BAHAN DAN METODE. Keterangan: P = Kejadian penyakit kuning n = Jumlah tanaman yang bergejala N = Jumlah tanaman yang diamati

Transkripsi

1 10 BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Nematologi Departemen Proteksi Tanaman, Institut Pertanian Bogor. Pengambilan contoh akar dan tanah tanaman lada dilakukan di kebun petani Kabupaten Bangka dan Kabupaten Bangka Tengah pada bulan Oktober hingga Desember Metode Penelitian Survei Tanaman Lada dan Penyakit Kuning Survei tanaman lada dan penyakit kuning dilakukan di wilayah Provinsi Bangka Belitung yaitu di Kabupaten Bangka dan Bangka Tengah. Survei dilakukan dengan cara menentukan kebun tanaman lada yang relatif sehat dan sakit. Selanjutnya dihitung kejadian penyakit kuning pada lahan tersebut dengan metode silang. Setiap lahan diambil 50 tanaman. Perhitungan kejadian penyakit dengan menggunakan rumus: P = Keterangan: P = Kejadian penyakit kuning n = Jumlah tanaman yang bergejala N = Jumlah tanaman yang diamati Pengambilan Contoh Akar dantanah Tanaman Lada Pengambilan contoh akar dan tanah tanaman lada dari setiap kabupaten diambil satu kebun sakit dan satu kebun sehat. Berdasarkan keadaan kebun di Kabupaten Bangka dan Bangka Tengah yang sangat sulit menemukan kebun yang benar-benar sehat maka diperoleh katergori sebagai berikut: kebun dikatakan sakit apabila kebun tersebut mempunyai kejadian penyakit lebih dari 60% (Lampiran 2), sedangkan kebun sehat apabila kebun lada yang terserang menunjukkan kejadian penyakit kurang dari 20% (Lampiran 3). Masing-masing kebun diambil 4 tanaman sehat. Setiap tanaman contoh diambil bagian akar dan tanah dengan menggunakan skop untuk dilakukan ekstraksi nematoda dan isolasi bakteri endofit. Kemudian akar dan tanah dimasukkan ke dalam kantong plastik dan diberi label.

2 11 Ekstraksi Nematoda dari Akar dan Tanah Ekstraksi nematoda dilakukan untuk mengetahui populasi nematoda yang berada dalam tanah dan di dalam jaringan akar. Untuk ekstraksi nematoda dalam akar, akar ditimbang sebanyak 5 g berat basah, kemudian akar dipotong ± 2 cm dengan menggunakan gunting. Selanjutnya akar diletakkan ke dalam wadah yang telah dilandasi dengan saringan yang berdiameter 8 cm dan diberi label. Setelah itu akar diletakkan di dalam ruang pengabut selama 3 hari kemudian dilakukan pemanenan. Pemanenan nematoda dilakukan dengan cara suspensi nematoda yang sudah tertampung dalam wadah kemudian disaring dengan menggunakan saringan khusus nematoda yang berukuran 500 mesh. Setelah itu air yang tersisa di dalam saringan dimasukkan ke dalam botol dan diberi label kemudian dihitung dan diamati dengan menggunakan mikroskop. Ekstraksi nematoda dalam tanah dengan menggunakan metode corong Baermann yang telah dimodifikasi yaitu tanah ditimbang sebanyak 20 g kemudian diletakkan diatas tisu dan saringan, kemudian dibiarkan tergenang pada wadah yang sudah berisi air dan diberi label selanjutnya diinkubasi selama 3 hari kemudian dilakukan pemanenan. Cara pemanenan sama seperti pemanenan nematoda dalam akar. Isolasi Bakteri Endofit dari Perakaran Tanaman Lada Bakteri endofit dieksplorasi dari beberapa tanaman lada yang diambil dari pertanaman lada di Kabupaten Bangka dan Bangka Tengah. Contoh akar yang diambil masing-masing dicuci dengan air mengalir sampai bersih, kemudian akar ditimbang sebanyak 1 g berat basah akar. Selanjutnya akar dipotong 2-3 cm dengan menggunakan gunting. Contoh akar yang sudah dipotong kemudian disterilisasi permukaan dengan direndam pada alkohol 70% selama satu menit, setelah itu direndam pada larutan NaOCl 2% selama dua menit, dibilas dengan air steril sebanyak tiga kali. Sebagai pembanding atau kontrol dilakukan dengan akar yang sudah disterilisasi permukaan (sebelum dihancurkan) ditumbuhkan pada TSA (Tryptic Soy Agar) 20%. Jika pada kontrol tumbuh bakteri maka terjadi kontaminasi atau isolasi yang dilakukan tidak berhasil. Contoh akar yang sudah

