Lampiran 1. Tahap Melakukan Desain Primer3 Bakteri B.subtilis

Transkripsi

1 LAMPIRAN

2 80 Lampiran 1. Tahap Melakukan Desain Primer3 Bakteri B.subtilis 1. Diinput 3 sekuen gen endoglukonase dari bakteri Bacillus subtilis a. Dibuka program NCBI pada database dipilih Protein b. Diinput sekuen Endoglucanase (Bacillus subtilis) pada kolom search, lalu klik search

3 81 c. Dipilih 3 strain berbeda pada sekuen bakteri Bacillus subtilis dengan ukuran asam amino yang sama d. Klik sekuen tersebut, lalu pada kolom GenPept dipilih FASTA (text), klik Apply e. Setelah itu, dicopy sekuen tersebut ke dalam aplikasi Notepad, klik File lalu klik Save as. Beri nama file tersebut, ex: Endoglucanase_Bacillus subtilis 1 f. Lakukan hal yang sama pada poin c-e pada 2 sekuen bakteri lainnya.

4 82 2. Dilakukan alignment pada 3 sekuen endoglukonase menggunakan software BioEdit a. Dipilih 3 susunan basa protein endoglukonase (Bacillus subtilis) dengan strain berbeda. Klik File, lalu Open. Setelah itu, cara untuk membuka 2 sekuen bakteri lainnya yaitu klik File lalu dipilih Import. Kemudian klik Sequence Alignment pilih Open b. Tampilan 3 sekuen basa protein pada software BioEdit c. Setelah itu, klik menu Accessory Aplication, dipilih ClustalW Multiple Alignment, klik Run ClustalW, klik OK.

5 83 d. Klik Alignment pada menu bar, lalu klik Create Consensus Sequence untuk membuat consensus e. Setelah consensus didapatkan, maka kemudian ubah mode dengan cara pilih Edit, lalu isi susunan basa protein yang kosong dengan cara diinput kode basa. f. Kode basa yang diinput, dipilih berdasarkan kesamaan kode basa dari 1 pasangan basa protein. g. Diisi basa protein yang kosong hingga penuh, kemudian simpan ke Notepad.

6 84 h. Klik Select/Slide pada kolom Mode. Lalu klik basa yang paling pertama. Dipilih Edit pada menu bar, lalu klik Select to End i. Dicopy consensus dengan cara klik Ctrl+A, paste di Notepad. Save consensus tersebut. Beri nama file tersebut Consensus 3. Ditranslate consensus Bakteri Bacillus subtilis a. Dibuka program EBI (Emboss) b. Dipilih Launch Backtranseq

7 85 c. Diinput sequence dengan cara pilih Choose File, klik data consensus, lalu klik Open d. Select Parameters dengan cara ubah codon usage dengan parameter Bacillus subtilis, klik Submit e. Disave hasil translate ke dalam aplikasi Notepad dan beri nama file tersebut Translation 3. Didapatkan Primer yang dibutuhkan dengan membuka program NCBI. a. Dibuka program BLAST ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/, pada kolom PCR Templates klik Choose File, dipilih data translation lalu klik Open b. Disetting PCR product size (Min = 900, Max = 1497)

8 86 c. Diubah Database menjadi nr d. Diubah Organism menjadi bacteria (taxid:2) e. Klik Get Primers, software akan membaca primer yang dibutuhkan f. Setelah itu, muncul beberapa primer yang mungkin dapat digunakan. g. Dilakukan rekap data terlebih dahulu dengan cara dicopy seluruh Primer Pair ke dalam Aplikasi Microsoft Words. 4. Primer yang telah direkap lalu dihitung Temperature Melting (Tm). a. Dibuka link b. Diinput Primer Pair ke dalam situs tersebut dengan cara : diinput Forward ke dalam kolom Sequence No. 1 dan diinput Reverse ke dalam kolom Sequence No. 2.

