AKTIVITAS ENZIM LIGNOSELULASE PAENIBACILLUS SP. SERTA POTENSINYA DALAM MENINGKATKAN KETERSEDIAAN NUTRIEN PAKAN FITRIA NUR AINI

Transkripsi

1 AKTIVITAS ENZIM LIGNOSELULASE PAENIBACILLUS SP. SERTA POTENSINYA DALAM MENINGKATKAN KETERSEDIAAN NUTRIEN PAKAN FITRIA NUR AINI SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2018

2

3 PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Aktivitas Enzim Lignoselulase Paenibacillus sp. serta Potensinya dalam Meningkatkan Ketersediaan Nutrien Pakan adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, Agustus 2018 Fitria Nur Aini NIM D

4 RINGKASAN FITRIA NUR AINI. Aktivitas Enzim Lignoselulase Paenibacillus sp. serta Potensinya dalam Meningkatkan Ketersediaan Nutrien Pakan. Dibimbing oleh ERIKA BUDIARTI LACONI dan MAGGY THENAWIJAYA SUHARTONO. Hasil samping pertanian seperti jerami padi, jerami jagung, jerami kedelai dan bagas tebu merupakan bahan lignoselulosa yang berpotensi digunakan sebagai pakan. Pemanfaatannya sebagai pakan belum optimal karena kualitas nutrisi yang rendah akibat adanya ikatan senyawa antara lignin, hemiselulosa dan selulosa. Hal ini akan menghambat proses degradasi kimia di dalam saluran pencernaan. Penambahan enzim pada pakan dapat meningkatkan ketersediaan nutrien. Salah satu sumber penghasil enzim yang cukup potensial ialah bakteri. Paenibacillus sp. ialah salah satu jenis bakteri yang memiliki potensi genetik dalam menghasilkan enzim lignoselulolitik. Potensi enzim untuk menghasilkan aktivitas pendegradasi substrat tertentu dapat dilakukan salah satunya dengan penambahan inducer pada media pertumbuhan bakteri. Tujuan penelitian ini adalah untuk: (1) mengevaluasi pertumbuhan Paenibacillus sp. pada media dengan sumber karbon atau inducer berupa jerami atau bagas tebu; (2) mengukur aktivitas lignoselulase enzim kasar yang dihasilkan, (3) mengukur aktivitasnya dalam mendegradasi substrat jerami atau bagas tebu, serta (4) mengamati kenampakan fisik jerami atau bagas tebu yang ditambahkan enzim kasar Paenibacillus sp. Media dengan sumber karbon bagas tebu menghasilkan pertumbuhan tertinggi dengan jumlah koloni 1.4 x 10 7 CFU ml -1. Aktivitas selulase tertinggi dihasilkan oleh medium pertumbuhan dengan sumber karbon carboxy methyl cellulose dengan aktivitas sebesar 0.51 IU ml -1, sedangkan aktivitas xilanase tertinggi dihasilkan oleh medium pertumbuhan nutrient broth dengan aktivitas 0.27 IU ml -1. Jenis sumber karbon media pertumbuhan bakteri dan jenis substrat target jerami atau bagas tebu tidak berpengaruh nyata terhadap aktivitas lignin peroksidase. Hasil penelitian menunjukkan adanya interaksi antara sumber karbon medium pertumbuhan bakteri dan jenis substrat target. Perlakuan medium pertumbuhan bakteri dengan sumber karbon bagas tebu dan jenis substrat target bagas tebu menghasilkan gula reduksi tertinggi, yakni sebesar mm. Perlakuan jenis sumber karbon dan substrat target berpengaruh nyata terhadap persentase gula reduksi terhadap gula total. Perlakuan sumber karbon asal carboxymethyl cellulose dan jerami kedelai dengan substrat target jerami kedelai menghasilkan presentasi gula reduksi-gula total paling tinggi, yakni sebesar 0.613% dan %. Aplikasi penambahan enzim kasar Paenibacillus sp. pada tepung bagas tebu terbukti mampu memecah struktur fisik serat. Tingkat kerusakan struktur fisik serat yang terjadi berkorelasi positif dengan aktivitas enzim. Peningkatan aktivitas enzim perlu ditingkatkan antara lain dengan melakukan optimasi suhu, ph, dan waktu inkubasi. Selanjutnya hasil penambahan enzim pada pakan perlu diukur nilai kecernaannya baik secara in vitro maupun in vivo. Kata kunci: bagas, enzim, jerami, lignoselulosa, Paenibacillus sp.

