita KNF yang memenuhi kriteria inklusi, terdiri atas 28 orang dengan respons terapi positif (sembuh) dan 28 orang dengan respons terapi negatif (tidak sembuh). Secara imunohistokimia didapatkan hasil pemeriksaan ekspresi LMP1 terendah sebesar 3,0 dan tertinggi sebesar 11,6 dengan tes kappa didapatkan hasil sebesar 0,63-0,81. Titik potong (cut off point) antara ekspresi LMP1 (+) dan (-) ditentukan dengan recevier operator curve (ROC), dan didapatkan angka 7,2 yang berarti ekspresi LMP1<7,2 dianggap (-), sedangkan ekspresi LMP1>7,2 dianggap (+). Dari 56 sampel, didapatkan 29 orang penderita KNF dengan ekspresi LMP1<7,2 (-) dan 27 orang penderita KNF (+), yaitu ekspresi LMP1>7,2. Karakteristik sampel dapat dilihat pada tabel 1. Tabel 1. Karakteristik sampel 5

6 Respons terapi (+) Respons terapi (-) p Usia , > Jenis kelamin Laki-laki ,55 Perempuan 7 9 Stadium III ,55 IVA 3 3 IVB 9 11 PA WHO II - 2 0,30 WHO III Terapi Protokol A ,26 Protokol B p>0,05 Homogenitas sampel dapat dilihat jenis kelamin, stadium histopatologi dan pada tabel 1, tidak terdapat perbedaan protokol terapi. bermakna pada respons terapi antar-usia,. Tabel 2. Analisis bivariabel ekspresi LMP1 terhadap respons terapi Respons terapi (+) % Respons terapi (-) % OR p LMP1>7,2 (+) 4 (14,3 %) 23 (82,1 %) 27,60 <0,001 LMP1<7,2 ( ) 24 (85,7 %) 5 (17,9 %) 6

7 Hasil analisis bivariabel antarekspresi LMP1 terhadap respons terapi dapat dilihat pada tabel 2, menunjukkan bahwa terdapat perbedaan bermakna respons terapi antara KNF yang mengekspresikan LMP1>7,2 dengan KNF yang mengekspresikan LMP1<7,2 (p<0,001; OR 27,6). 1.0 log rank = 13,55; p = 0,002.9 Angka Ketahanan Hidup LMP 1 < 7.2 = 3 < 7.2-censored = 26 >= 7.2 = >= 7.2-censored = 11 Follow-up (bulan) Gambar 1. Kurve perbedaan ketahanan hidup tiga tahun antara ekspresi LMP1(+) dan LMP1(-) Hasil analisis ketahanan hidup tiga tahun penderita KNF pascaterapi adalah: penderita KNF dengan ekspresi LMP1<7,2 (-), ketahanan hidupnya selama tiga tahun sebesar 85%, sedangkan panderita KNF dengan ekspresi LMP1>7,2 (+), ketahanan hidup selama tiga tahun sebesar 30%, dengan p=0,002 dengan tes log rank 13,55 (lihat gambar 1). DISKUSI Didapatkan hasil penderita KNF dengan ekspresi LMP1>7,2 (+) mempunyai risiko kegagalan terapi sebanyak 27,6 kali lebih besar dibandingkan dengan penderita KNF yang mengekspresikan LMP1<7,2 (-) dengan p<0,001. Hasil ini sesuai teori yang menyatakan bahwa LMP1 dapat mengaktifkan NFkβ yang menyebabkan terhalangnya proses apoptosis dan aktifnya inhibitor apoptosis (IAPs), sehingga tumor resisten terhadap obat antitumor termasuk radioterapi dan 7