9 c. Klik Calculate 87

10 d. Hasil Primer setelah di calculate menunjukkan bahwa pada Forward (Sec. Str. : None, Primer Dimer : No) dan Reverse (Sec. Str. : None, Primer Dimer : No), artinya primer ini dapat digunakan untuk pengaplikasian PCR 88

11 89 Lampiran 2. Tahap Melakukan Desain Primer Degenerate Bakteri B.thuringiensis 1. Diinput 3 sekuen gen endoglukonase dari bakteri Bacillus thuringiensis a. Dibuka link pada database dipilih Protein b. Diinput sekuen Endoglucanase (Bacillus thuringiensis) pada kolom search, lalu klik search. c. Dipilih 3 strain berbeda pada sekuen bakteri Bacillus thuringiensis dengan ukuran asam amino yang sama. d. Klik sekuen tersebut, lalu pada kolom GenPept dipilih FASTA (text), klik Apply

12 90 e. Setelah itu, copy sekuen tersebut ke dalam aplikasi Notepad, klik File lalu klik Save as. Beri nama file tersebut, ex: Endoglucanase_Bacillus thuringiensis 1 f. Dilakukan hal yang sama pada poin c-e pada 2 sekuen bakteri lainnya.

13 91 2. Dilakukan alignment pada 3 sekuen endoglukonase menggunakan software ClustalX a. Dibuka program ClustalX, klik File lalu dipilih Load Sequence b. Dipilih 3 sekuen bakteri yang telah diinput lalu pilih Open c. Dipilih Alignment lalu dipilih Do Complete Alignment Daerah Conserved :

14 92 d. Save hasil alignment sequence pada dengan cara dipilih File lalu pilih Save Sequence as. e. Save dalam 3 format diantaranya CLUSTAL, FASTA, dan NEXUS. Lalu klik Ok. f. Setelah itu, dilakukan desain primer degenerate pada program CODEHOP g. Dipilih Choose File, Open Sequence FASTA, lalu dipilih Submit.

15 93 h. Setelah itu, dipilih Primers dan klik CODEHOP i. Diganti codon usage tabel menjadi Bacillus thuringiensis lalu dipilih Look for primers

16 j. Dipilih Block yang paling atas untuk mendapatkan primer forward dan dipilih Complement of Block yang paling bawah untuk mendapatkan primer reverse. 94

17 95 k. Dilakukan rekap data dari primer yang telah didapatkan. Kode AA Penempelan Sequen Primer Lokasi Tm Forward IGLASFSNSSFAA 5'- Block 60.8 GAATTGGATTAGCATCTTTTTCTAATTCTwsnttygcngc- 3' x24798xbla Reverse WWKPIPDDKKTQ 5'-TGAGTTTTCTTATCATCTGGAACTggyttccacca-3' Complement of Block x24798xblh 61.9 l. Dibuka hasil multiple alignment format NEXUS, dicari daerah penempelan primer untuk forward dan reverse lalu ditandai. Hasil Multiple Sequence Alignment (MSA) Menggunakan Clustal X (tampilan didalam format.nxs) :

18 96 m. Setelah itu, dibuka program GENEIOUS untuk melihat ilustrasi penempelan primer. n. Dibuat file baru pada folder local dengan cara klik kanan pada forlder tersebut lalu dipilih New Folder. o. Diberi nama file tersebut dengan format Endoglukonase (Bacillus thuringiensis) p. Diinput translation dengan cara dipilih File, Import, From File. Dipilih translation lalu dipilih Import.

19 97 q. Setelah itu, diinput primer dengan cara dipilih Sequence, New Sequence, Copy Forward (Type : primer) lalu klik Ok. r. Dibuka program BioEdit untuk reverse complement (menyamakan arah baca dengan sekuen forward). s. Klik File lalu Open, dipilih sekuen reverse primer lalu klik Open. t. Dipilih Sequence pada menu bar lalu dipilih Nucleid Acid. Setelah itu, dipilih Reverse Complement.