5 SUMMARY FITRIA NUR AINI. Lignocellulolytic Enzyme Activity of Paenibacillus sp. and The Potential for Increasing Nutrient Availability of Feed. Supervised by ERIKA BUDIARTI LACONI and MAGGY THENAWIJAYA SUHARTONO. Agricultural by products like rice straw, corn straw, soybean straw and sugarcane bagasse are lignocellulose biomass that were potentially used as feed. The utility as feed is still not optimum because of the low nutritional quality due to chemical binding between lignin, hemicellulose and cellulose that inhibit the process of biochemical degradation in the digestive tract. Enzyme addition may increase the availability of nutrients. Bacteria is one of the potential sources of enzyme. Paenibacillus sp. is a genus of bacteria that potentially produce lignocellulolitic enzymes. Enzyme capability to degrade specific substrate can be promoted by adding inducer on the growth media. The objectives of this study were to: (1) evaluate the growth of Paenibacillus sp. on the different carbon sources media, e.g: straw or sugarcane bagasse; (2) calculate lignocellulolytic enzyme activity of Paenibacillus sp. crude enzyme, (3) estimate Paenibacillus sp. crude enzyme activity in degrading substrate of straw or sugarcane bagasse, and (4) physically observe the effect of crude enzyme adding on the straw or sugarcane bagasse mash. Sugarcane bagasse carbon source media produced the highest growth based on the total of colonies by 1.4 x 10 7 CFU ml -1. The highest cellulase activity was produced by carboxymethyl cellulose carbon source media by U g -1, while the highest xylanase activity was showed by nutrient broth media by 2.72 U g -1. The type of carbon source and substrate had no effect on lignin peroxidase activity. The results showed that there was an interaction between carbon sources and type of substrates on the reduction sugar production. Treatment of sugarcane bagasse media produced the highest reduction sugar by mm. Interaction between carbon sources and type of substrates also occured in the percentage of sugar reduction to total sugar. Carboxymethyl cellulose and soybean straw carbon sources treatment with soybean straw as the substrate resulted the highest total sugar-reducing sugar percentage by 0.613% and %. Applications of crude enzyme addition on sugarcane bagasse flour proved capable to break the physical structure of the fiber. The degree of damage was positively correlated with enzyme activity. Enzyme activity needs to be increased, by optimizing the temperature, ph, and incubation time. Furthermore, the results of the addition of enzymes in the feed need to be measured in their digestibility values both in vitro and in vivo. Keywords: enzyme, lignocellulose, straw, sugarcane bagasse, Paenibacillus sp.

6 Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2018 Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

7 AKTIVITAS ENZIM LIGNOSELULASE PAENIBACILLUS SP. SERTA POTENSINYA DALAM MENINGKATKAN KETERSEDIAAN NUTRIEN PAKAN FITRIA NUR AINI Tesis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Ilmu Nutrisi dan Pakan SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2018

8 Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr Ir Muhammad Ridla, MAgr

9 Judul Tesis Nama NIM : Aktivitas Enzim Lignoselulase Paenibacillus sp. serta Potensinya dalam Meningkatkan Ketersediaan Nutrien Pakan : Fitria Nur Aini : D Disetujui oleh Komisi Pembimbing (a!#/\-- MS Prof Dr Ir Ma Diketahui oleh Ketua Program Studi Ilmu Nutrisi dan Pakan Prof Dr Ir Yuli Retnani, MSc nas Miftah F auzi, MEng Tanggal Ujian: 15 Agustus 2018 Tanggal Lulus : 3 1 AUG 2018

10 PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta ala atas segala karunia-nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Oktober 2017 ini ialah teknologi pengolahan pakan, dengan judul Aktivitas Enzim Paenibacillus sp. serta Potensinya dalam Meningkatkan Ketersediaan Nutrien Pakan. Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Prof Dr Ir Erika Budiarti Laconi dan Ibu Prof Dr Ir Maggy Thenawijaya Suhartono selaku pembimbing. Di samping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada Kak Adis dan staf teknisi di Laboratorium Ilmu dan Teknologi Pakan, Ibu Dian di Laboratorium Nutrisi Ternak Perah, Ibu Adriani di Laboratorium Biokimia dan Mikribiologi Nutrisi, Kak Selvy di Laboratorium Genetika Molekuler serta Mbak Yuni di Laboratorium Zoologi LIPI Cibinong, yang telah membantu selama proses analisa hingga perolehan data. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada ayah, ibu, serta seluruh keluarga, atas segala doa dan kasih sayangnya. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat. Bogor, Agustus 2018 Fitria Nur Aini