8 kemoterapi, LMP1 juga menyebabkan kenaikan enzim COX-2 yang menyebabkan tumor mudah mengalami metastasis yang berakibat penurunan ketahanan hidup penderita KNF Penelitian ini menunjukkan bahwa KNF dengan ekspresi LMP1>7,2 (+) mempunyai risiko meninggal dunia dalam kurun waktu tiga tahun pascaterapi sebesar 13,55 kali dibandingkan dengan penderita KNF dengan ekspresi LMP1<7,2 (-), sedangkan Hariwiyanto pada penelitiannya tentang pengaruh LMP1 terhadap ketahanan hidup dua tahun KNF pascaterapi didapatkan hasil log rank sebesar 9,79 dan p=0,002. Hasil ini menunjukkan bahwa semakin lama durasi pengamatannya, semakin banyak penderita yang mempunyai kemungkinan meninggal dunia. 16 Kesimpulan hasil penelitian ini pada penderita KNF dengan ekspresi LMP1>7,2 (+) mempunyai risiko kegagalan terapi sebesar 27,6 kali lebih besar dibandingkan dengan KNF dengan ekspresi LMP1<7,2 (-) dengan p<0,001, serta LMP1>7,2 (+) menyebabkan penurunan ketahanan hidup selama tiga tahun sebesar 13,55 kali dibandingkan penderita KNF dengan ekspresi LMP1<7,2 (-). Sesuai dengan hasil penelitian ini, untuk memprediksikan keberhasilan terapi dan ketahanan hidup KNF, perlu disarankan untuk memeriksa ekspresi LMP1 secara rutin. Untuk lebih menyempurnakan hasil penelitian ini, perlu dilakukan penelitian analisis kesintasan harapan hidup dengan durasi yang lebih lama, yaitu lima tahun. UCAPAN TERIMA KASIH Kepada dr. Haryadi, Sp.PA yang telah membantu pada pengumpulan, penyimpanan, pengecatan, serta penilaian ekspresi LMP1 secara imunohistokimia. DAFTAR PUSTAKA 1. Patmanathan R. Can NPC be prevented? UICC Workshop on Nasopharyngeal Cancer. Issue and Challenge. Singapore Cancer Society, July Liu MT, Hsieh CY, Chang TH, Lin JP, Huang CC, Wang AJ. Prognostic factors affecting the outcome of nasopharyngeal carcinoma. Jpn J Clin Oncol 2003; 2(10): Jian-guo T, Xuan I, Ping C. Expression of matrix metalloproteinase-9 in nasopharyngeal carcinoma and associated with Epstein Barr virus 8

9 infection. J Zheij Univ Sci 2004; 5(10): Ma J, Liu L, Tang L, Zong J, Lin A, Lu T, et al. Retropharyngeal lymphnode metastasis in nasopharyngeal carcinoma: prognostic value and staging categories. Clin Cancer Res 2007; 13(5): Tang L, Li L, Mao Y, Liu L, Liang S, Chen J, et al. Retropharyngeal lymphnode metastasis in nasopharyngeal carcinoma detected by magnetic resonance imaging: prognostic value and staging categories. Cancer 2008; 113: Jia WH, Shao JY, Feng BJ, Zeng YX. Genetic component involved in nasopharyngeal carcinoma development. In: Bishop J, Huang P, Johnson JST, Koo KC, eds. Cancer reviews Asia Pacific. Singapore: World Scientific; p Chien YC, Chen CJ. Epidemiology and etiology of nasopharyngeal carcinoma: gene environment interaction. In: Bishop J, Huang P, Johnson JST, Koo ST, eds. Cancer reviews. Singapore: World Scientific; p Harowi K, Hariwiyanto B, Erlangga EG. The management of nasopharyngeal carcinoma at Sardjito hospital of Yogyakarta. Free Paper. The 11 th Asean ORL-HNS Congress Bali Kempkes B, Strobl LJ, Bornkamm GW, Zimer-Strobl U. EBNA2 and notch signaling. Epstein Barr virus. In: Robertson ES, ed. Epstein Barr virus. Norfolk England: Caister Academic Press; p Kutok JL, Wang E. Spectrum of Epstein Barr virus associated disease. Ann Rev Pathol Mechanism Dis 2006; 1: Iwatsuki K, Yamamoto T, Tsuji K, Suzuki D, Fuji K, Matzuhara H, et al. A spectrum of clinical manifestation caused by host immune responses againt Epstein Barr virus infection. Acta Med Okayama 2004; 58(4): Li M, Zhuang ZH, Wang Q, Pang JCS, Wong HI. Epstein Barr virus latent membrane protein-1 (LMP1) upregulates Id1 expression in nasopharyngeal carcinoma. Oncogene 2004; 23: Weinberg RA. Cytoplasmic signaling circuity programs many thraits of cancer. In: Masson S, Grose A, eds. The biology of cancer. New York: Garland Science; p Uzzo RB, Cairns P, Dulin N, Horwitz EM, Pollack A, Kolenko V. Tumor resistance to apoptosis. In: Funke JH, Bukowski N, eds. Cancer immunotherapy at the cross roads. New Jersey: Humana Press Inc; p Khabir A, Karray H, Rodriques S, Rose M, Dauod J, Frikha M. EBV latent membrane protein-1, abundand 9

10 correlates with patient age, but not with patient behavior in North African nasopharyngeal carcinoma. Virology 2005; 2: Hariwiyanto B. Peran protein EBNA1, EBNA2, LMP1 dan LMP2 virus Epstein Barr sebagai faktor prognosis pengobatan nasofaring. Disertasi.Yogyakarta: Program Doktor Ilmu Kedokteran dan Kesehatan Fakultas Kedokteran UGM;