20 98 u. Klik 1 basa paling awal, dipilih Edit lalu dipilih Select to End. v. Dicopy sekuen reverse tersebut ke dalam Notepad. Diberi nama dengan format Reverse Primer Complement w. Dilakukan hal yang sama pada poin q tetapi dilakukan untuk sekuen reverse. x. Setelah itu, klik ctrl pada translation, forward, reverse lalu klik Alignment, Ok y. Dibuka Alignment View dan Text View untuk melihat penempelan primer degenerate.

21 99 Visualisasi Penempelan Primer pada Alignment View Menggunakan Program Geneious : Berdasarkan analisis geneious, maka estimasi produk PCR yang akan didapatkan sebesar ±1250 bp Penempelan Primer pada View Text Menggunakan Program Geneious : EMBOSS_001 ATGAATGGCAAAAGAAAAATTTTTACATGCATTTCAATTGTTGGCATTGGCCTGGCATCA Forward GAATTGGATTAGCATCT Reverse EMBOSS_001 TTTTCAAATTCATCATTTGCAGCATCAGTTACAGATAATTCAATTCAAAATTCAATTCCG Forward TTTTCTAATTCTWSNTTYGCNGC Reverse EMBOSS_001 ATTGTTAATCAACAAGTTGCAGCAGCAAAAGAAATGAAACCGTTTCCGCAACAAGTTAAT Forward Reverse EMBOSS_001 TATGCAGGCGTTATTAAACCGAATCATGTTACACAAGAATCACTGAATGCATCAGTTAGA Forward Reverse EMBOSS_001 TCATATTATGATAATTGGAAAAAAAAATATCTGAAAAATGATCTGTCATCACTGCCGGGC Forward Reverse EMBOSS_001 GGCTATTATGTTAAAGGCGAAATTACAGGCGATGCAGATGGCTTTAAACCGCTGGGCACA Forward Reverse EMBOSS_001 TCAGAAGGCCAAGGCTATGGCATGATTATTACAGTTCTGATGGCAGGCTATGATTCAAAT

22 100 Forward Reverse EMBOSS_001 GCACAAAAAATTTATGATGGCCTGTTTAAAACAGCAAGAACATTTAAATCATCACAAAAT Forward Reverse EMBOSS_001 CCGAATCTGATGGGCTGGGTTGTTGCAGATTCAAAAAAAGCACAAGGCCATTTTGATTCA Forward Reverse EMBOSS_001 GCAACAGATGGCGATCTGGATATTGCATATTCACTGCTGCTGGCACATAAACAATGGGGC Forward Reverse EMBOSS_001 TCAAATGGCACAGTTAATTATCTGAAAGAAGCACAAGATATGATTACAAAAGGCATTAAA Forward Reverse EMBOSS_001 GCATCAAATGTTACAAATAATAATAGACTGAATCTGGGCGATTGGGATTCAAAATCATCA Forward Reverse EMBOSS_001 CTGGATACAAGACCGTCAGATTGGATGATGTCACATCTGAGAGCATTTTATGAATTTACA Forward Reverse EMBOSS_001 GGCGATAAAACATGGCTGACAGTTATTAATAATCTGTATGATGTTTATACACAATTTTCA Forward Reverse EMBOSS_001 AATAAATATTCACCGAATACAGGCCTGATTTCAGATTTTGTTGTTAAAAATCCGCCGCAA Forward Reverse EMBOSS_001 CCGGCACCGAAAGATTTTCTGGATGAATCAGAATATACAAATGCATATTATTATAATGCA Forward Reverse EMBOSS_001 TCAAGAGTTCCGCTGAGAATTGTTATGGATTATGCAATGTATGGCGAAAAAAGATCAAAA Forward Reverse EMBOSS_001 GTTATTTCAGATAAAGTTTCATCATGGATTCAAAATAAAACAAATGGCAATCCGTCAAAA Forward Reverse EMBOSS_001 ATTGTTGATGGCTATCAACTGAATGGCTCAAATATTGGCTCATATCCGACAGCAGTTTTT Forward Reverse EMBOSS_001 GTTTCACCGTTTATTGCAGCATCAATTACATCATCAAATAATCAAAAATGGGTTAATTCA Forward Reverse EMBOSS_001 GGCTGGGATTGGATGAAAAATAAAAGAGAATCATATTTTTCAGATTCATATAATCTGCTG

