MIKROSKOP Pertemuan ke-2 MIKROBIOLOGI Dasar

Transkripsi

1 MIKROSKOP Pertemuan ke-2 MIKROBIOLOGI Dasar

2 MIKROSKOP Mikroskop..mikros = kecil dan scope = tujuan, sasaran. Mikroskop adalah alat untuk melihat benda dan mikroba berukuran kecil Mikroskop ditemukan oleh Antony van Leeuwenhoek 1765 jauh sebelumnya sudah ada yang mengamati benda/objek berukuran kecil Roger Bacon ( ) pertama kali membuat lensa sederhana untuk melihat benda-benda berukuran kecil Zacharias Janssen membuat suatu sistem lensa ganda pertama kali pd 1590 Athanasius Kircher ( ) mengembangkan instrumen pembesaran pertama dan diduga telah melihat bakteri dengan alat tersebut Penemu bakteri pertama mungkin Pierre Borrel ( ), tetapi yang diakui adalah Leeuwenhoek

3 Mikroskop Van Leeuwenhoek

4 PerKembangan mikroskop

5 Bagian-Bagian Mikroskop

6 Jenis Jenis Mikroskop Mikroskop medan terang (bright-field) Mikroskop medan gelap (dark-field) Mikroskop fase-kontras Mikroskop ultraviolet Mikroskop Fluoresen Mikroskop Elektron

7 Mikroskop Medan Gelap Mikroskop yang digunakan untuk mengamati mikroba hidup yang tidak nampak bila menggunakan mikroskop medan terang, mikroba yang tidak dapat diwarnai dengan metode pewarnaan standar atau mikroba akan rusak oleh pewarnaan sehingga tidak bisa diidentifikasi Sebagai pengganti kondenser normal digunakan kondenser medan gelap (darkfield condenser) yang berisi piringan gelap (opaque disk). Piringan ini akan memblok sinar yang akan masuk lensa objectif secara langsung OKI, hanya sinar dipantulkan oleh spesimen (sampel) yang akan masuk lensa objektif. Akibat tidak ada sinar langsung pada latar belakang maka spesimen nampak bercahaya dan latar belakangnya gelap Mikroskop ini umum digunakan untuk mengamati selsel berukuran kecil seperti Treponema pallidum, penyebab sipilis

8 Mikroskop Fase-Kontras Mikroskop ini diciptakan oleh Fritz Zernike dan mendapat hadiah nobel 1953 Digunakan untuk mengamati mikroba hidup tanpa perlu fiksasi dan pewarnaan karena menyebabkan mikroba mati Pada mikroskop ini, sumber iluminasi berupa seberkas sinar yang datang melalui suatu cincin di dalam kondenser Pada lensa objektif dipasang cincin fase yang akan mengubah fase sinar yang melaluinya Sinar yang telah melewati sampel dan tidak dibelokkan akan menembus cincin fase dan terlihat oleh mata sebagai sinar putih Karena perbedaan indeks refraksi antara sel mikroba dengan medium disekelilingnya, maka bayangan dapat terlihat secara lebih kontras..objek/sampel terlihat gelap dengan latar belakang agak terang

9 Penampakan mikroba menggunakan mikroskop yang berbeda

10 Mikroskop Ultraviolet Mikroskop ini menggunakan sinar UV sebagai sumber cahaya Menghasilkan resolusi dan pembesaran yang lebih tinggi dibanding mikroskop biasa.karena sinar UV mempunyai panjang gelombang yang lebih pendek ( nm) Karena sinar UV merupakan sinar tidak tampak, maka bayangan baru dapat dilihat setelah menghubungkan dengan layar televisi (ditangkap oleh tabung foto atau kamera TV yang sensitif terhadap sinar UV)

11 Mikroskop Fluoresen Fluorescen = senyawa yang dapat menyerap energi dari sinar UV (tak tampak) dan mengeluarkannya sebagai sinar tampak dengan panjang gelombang lebih tinggi Mikroskop fluorescen dapat melihat objek yang bersifat fluorescen yang disebabkan oleh senyawa fluorescen alami atau diberi zat warna fluorescen = fluorochromes (misalnya auramin O dan fluorescein isothiocyanate) Untuk mengamati Mycobacterium tuberculosis, penyebab TBC, yang akan nampak berwarna kuning cerah karena menyerap pewarna auramin O Untuk mengamati Bacillus anthracis, penyebab antrax, yang akan nampak berwarna hijau apel karena menyerap pewarna fluorescein isothiocyanate