11 DAFTAR ISI DAFTAR TABEL DAFTAR GAMBAR DAFTAR LAMPIRAN 1 PENDAHULUAN 1 Latar Belakang 1 Perumusan Masalah 2 Tujuan Penelitian 3 Manfaat Penelitian 3 Ruang Lingkup Penelitian 3 2 TINJAUAN PUSTAKA 4 Biomasa Lignoselulosa 4 Enzim Lignoselulase 5 Paenibacillus sp. 6 3 METODE 7 Waktu dan Lokasi Penelitian 7 Alat dan Bahan 8 Prosedur 8 Rancangan Percobaan 11 Analisis Data 12 4 HASIL DAN PEMBAHASAN 12 Komposisi Kimia 13 Fraksi Serat Kasar 13 Kenampakan Fisik 14 Pertumbuhan Bakteri 16 Aktivitas Enzim 18 Aplikasi Penambahan Enzim 22 5 SIMPULAN DAN SARAN 24 Simpulan 24 Saran 24 DAFTAR PUSTAKA 24 LAMPIRAN 30 RIWAYAT HIDUP 41 vi vi vii

12 DAFTAR TABEL 1 Contoh isolat Paenibacillus 7 2 Aktivitas enzim isolat Paenibacillus 7 3 Komposisi kimia beberapa hasil samping pertanian (dry matter) 13 4 Fraksi serat beberapa hasil samping pertanian (dry matter) 14 5 Jumlah koloni Paenibacillus sp. pada berbagai media 17 6 Aktivitas selulase, xilanase, dan lignin peroksidase enzim kasar Paenibacillus sp Kadar gula beberapa hasil samping pertanian 20 8 Gula reduksi (mm) yang dihasilkan oleh enzim kasar Paenibacillus sp. dalam mendegradasi substrat hasil samping pertanian 21 9 Persentase gula reduksi terhadap gula total 21 DAFTAR GAMBAR 1 Bagan alir penelitian 9 2 SEM tepung jerami padi (perbesaran 500x dan 1000x) 15 3 SEM tepung jerami jagung (perbesaran 500x dan 1000x) 15 4 SEM tepung jerami kedelai (perbesaran 500x dan 1000x) 15 5 SEM tepung bagas tebu (perbesaran 500x dan 1000x) 15 6 Jerami padi 16 7 Jerami jagung 16 8 Jerami kedelai 16 9 Bagas tebu Pertumbuhan Paenibacillus sp. pada media perlakuan Korelasi kadar selulosa dan aktivitas selulase Produksi gula reduksi enzim kasar Paenibacillus sp. dengan substrat bagas tebu SEM tepung bagas tebu (perbesaran 500x): (a) tanpa perlakuan, (b) penambahan enzim H-0, (c) penambahan enzim H-1, dan (d) penambahan enzim H SEM tepung bagas tebu (perbesaran 1000x): (a) tanpa perlakuan, (b) penambahan enzim H-0, (c) penambahan enzim H-1, dan (d) penambahan enzim H Isolat bakteri Paenibacillus sp Stok isolat Paenibacillus sp Inkubasi bakteri pada suhu ruang Inkubasi bakteri pada shaker Pertumbuhan bakteri untuk pengamatan kurva pertumbuhan Ekstraksi enzim kasar Sampel enzim kasar Inkubasi circulating water bath Sampel uji DNS Pembacaan absorbansi Alat dan bahan penambahan enzim pada tepung bagas tebu Preparasi sampel uji SEM 39

13 27 Pengamatan SEM 39 DAFTAR LAMPIRAN 1 Hasil analisis ragam dan uji lanjut jumlah koloni Paenibacillus sp Hasil analisis ragam dan uji lanjut aktivitas selulase 31 3 Hasil analisis ragam dan uji lanjut aktivitas xilanase 32 4 Hasil analisis ragam aktivitas lignin peroksidase 33 5 Hasil analisis ragam dan uji lanjut gula reduksi 34 6 Hasil analisis ragam dan uji lanjut persentase gula reduksi terhadap gula total 36 7 Dokumentasi kegiatan 38 8 Gambar kenampakan fisik mikroskop SEM pada berbagai perlakuan 40