23 101 Forward Reverse EMBOSS_001 ACAATGCTGTTTATTACAGGCAATTGGTGGAAACCGGCACCGGATGATAAAAAAACACAA Forward Reverse TGGTGGAARCCAGTTCCAGATGATAAGAAAACTCA- EMBOSS_001 AATCAAATTAATGATGCAATTTATGAAGGCTATGATAAT Forward Reverse

24 102 Lampiran 3. Datasheet Oligonukleotida Primer Gen Endoglukanase Bakteri B.subtilis dan B.thuringiensis SynthID Oligo Name Sequence Len Scale F_BS 5 -TCA GCA GCA GGC ACA AAA nmole AC R_BS 5 -TTC GGT TCT GTG CCC CAA nmole AT F_BT 5'-GAA TTG GAT TAG CAT CTT TTT CTA ATT CTW SNT TYG CNG C-3' R_BT 5'-TGA GTT TTC TTA TCA TCT GGA ACT GGY TTC CAC CA-3' nmole nmole Tm GC To make ( 0 µg pmol C) (%) 100 µm add µl of dh2o add µl of dh2o add 281 µl of dh2o add 303 µl of dh2o

25 103 Lampiran 4. Alat-alat Peremajaan Biakan dan Kultur Padat Jarum Ose Analytical Balance Autoclave Bunsen Inkubator Cawan Petri Hot Plate Spatula Labu Erlenmeyer 250 ml Magnetic Stirrer Rak Tabung Reaksi Gelas Ukur 25 ml Tabung Reaksi Corong

26 104 Lampiran 5. Alat-alat Uji Aktivitas Selulolitik Autoclave Analytical Balance Jarum Ose Bunsen Inkubator Cawan Petri Hot Plate Spatula Labu Erlenmeyer 250 ml Magnetic Stirrer Jangka Sorong Gelas Ukur 25 ml

27 105 Lampiran 6. Alat-alat Kultur Cair dan Isolasi DNA Genom Rak Microtube Microtube Eppendorf 1,5 ml Sentrifuge Deep Freezer Waterbath Vortex Mikropipet Mikrotips Timer Tabung Reaksi Rak Tabung Reaksi Jarum Ose Incubator Shaker Bunsen Beaker Glass 250 ml

28 106 Lampiran 7. Alat-alat Amplifikasi Rak Microtube Microsentrifuge Deep Freezer Microtube PCR Mikropipet Mikrotips Putih Thermal Cycler

29 107 Lampiran 8. Alat-alat Elektroforesis Bejana Elektroforesis yang dilengkapi dengan power supply dan tangki penutup Analytical balance Botol schott 100 ml Ultraviolet Transilluminator Hot Plate dan Magnetic Stirrer Waterpass Rak Microtube Mikrotipst Putih Mikropipet Gelas Ukur 100 ml Sendok Pipih Digital Camera

30 108 Lampiran 9. Bahan-bahan Peremajaan Biakan dan Kultur Padat Nutrient Agar Air Laut Steril Isolat Bakteri Bacillus subtilis Parafilm Alkohol 70% Isolat Bakteri Bacillus thuringiensis Kain Kasa Plastik Kapas Alumunium Foil Kertas Label

31 109 Lampiran 10. Bahan-bahan Uji Aktivitas Selulolitik Nutrient Agar CMC (Carboxy Methyl Celullose) Red congo 0,1% Deionized water NaCl 1M Kertas Label Kain Kasa Plastik Kapas Alumunium Foil

32 110 Lampiran 11. Bahan-bahan Isolasi DNA Genom dan Kultur Cair Nuclei Lysis Solution 0,5M EDTA ph 8,0 Protein Precipitation Solution Isopropanol Ethanol 70% DNA Rehydration Solution RNase Solution Nutrient Broth Air Laut Steril