12

13 Mikroskop Elektron Mikroskop elektron berbeda dengan mikroskop biasa karena digunakan elektron sebgai pengganti sinar dan elektromagnit sebagai pengganti lensa Mempunyai resolusi (revolving power) sangat tinggi yaitu 0,001 mikron Persiapan sampel: sel atau sampel yang tebal harus diiris tipis menggunakan ultramikrotom Diberi pewarna khusus: asam osmat, permanganat, uranium, lantanum atau plumbum (mempunyai berat atom tinggi sehingga dapat menyebarkan elektron dengan baik dan struktur selsampel menjadi lebih kontras dan mudah dilihat Cara lain untuk memperoleh kontras yang baik adalah dengan pewarnaan negatif menggunakan zat warna Nigrosin untuk mewarnai latar belakang, bukan sel atau sampelnya Cara pengamatan Objek/sampel diletakkan pada kisi logam yang dilapisi kolodion, lalu dimasukkan ke dalam intrumen kemudian dibuat vakum Berkas elektron akan menyala dan bayangan dapat dilihat pada layar kecil. Usahakan buat segera fotonya karena pengamatan yang terlalu lama objek menjadi rusak karena adanya berkas elektron

14

15 Beberapa bentuk mikroskop

16 Mikroskop elektron Model lama Model baru

17

18 Jenis-jenis Mikroskop Elektron Transmission Electron Microscope (TEM): suatu jenis mikroskop elektron dimana sinar elektron bervoltase tinggi diemisikan oleh katoda yang dihasilkan oleh lensa magnetik. Sinar elektron lalu ditransmisi melalui melalui spesimen (sampel) yang sangat tipis sehingga dapat membawa/menghasilkan informasi (image) tentang spesimen tersebut. Selanjutnya informasi ini ditangkap oleh sensor yang sangat sensitive misalnya CCD (charge-coupled device) dan didisplay melalui monitor atau komputer Scanning Electron Microscope (SEM): tidak seperti dengan TEM dimana elektron dideteksi melalui transmisi sinar, SEM menghasilkan image melalui elektron sekunder yang diemisikan oleh suatu permukaan sebagai akibat excitation (benturan) dengan elektron primer. Sinar elektron selanjutnya menghasilkan image 3 D dan diamati lewat komputer atau monitor.

19 Jenis-jenis Mikroskop Elektron Scanning Transmission Electron Microscope (STEM). Tipe mikroskop gabungan SEM & TEM. Pada mikroskop jenis ini, probe elektron kecil discan pada area yang akan diamati tanpa memberikan iluminasi/sinar secara kontinyu. Elektron yang ditransmisikan ditangkap bersama dengan spesimen. Selanjutnya signal yang terbentuk didisplay pada monitor atau komputer Reflection Electron Microscope (REM): Seperti halnya TEM, teknik ini melibatkan elektron pada permukaan spesimen, tapi sebagai pengganti transmisi (TEM) atau elektron sekunder (SEM), mikroskop ini menggunakan sinar yang direfleksikan/dibelokkan. Sinar ini selanjutnya melalui spesimen membentuk image yang akan diamati pada kompoter atau monitor Scanning Tunneling Microscope (STM): Mikroskop ini menggunakan prinsip-prinsip mekanik kuantum untuk menentukan besar/tinggi suatu permukaan. Sebuah probe tajam berukuran sangat kecil dipindahkan melalui permukaan spesimen yang akan diamati, selanjutnya dialirkan sinar elektron diantara probe dan permukaan tsb. Selanjutnya akan timbul tegangan listrik yang sangat tergantung pada jarak antara probe dan permukaan. Selanjutnya terbentuk image yang akan dilihat pada layar monitor atau komputer