14

15 1 PENDAHULUAN Latar Belakang Lignoselulosa sebagai biomasa paling melimpah di bumi, merupakan komponen asal tanaman yang merepresentasikan jumlah bahan organik dan sumber energi berkelanjutan. Komponen penyusunnya terdiri dari selulosa, hemiselulosa, dan lignin dengan proporsi masing-masing 24-47%, 11-27% dan 5-22% (Ni dan Tokuda 2013; Binod et al. 2010; Dawson dan Boopathy 2008; Xu et al. 2007). Sumber lignoselulosa di alam dapat berasal dari limbah hewan dan perkotaan, tanaman hasil hutan, residu pertanian maupun hasil samping agroindustri (Reddy dan Yang 2005). Hasil samping pertanian merupakan biomasa lignoselulosa yang banyak digunakan sebagai pakan ternak karena jumlahnya yang melimpah, ketersediaan kontinyu, dan adanya kedekatan kultur dalam bertani dan beternak. Lemaire et al. (2014) menambahkan bahwa pemanfaatan hasil samping pertanian sebagai pakan merupakan bentuk sinergi yang baik untuk meningkatkan produksi pertanian, peternakan dan perbaikan kualitas lingkungan. Beberapa hasil samping pertanian yang ada di Indonesia diantaranya jerami padi, jerami jagung, jerami kedelai dan bagas tebu dengan jumlah produksi per tahun masing-masing yakni ton, ton, ton, dan ton (Adlan 2015; Antorida 2014; BPS 2015). Pemberian hasil samping pertanian sebagai pakan telah banyak dilakukan oleh peternak baik skala kecil maupun besar. Penggunaannya dalam ransum dapat mensubstitusi penggunaan rumput atau hijauan pakan, namun harus dengan suplementasi bahan bernutrisi tinggi untuk dapat mencukupi kebutuhan nutrisi ternak. Pemanfaatan bahan lignoselulosa sebagai pakan pada umumnya diberikan pada ternak ruminansia, diantaranya sapi, kambing, dan domba. Keberadaan rumen sebagai salah satu organ pencernaan pada ternak ruminansia memudahkan proses pencernaan bahan berserat tinggi karena adanya mikroorganisme simbiotik yang mampu menghasilkan enzim selulase (Moir 1965). Pemanfaatan jerami dan bagas tebu sebagai pakan masih terkendala oleh nilai kecernaannya yang cukup rendah yakni berkisar % (Martawidjaja 2003; Okano et al. 2006; Umiyasih dan Wina 2008). Hal ini disebabkan oleh adanya ikatan senyawa antara lignin, hemiselulosa dan selulosa yang menghambat proses degradasi kimia di dalam saluran pencernaan. Ikatan kimia yang kuat antara lignin dan polisakarida lain serta protein dinding sel menyebabkan kandungan nutrien di dalamnya menjadi tidak tersedia (McDonald 2010). Pada bahan lignoselulosa, rantai lurus polimer glukosa berasosiasi dengan hemiselulosa dan dilapisi dengan ikatan lignin. Secara kimia lignin merupakan sebuah kompleks tiga dimensi matriks poliaromatik yang mencegah enzim mengakses beberapa area polimer selulosa. Kristalinitas ini selanjutnya akan menghalangi proses hidrolisis oleh enzim pencernaan (Xu et al. 2007). Oleh sebab itu, peningkatan kualitas hasil samping pertanian sebagai bahan pakan perlu ditingkatkan. Salah satu teknologi yang dapat dilakukan adalah dengan penambahan enzim, yakni biokatalisator yang dapat memecah ikatan senyawa kompleks bahan sehingga menjadi komponen yang lebih mudah dicerna. Enzim merupakan jenis protein yang mengkatalisis reaksi biokimia melalui peningkatan laju reaksi tanpa merubah posisi kesetimbangan (Ngili 2013). Penambahan enzim