33 111 Lampiran 12. Bahan-bahan Amplifikasi PCR Bakteri Bacillus subtilis a b c Ket : (a) 2x KAPA2G Fast Ready Mix (b) Nuclease Free Water (NFW) (c) Primer F_BS dan Primer R_BS PCR Bakteri Bacillus thuringiensis Ket : (a) 2x KAPA2G Fast Ready Mix (b) Nuclease Free Water (NFW) (c) Primer F_BT dan Primer R_BT a b c

34 112 Lampiran 13. Bahan-bahan Elektroforesis Bubuk Agarose TBE Buffer 10X NFW Ethidium Bromide Loading Dye DNA Ladder 1 kb

35 113 Lampiran 14. Proses Peremajaan Biakan dan Kultur Padat Penimbangan NA Pada Analytical Balance Pencampuran NA Pada Erlenmeyer yang Berisi Air Laut Steril Medium NA + Air Laut Steril Dididihkan Pada Hot Plate Kultur Padat Disimpan Pada Inkubator Proses Streak Isolat Bakteri Pada Cawan Petri Proses Penuangan Medium NA + Air Laut Steril Pada Cawan Petri

36 114 Lampiran 15. Hasil Peremajaan Biakan dan Kultur Padat a. Agar Miring Isolat Bakteri Bacillus subtillis Isolat Bakteri Bacillus thuringiensis b. Agar Cawan Hasil Streak I Bacillus subtillis Hasil Streak II Bacillus subtillis Hasil Streak III Bacillus subtillis Hasil Streak I Bacillus thuringiensis Hasil Streak II Bacillus thuringiensis Hasil Streak III Bacillus thuringiensis

37 115 Lampiran 16. Hasil Pewarnaan Gram Bakteri a. Bakteri B.subtilis b. Bakteri B.thuringiensis

38 116 Lampiran 17. Proses Uji Aktivitas Selulolitik Penimbangan NA dan CMC Pada Analytical Balance Pencampuran NA dan CMC Pada Erlenmeyer yang telah terisi Air Laut Steril Proses Pendidihan Media NA + CMC + Air Laut Steril Congo Red Dimasukkan Ke Dalam Gelas Ukur Proses Inkubasi Media NA + CMC + Air Laut Steril Proses Streak Isolat Bakteri Pada Media NA + CMC + Air Laut Steril Pencampuran Congo Red dan Aquades Congo Red + Aquades Pada Dimasukkan Ke Dalam Botol Film Congo Red + Aquades Direndam Pada Medium CMC Pengukuran Indeks Selulolitik NaCl Hasil Perendaman dibuang NaCl 1 M Dimasukkan Ke Dalam Medium CMC

39 117 Lampiran 18. Bagan Alir Kultur Cair dan Isolasi DNA Genom a. Kultur Cair Penimbangan NB Pada Analytical Balance Pencampuran NB dan Air Laut Steril Proses Pendidihan Media NB + Air Laut Steril Pengambilan Koloni Tunggal Isolat Bakteri Penuangan Medium NB + Air Laut Steril Pada Tabung Reaksi Sterilisasi Medium NB + Air Laut Steril Balance Isolat Bakteri Dihomogenkan Pada Medium NB + Air Laut Steril Sentrifugasi Inkubasi Pada Incubator Shaker

40 118 b. Isolasi DNA Genom Hasil kultur cair disentrifugasi pada rpm selama 2 menit, buang supernatan Tambahkan Lysozyme 60µl dan lakukan pipet mix Tambah 100µl Protein Precipitation Solution, vortex 20 detik. Inkubasi on ice selama 5 menit Sentrifugasi rpm selama 3 menit Inkubasi sampel pada suhu 37 O C selama 45 menit Transfer supernatan ke tube baru Tambah 300µl Isopropanol, sentrifugasi rpm selama 2 menit Sentrifugasi selama 2 menit pada rpm Buang supernatan, tambahkan 300 µl Ethanol 70%, bolak-balik tube Sentrifugasi rpm selama 2 menit Tambah 300µl Nuclei Lysis Solution hingga tersuspensi lalu vortex Buang supernatan dengan hati-hati, keringkan diatas tissue selama 15 menit Tambah 50µl DNA Rehydration Solution untuk mencuci pellet Inkubasi sampel pada suhu 80 O C selama 5 menit, tabung dibolak-balik 2-5 kali, lalu dinginkan pada suhu ruang Inkubasi pada suhu 65 O C selama 60 menit Tambah 1,5µl RNase Solution, tabung dibolak-balik hingga tercampur. Inkubasi sampel pada suhu 37 O C selama 30 menit, dinginkan pada suhu ruang Simpan pellet pada suhu 4 o C selama satu malam, kemudian DNA hasil isolasi siap digunakan untuk tahap berikutnya