3 12 disterilkan kemudian dihancurkan dengan menggunakan mortar steril sampai halus. Selanjutnya dilakukan pengenceran sebanyak 4 kali pengenceran. Pengenceran dilakukan secara berseri. Setelah itu suspensi diambil sebanyak 1 ml dengan menggunakan pipet mikro kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisikan air steril sebanyak 9 ml hingga mendapatkan pengenceran sebesar Pada tingkat pengenceran 10-1, 10-2, 10-3, dan 10-4 ditumbuhkan pada media TSA 20% lalu diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang. Koloni bakteri yang tumbuh pada media TSA 20% dihitung dan dimurnikan pada media TSA 100%. Jumlah koloni yang tumbuh selanjutnya dikonversikan ke dalam satuan cfu/ml dengan rumus: Populasi bakteri = Keterangan: r = Jumlah koloni yang tumbuh pada cawan dengan faktor pengenceran ke- (cfu) p = Faktor pengenceran kev = Volume suspensi yang disebar pada cawan (ml) Bakteri yang sudah murni kemudian dilakukan karakterisasi berdasarkan permukaan, tepian, bentuk, dan warna. Selanjutnya bakteri dimasukkan ke dalam eppendorf yang telah berisi media TSB (Tryptic Soy Broth) dan Gliserol 20% kemudian disimpan pada suhu -20 C. Pengujian Isolat Bakteri Endofit terhadap Pertumbuhan Tanaman Tomat Pengujian dilakukan pada benih tomat (sebagai tanaman model). Benih tomat direndam dalam suspensi isolat bakteri selama 24 jam. Sebelum dilakukan perendaman dalam bakteri, benih tomat direndam dalam air steril, benih tomat yang terapung dibuang dan benih yang tenggelam direndam pada suspensi bakteri endofit. Sebagai kontrol, benih direndam dalam air steril selama 24 jam. Selanjutnya benih tomat ditanam pada tiga media yang berbeda yaitu media sekam, cawan petri (kertas saring) dan dengan menggunakan metode blotter test. Media sekam. Media sekam yang steril dimasukkan ke dalam tray atau tempat persemaian. Selanjutnya benih yang sudah direndam pada suspensi bakteri endofit ditanam pada media tersebut. Perlakuan yang digunakan sebanyak 16

4 13 perlakuan yaitu 15 perlakuan dengan isolat bakteri dan 1 perlakuan dengan menggunakan air steril (kontrol). Masing-masing perlakuan diulang sebanyak 3 kali, setiap ulangan ditanam 10 benih. Pengamatan dilakukan 7 hari setelah perlakuan (7 HSP) terhadap perkecambahan. Cawan petri (kertas saring). Kertas saring dipotong menggunakan gunting sesuai dengan bentuk cawan petri. Kemudian kertas saring disterilkan dengan menggunakan autoklav pada suhu 121 C selama 15 menit. Selanjutnya kertas saring yang sudah steril dimasukkkan ke dalam cawan petri steril lalu disemprot dengan air steril hingga lembab. Perlakuan yang digunakan sebanyak 16 perlakuan yaitu 15 perlakuan dengan isolat bakteri dan 1 perlakuan dengan menggunakan air steril (kontrol). Masing-masing perlakuan diulang sebanyak 3 kali, setiap ulangan ditanam 10 benih. Pengamatan dilakukan pada 3 HSP dan 6 HSP terhadap perkecambahan. Blotter test. Kertas saring diletakkan di atas plastik. Kemudian kertas saring dibasahi dengan air steril kemudian benih tomat yang telah diberi perlakuan ditanam pada media tersebut. Perlakuan yang digunakan sebanyak 16 perlakuan yaitu 15 perlakuan dengan isolat bakteri dan 1 perlakuan dengan menggunakan air steril (kontrol). Masing-masing perlakuan diulang sebanyak 3 kali, setiap ulangan ditanam 5 benih. Setelah benih ditanam pada kertas saring basah yang dibawahnya sudah diberi plastik kemudian digulung. Pengamatan dilakukan 7 HSP terhadap perkecambahan dan panjang akar. Uji Kultur Filtrat Isolat Bakteri Endofit terhadap Meloidogyne spp. Isolat bakteri endofit yang menunjukkan pengaruh terhadap pertumbuhan benih selanjutnya akan diuji terhadap larva Meloidogyne spp. Larva Meloidogyne spp. diperoleh dari hasil ekstraksi nematoda. Bakteri endofit yang sudah terpilih dari pengujian isolat bakteri endofit terhadap pertumbuhan tanaman tomat ditumbuhkan pada media TSA selama 48 jam pada suhu ruang. Koloni tunggal dari bakteri dipindahkan ke dalam 70 ml media TSB lalu diinkubasikan pada inkubator bergoyang dengan suhu 25 C selama 48 jam dengan kecepatan 150 rpm. Kemudian kultur bakteri disentrifugasi dengan kecepatan rpm selama 5 menit dengan suhu -4 C. Untuk pengujian pengaruh filtrat bakteri terhadap

5 14 nematoda, 5 ml kultur filtrat bakteri dimasukkan ke dalam gelas hitung atau cawan sirakus, kemudian ditambahkan 50 ekor Meloidogyne spp. dan disimpan pada suhu ruang. Pengamatan dilakukan terhadap mortalitas nematoda setelah 12 jam dan 24 jam dengan menggunakan mikroskop. Analisis Data Data yang diperoleh dari kejadian penyakit selanjutnya diolah dengan uji proporsi. Percobaan isolat bakteri endofit terhadap pertumbuhan tanaman tomat dan kultur filtrat isolat bakteri endofit bersifat antagonis terhadap Meloidogyne spp. disusun dengan rancangan acak lengkap (RAL) dan data yang diperoleh diolah melalui sidik ragam yang dilanjutkan dengan uji Duncan pada taraf 5% dengan menggunakan program SAS