16 2 pada pakan dapat meningkatkan ketersediaan polisakarida yang terproteksi oleh nutrien hasil samping struktur dinding sel tanaman (McDonald 2010). Penambahan enzim pada bahan lignoselulosa ditujukan untuk memotong ikatan senyawa antara selulosa, hemiselulosa dan lignin maupun untuk memotong ikatan glikosida pada polimer rantai panjang selulosa dan hemiselulosa sehingga menjadi polimer rantai pendek yang lebih mudah diserap oleh tubuh. Enzim dapat diperoleh dari berbagai sumber yang berasal dari makhluk hidup, misalnya tanaman, hewan (saluran pencernaan, kelenjar, ginjal), dan mikroorganisme (fungi, khamir, bakteri) (Petersen daan Sauter 1967; Loomis et al. 1978; Price dan Robinson 1966). Salah satu sumber penghasil enzim yang cukup potensial digunakan adalah bakteri. Bakteri memiliki pertumbuhan yang cukup cepat, mudah dilakukan proses rekayasa genetik dan mampu menghasilkan produk yang spesifik sehingga cukup baik dijadikan sebagai penghasil enzim. Paenibacillus sp. merupakan spesies bakteri yang diketahui memiliki kemampuan cukup tinggi dalam menghasilkan enzim pendegradasi lignoselulosa diantaranya selulase, xilanase dan lignolitik (Ohkuma et al. 2003; Konig 2005; Chandra et al. 2008; Akaracharanya et al. 2009). Beberapa penelitian terdahulu mengisolasi bakteri ini dari tanah, saluran pencernaan rayap, dan limbah kertas (Ohkuma et al. 2003; Konig 2005; Akaracharanya et al. 2009;). Kemampuan bakteri hidup pada habitat yang mengandung lignoselulosa tinggi mengindikasikan adanya kemampuan dalam menghasilkan enzim lignoselulase. Produk enzim yang dihasilkan mikroorganisme bergantung pada biosintesis yang dilakukannya di dalam medium pertumbuhan (Wiseman 1975). Salah satu proses modifikasi enzim dapat dilakukan melalui penambahan inducer, yakni komponen yang ditambahkan untuk menstimulus respon enzim terhadap substrat tertentu (Weiss et al. 2015). Beberapa contoh misalnya penambahan maltosa pada sel khamir dapat menginduksi dihasilkannya enzim maltase dan pemberian laktosa pada Escherichia coli dapat menginduksi enzim β-galaktosidase (Wiseman 1975). Enzim komersil dengan aktivitas tinggi telah banyak dihasilkan dan diaplikasikan pada pakan ternak, misalnya ialah enzim fitase (memecah fitat) dan selulase (memecah selulosa) dengan sumber enzim berasal dari Aspergillus niger, Trichoderma reseei, dan beberapa jenis kapang lainnya. Aplikasi penambahan enzim asal bakteri belum banyak dilakukan, oleh sebab itu perlu dilakukan pengujian terhadap aplikasi penambahan enzim asal bakteri pada hasil samping pertanian untuk mengukur kemampuannya dalam meningkatkan ketersediaan nutrien. Perumusan Masalah Integrasi antar sektor pertanian memiliki manfaat yang cukup besar dalam mengatasi berbagai permasalahan seperti pencemaran lingkungan dan keterbatasan bahan pakan. Sektor peternakan sebagai penyumbang kontribusi dalam penyediaan protein hewani rentan terhadap masalah ketersediaan pakan, sedangkan di sisi lain sektor pertanian selalu menghasilkan hasil samping yang masih dapat dimanfaatkan sebagai alternatif bahan pakan. Beberapa hasil samping pertanian yang cukup besar jumlahnya di Indonesia adalah jerami padi, jerami jagung, jerami kedelai dan bagas tebu. Keempat jenis hasil samping pertanian ini merupakan bahan berlignoselulosa yang memiliki potensi untuk diberikan sebagai pakan ternak ruminansia. Kualitas

17 nutrien hasil samping pertanian yang masih rendah perlu ditingkatkan untuk memantapkan potensi penggunaannya sebagai pakan dalam skala besar dan menghasilkan produktivitas ternak yang membanggakan. Salah satu upaya dalam meningkatkan kualitas pakan ialah dengan penambahan enzim, yakni biokatalisator yang dapat memecah ikatan senyawa kompleks bahan sehingga menjadi lebih mudah dicerna. Beberapa jenis enzim yang penting untuk pemecahan senyawa lignoselulosa diantaranya selulase, xilanase, dan lignin peroksidase. Enzim ini dapat diperoleh dari hewan, tumbuhan ataupun mikroorganisme. Produksi enzim asal bakteri cukup banyak dilakukan mengingat potensi genetiknya yang sangat luas serta sifatnya yang undercontrol. Namun, aktivitas enzim yang dihasilkan cenderung lebih rendah dibandingkan enzim asal genus kapang seperti Aspergillus dan Trichoderma. Oleh sebab itu perlu adanya upaya untuk meningkatkan aktivitas enzim asal bakteri. Salah satunya adalah dengan penambahan inducer. Penambahan inducer diharapkan dapat memicu dihasilkannya enzim dengan aktivitas tinggi mendegradasi substrat target. Keberhasilan aplikasi penambahan enzim pada jerami perlu dibuktikan, salah satunya dengan pengamatan fisik kerusakan serat menggunakan mikroskop. 3 Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi pertumbuhan Paenibacillus sp. pada medium yang mengandung jerami atau bagas tebu, mengukur aktivitas lignoselulase enzim kasar yang dihasilkan, mengukur aktivitasnya dalam mendegradasi substrat jerami atau bagas tebu, serta mengamati kerusakan fisik jerami atau bagas tebu yang ditambahkan enzim. Penambahan jerami atau bagas tebu ke dalam medium pertumbuhan Paenibacillus sp. diharapkan mampu menghasilkan enzim dengan aktivitas tinggi mendegradasi substrat tersebut. Manfaat Penelitian Maanfaat penelitian ini adalah memberikan informasi terkait pertumbuhan Paenibacillus sp. pada media dengan sumber karbon berbeda, kekuatan aktivitas lignoselulase (selulase, xilanase, lignin peroksidase) enzim kasar Paenibacillus sp., serta potensi pemanfaatannya dalam meningkatkan ketersediaan nutrien jerami padi, jerami jagung, jerami kedelai dan bagas tebu. Ruang Lingkup Penelitian Ruang lingkup penelitian ini meliputi: (a) analisis proksimat dan van soest; (b) penyegaran isolat dan pembuatan kurva pertumbuhan bakteri; (c) produksi enzim asal bakteri pada medium pertumbuhan dengan sumber karbon berbeda; (d) pengukuran aktivitas enzim selulase, xilanase dan lignin peroksidase, dan (e) aplikasi penambahan enzim kasar pada jerami atau bagas tebu, uji gula reduksi, dan pengamatan fisik menggunakan scanning electron microscope (SEM). Penelitian ini terdiri dari dua tahap. Penelitian pertama mengkaji potensi enzim lignoselulase yang dihasilkan oleh Paenibacillus sp. Penelitian kedua menekankan pada aplikasi