20 Mekanisme Kerja Mikroskop Objek kecil & mikroba dapat dilihat karena 2 sistem yang bekerja pada mikroskop: 1. Sistem optik/pembesaran Pembesaran terjadi karena adanya lensa objektif yang terletak dekat objek dan lensa okuler (eyepiece lens) 2. Sistem Iluminasi Sinar/Cahaya (yang berasal dari sinar matahari atau lampu tungsten) dan kondenser mengatur iluminasi dari objek secara tepat

21 Cara Kerja Mikroskop Lensa objektif bekerja untuk mengatur fokus sinar lampu pada objek yg ditempatkan di belakang titik fokal (titik api) F1 dan memperbesar objek sehingga menghasilkan bayangan nyata yang selanjutnya diproyeksikan pada bidang fokal dari lensa okuler Bayangan nyata yang diproyeksikan pada bidang fokal F1 dari lensa objektif diperbesar oleh lensa okuler sehingga membentuk bayangan maya (semu) yang dapat dilihat oleh mata Total pembesaran merupakan hasil pembesaran lensa objektif dan lensa okuler Contoh: lensa objektif 40 x lensa okuler 10 x Total pembesaran = 40 x 10 = 400 kali

22 Resolving Power Karena total pembesaran merupakan hasil dari pembesaran 2 buah lensa, maka seharusnya total pembesaran dapat dinaikkan dengan cara menambah lebih banyak lensa! Kenyataannya tidak bisa karena suatu lensa dibatasi oleh sifatnya yang disebut Resolving Power Resolving Power = kemampuan suatu lensa untuk melihat 2 buah objek yang berdekatan sebagai objek yang terpisah secara jelas Resolving power dari mata manusia pada jarak 25 cm adalah 0,1 mm (100 mikron)

23 Resolving Power Sifat lensa tergantung pada panjang gelombang sinar dan numerical aperture (NA) dari lensa, dimana NA = n sin θ dan θ = ½ α, (n = indeks refraksi dan α = sudut apertur) sehingga Resolving power = diameter dari objek yang terlihat = panjang gelombang/na Salah satu cara menaikkan NA dari lensa adalah menggunakan kondenser kondenser yang baik menghasilkan persamaan: Resolving Power = panjang gelombang/2na

24 Mengapa perlu minyak imersi? Udara mempunyai indeks refraksi (n) = 1 sedangkan gelas n = 1,5 sehingga sinar lampu yang datang akan dibelokkan (direfraksi) karena n udara < n gelas Akibatnya NA dan resolusi lensa objektif menurun! Jika antara lensa objektif dan gelas objek diberi minyak imersi yang mempunyai n = 1,5, maka kehilangan sinar dapat dicegah.dampaknya resolusi lensa objektif menjaditinggidan bayangan nampak lebih jelas

25 Jenis-jenis lensa Lensa okuler: pembesaran yang umum 10x Lensa objektif (LO)ada 3 jenis: 1. LO berkekuatan rendah: 10x 2. LO berkekuatan tinggi: 40x, 43x, 45x 3. LO minyak imersi: 95x,97x dan 100x Misal menggunakan lensa okuler 10x dan lensa objektif 100x, maka pembesaran objek yang diamati = 1000 kali

26 Lensa

27 Lensa Positif (Konvex=Cembung)

28

29

30 Lensa Negatif Konkaf=Cekung Cekung)

31

32

33

34 ILUMINASI Selain lensa okuler dan lensa objektif, elemen lain yang penting dari mikroskop adalah sinar dan kondenser Lampu tungsten lebih baik digunakan sbg sumber sinar dibanding cahaya matahari karena warna, suhu dan intensitasnya bersifat stabil dan mudah dikontrol Sinar dan kondenser akan mengatur ILUMINASI dari objek/spesimen secara tepat Bertambahnya pembesaran lensa objektif..akan menurunkan jarak kerja lensa dan sudut aperture (α) dari lensa objektif bertambah besar Besarnya sinar yang masuk diatur oleh diafragma iris yang terletak antara kondenser dan lensa objektif Lensa berkekuatan rendah diafragma iris tidak membuka penuh, sebaliknya pada kekuatan tinggi, diagragma iris akan terbuka penuh (lihat gambar)!

35 Hubungan Lensa dan Diafragma Iris Semakin rendah kekuatan lensa, semakin kecil diameter diafragma iris dan sebaliknya

36 Sekian