41 119 Lampiran 19. Penapisan Gen Endoglukanase Persiapan PCR dan PCR Master Mix Pembuatan Mix PCR Penapisan Gen Endoglukanase Memasukan Template DNA Distribusi Mix PCR

42 120 Lampiran 20. Bagan Alir Elektroforesis a. Pembuatan Gel Agarose Penimbangan 0,4 gr agarose Pemasukan agarose ke dalam botol schott Pengukuran 50 ml TBE 50X Pendinginan agar sampai hangat pada suhu ruang Pemanasan agar hingga larut dengan Hot Plate Pencampuran 50 ml TBE 50X dan agarose didalam botol schott Penuangan agar ke dalam cetakan yang telah dipasangi sisir Agar dibiarkan hingga mengeras Setelah gel mengeras, sisir dicabut dari gel, dan meletakkan gel sesuai dengan prosedur penggunaan bak elektroforesis Perendaman gel dengan TBE 50X

43 121 b. Loading Hasil Amplifikasi Penempatan dan pengurutan hasil amplifikasi pada cooler block dimulai dari marker dan sampel Pengambilan dan pemasukkan 4 µl dari masing-masing tube produk hasil PCR ke dalam setiap sumur Penutupan tangki dan kabel dihubungkan pada power supply Pengambilan dan pemasukkan 2 µl marker ke dalam sumur yang lainnya Pengaturan tegangan listrik antara 75 volt Elektroforesis dijalankan sekitar 60 menit sampai migrasi DNA mencapai 3 / 4 bagian sel c. Dokumentasi Gel dengan UV trans-illuminator Setelah proses running selesai, power supply dimatikan dan dicabut kabelnya Tutup tangki dibuka, dan pengangkatan cetakan gel Pemasukkan gel kedalam UV trans-illuminator Pendokumentasian gel Pengamatan gel diatas UV transilluminator

44 122 Lampiran 21. Analisis Hasil Sekuensing Gen Endoglukanase 1. Buka program BioEdit, kemudian buka file/ data yang akan diolah menggunakan perangkat BioEdit 2. Sorot (reverse) dilanjutkan dengan klik sekuen Nucleic acid Reverse complement

45 Sorot (forward dan reverse) Sequence Pairwise Alignment Align two sequence (allow end to slide) 4. Tampilan setelah dilakukan Pairwise Alignment

46 Sorot (forward dan reverse) Alignment Create concensus Sequence 6. Tampilan setelah dilakukan consensus

47 Klik basa pertama pada concensus Edit Select to end 8. Tampilan setelah consensus dilakukan select to end

48 Consensus di copy ke dalam notepad 10. Buka website http//ncbi.nlm.nih.gov pilih BLAST Nucleotide blast blastx Masukan urutan sekuen Pada database pilih non-redundant protein sequences (nr) Klik BLAST

49 127 Lampiran 22. Hasil Sekuensing Sampel B.1.2 Kromatogram Gen Endoglukanase Forward Kromatogram Gen Endoglukanase Reverse

50 Lampiran 23. Hasil BLAST Sampel B

51 129 Lampiran 24. Hasil Sekuensing Sampel C2 Kromatogram Gen Endoglukanase Forward Kromatogram Gen Endoglukanase Reverse

52 Lampiran 25. Hasil BLAST Sampel C2 130