18 4 penambahan enzim pada bahan lignoselulosa untuk digunakan sebagai pakan. Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Ilmu dan Teknologi Pakan, Laboratorium Biokimia dan Mikrobiologi Nutrisi, Laboratorium Nutrisi Ternak Perah, Laboratorium Terpadu, dan Laboratorium Genetika Molekuler Fakultas Peternakan IPB. Isolat bakteri diperoleh dari Indonesia Culture Collection (InaCC) Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Cibinong, Bogor. Analisa total gula dilakukan di Laboratorium Pengujian, Balai Besar dan Pengembangan Pascapanen Pertanian, Cimanggu, Bogor. Analisa scanning electron microscope (SEM) dilakukan di Laboratorium Zoologi Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Cibinong, Bogor. 2 TINJAUAN PUSTAKA Biomasa Lignoselulosa Lignoselulosa merupakan biomasa yang melimpah di alam dan umumnya berasal dari hasil samping pertanian, kehutanan, rerumputan dan bahan berkayu. Biomasa lignoselulosa berpotensi digunakan sebagai sumber bahan bakar dan produksi bahan organik secara berkelanjutan. Namun, pemanfaatannya di negara berkembang pada umumnya belum berjalan optimal dan justru menjadi faktor penyebab pencemaran lingkungan. Oleh karenanya pemanfaatan lignoselulosa menjadi produk bernilai guna perlu terus dikembangkan. Lignoselulosa tersusun atas tiga komponen utama, yakni selulosa (40-50%), hemiselulosa (20-30%), dan lignin (10-25%). Selulosa ialah polimer glukosa dengan ikatan β-1,4 glikosidik. Sesuai dengan proporsinya yang cukup besar di dalam lignoselulosa, selulosa menjadi komponen terbesar yang tersedia jumlahnya di alam (Shankar dan Isaiarasu 2011). Selulosa dapat dijadikan sebagai sumber energi yang potensial bagi berbagai jenis mikroorganisme untuk menghasilkan produk, misalnya enzim (Shahzadi et al. 2014). Melalui proses biokonversi, selulosa dapat diubah bentuk menjadi glukosa yang digunakan sebagai sumber energi. Hemiselulosa ialah makromolekul yang pada umumnya tersusun dari rangkaian polimer pentosa dan heksosa. Komposisi struktural hemiselulosa bervariasi menurut variasi genetiknya. Xilan dan mannan merupakan dua komponen yang paling banyak menyusun hemiselulosa (Shahzadi et al. 2014). Lignin tersusun dari tiga komponen alkohol aromatik (coniferyl, sinapyl, p- coumaryl) yang dihasilkan dari proses biosintesis dan membentuk suatu kompleks yang menutupi area di sekitar selulosa dan hemiselulosa. Beberapa biomasa lignoselulosa yang banyak melimpah di Indonesia diantaranya adalah jerami padi, jerami jagung, jerami kedelai dan bagase tebu. Jerami padi yaitu bagian batang tumbuh yang didapat setelah pemanenan bulir-bulir buah tanaman padi bersama atau tidak dengan tangkainya dikurangi dengan akar dan bagian batang yang tertinggal setelah disabit (Komar 1984). Di wilayah Asia khususnya Indonesia padi yang sudah menguning umumnya disabit batangnya kurang lebih cm diatas tanah. Buah padinya dirontokkan sehingga jerami yang dihasilkan adalah jerami yang masih memiliki tangkai buah dan buahbuah hampa yang masih melekat. Pemanfaatan jerami padi di Indonesia bermacammacam, diantaranya dibakar atau dikembalikan ke tanah sebagai kompos (36-62%)

19 dan diberikan sebagai makanan ternak (31-39%) (Komar 1984). Pemanfaatan jerami padi sebagai makanan ternak belum banyak karena nilai gizinya yang rendah sehingga masih perlu untuk ditingkatkan (Suyitno et al. 2006). Wulandari (2015) menyatakan bahwa kandungan nutrisi jerami padi adalah abu 19.79%, protein kasar 4.99%, lemak kasar 1.45%, serat kasar 28.71% dan bahan ekstrak tanpa nitrogen 45.06%. Penggunaan jerami padi sebagai pakan masih sangat rendah karena rendahnya nilai kecernaan akibat kandungan lignin dan silika (Van Soest 2006). Jerami jagung atau brangkasan ialah bagian batang dan daun jaagung yang telah mengering di ladang saat setelah panen. Jerami jagung ini umumnya banyak dijumpai di daerah sentra tanaman jagung yang diproduksi untuk jagung bibit atau jagung untuk industri pakan, bukan sebagai jagung yang dikonsumsi sebagai sayur (Mariyono et al. 2004). Jerami jagung yang dapat digunakan sebagai pakan ternak menurut Wulandari (2015) terdiri dari daun dan batang (55.46%), yaitu bagian tanaman jagung yang tersisa setelah diambil tonggol jagungnya sebagai bahan pangan (44.54%). Kandungan nutrien jerami jagung yaitu abu 8.19%, protein kasar 5.77%, lemak kasar 2.32%, serat kasar 38% dan bahan ekstrak tanpa nitrogen 45.72% (Wulandari 2015). Tongkol jagung mengandung 30.91% hemiselulosa, 26.81% α-selulosa, 15.52% lignin, 39.80% total karbon dan 2.12% total nitrogen (Septiningrum dan Apriana 2011). Jerami kacang kedelai yang dapat digunakan sebagai pakan ternak terdiri dari kulit kacang dan daun (22.40%). Kandungan nutrien jerami kacang kedelai yaitu abu 5.23%, protein kasar 27.85%, lemak kasar 9.47%, serat kasar 18.55% dan bahan ekstrak tanpa nitrogen 38.89% (Antorida 2014). Komposisi serat jerami kedelai tersusun dari 24.99% selulosa, 11.91% hemiselulosa dan 17.64% lignin (Xu et al. 2007). Bagas ialah bahan berserat yang merupakan residu batang tebu setelah proses pengepresan dan ekstraksi pada industri gula. Menurut Pandey et al. (2000) bagas tebu biasanya digunakan oleh industri gula itu sendiri sebagai sumber energi pada pakan broiler. Bagase tebu umumnya telah digunakan pada berbagai industri diantaranya untuk generator listrik, produksi bubur kayu dan kertas, serta industri berbasis fermentasi. Salah satu aplikasi pemanfaatan bagas tebu yang cukup signifikan ialah untuk produksi bioetanol, pakan sapi dengan pengkayaan protein dan juga enzim. Bagas tebu merupakan hasil samping industri gula yang tersedia dalam jumlah cukup besar dan memiliki kandungan selulosa 50%, hemiselulosa 25% dan lignin 25% (Pandey et al. 2000). Bagas tebu mengandung sekitar 50% α- selulosa, 30% pentosan dan 2.4 % abu. Kandungan abu yang rendah pada bagas tebu menjadi keunggulan sendiri dalam pemanfaatannya untuk biokonversi bahan organik menggunakan kultur mikroba dibandingkan jerami padi dan jerami jagung. Beberapa jenis mikroorganisme seperti bakteri, khamir dan fungi telah dikultivasi pada bagase tebu, namun yang paling banyak digunakan ialah jamur dari kelas basidiomycetes. Bagas tebu belum dapat diadikaaan sebagai komponen utama dalam ransum. Penggunaannya dalam ransum masih dalam level sedang yakni kurang dari tiga puluh persen (Kuswandi 2007). 5 Enzim Lignoselulase Enzim pendegradasi lignoselulosa diantaranya terdiri dari enzim selululolitik, xilanolitik dan lignolitik. Aktivitas enzim selulase dihasilkan dari sistem kompleks

20 6 enzim yang tersusun dari endo-β-d-1,4-glukanase (EC ) atau CMCase, eksoβ-d-1,4-glukanase (EC ) atau selobiohidrolase dan β-d-1,4-glukosidase (EC ) atau selobiase (Shankar dan Isaiarasu 2011). CMCase memiliki kemampuan mendegradasi secara acak permukaan substrat selulosa melalui hidrolisa ikatan β-1,4 glikosidik dan menghasilkan berbagai macam produk tak larut dengan derajat polimerisasi yang berbeda. Sedangkan selobiohidrolase hanya mampu menghidrolisa dari ujung polimer atau hasil reduksi, melepaskan suatu produk terlarut yakni selobiosa. Enzim selobiase berfungsi sebagai katalis pada hidrolisis sustrat terlarut seperti selobiosa dan selooligosakarida dengan derajat polimerisasi rendah (<7) menjadi selobiosa dan glukosa (Silveira et al. 2012). Hasil riset Pakdeedashakiat et al. (2008) menunjukkan bahwa limbah pertanian yang juga merupakan bahan lignoselulosa mungkin dapat menjadi alternatif untuk menekan biaya produksi enzim. Xilan dapat didegradasi oleh 1,4- β-d-xilan xilanohidrolase (EC ) atau xilanase dan 1,4- β-d-xilan xilohidrolase (EC ) atau β-xilosidase. Fungsi xilanase yakni untuk memecah xilan menjadi xilooligosakarida ataupun xilosa, sedangkan β-xilosidase berfungsi untuk memutus ikatan ujung xilooligosakarida menjadi gula reduksi (Nakamura et al. 1993). Ada tiga macam enzim lignolitik, yaitu lignin peroksidase (LiP), mangan peroksidase (MnP) dan lakase (Yesiladali et al. 2005). LiP mengoksidasi unit fenolik melalui pelepasan satu elektron dan menghasilkan radikal kation sehingga akan terjadi penguraian secara kimiawi. Proses ini akan memecah ikatan C-C dan C-O, mendepolimerisasi senyawa polimer dan akhirnya akan membuka cincin aromatik (Ilmi dan Kuswytasari 2013). Paenibacillus sp. Setiap jenis bakteri memiliki kemampuan berbeda dalam menghasilkan kompleks enzim tergantung pada faktor genetik dan sumber karbon yang digunakan dalam media pertumbuhannya (Nakamura et al. 1993). Kemampuan bakteri dalam mendegradasi suatu senyawa kimia dapat dilihat dari habitat asalnya. Bakteri dekomposer yang diisolasi dari tanah atau saluran pencernaan organisme tanah seperti rayap umumnya memiliki kemampuan aktivitas enzim selulolitik dan lignolitik sebagaimana sifat makanan yang dimakannya. Paenibacillus sp. merupakan salah satu jenis bakteri yang banyak ditemukan pada tanah dan saluran pencernaan rayap. Penelitian lain menyebutkan bahwa genus ini banyak ditemukan di ladang pertanian dan jaringan tanaman. Beberapa populasi memiliki peran dalam menekan patogen tanaman dan serangga dengan menghasilkan antibiotik. Beberapa strain yang lain memiliki kemampuan dalam menstimulus penyerapan nutrien oleh tanaman melalui pengikatan nitrogen yang menstimulus simbiosis rizobium daan mikoriza (Gardener 2004). Isobe (2010) menerangkan bahwa Paenibacillus sp. AIU 311 menghasilkan enzim kelompok oksidase yang mengkonversi glikoaldehida menjadi glioksal. Chandra et al. (2008) mengisolasi delapan strain bakteri aerobik dari limbah kertas pulp dan menemukan dua genus yang memiliki toleransi paling baik ketika ditumbuhkan pada media mengandung lignin, yakni Bacillus sp. dan Paenibacillus sp. Potensi menghasilkan enzim endo-1,4-β-xilanase ditemukan pada Paenibacillus terrae HPL-003, namun hidrolisis xilan yang dihasilkan berbeda dari beech wood, birch wood dana oat spelt (Kim et al. 2016).

21 Ekspresi kode genetik XylX 41kDa dari Paenibacillus campinasensis memiliki kemampuan menghidrolisis glikosida dengan aktivitas xilanase 2392 IU/mg, Km 6.78 mg ml -1, Vmax 4953 mol menit -1 m -1 padaa kondisi optimum di ph 7 dan suhu 60 C (Ko et al. 2010). Imongjairak et al. (2015) menjelaskan potensi Paenibacillus curdlanolyticus dalam menghasilkan enzim xilanase yang aktif memecah xilan terlarut asal birchwood, rye, dan oat spelt serta pada xilan tidak terlarut asal arabinoxilan gandum. Potensi lain dari Paenibacillus spp. dijelaskan oleh rediansyah dan Sudiana (2013) yang menerangkan bahwa bakteri ini dapat digunakan sebagai agen pupuk hayati pada lahan gambut karena memiliki kemampuan memproduksi hormon pertumbuhan (indole acetic acid) dan melarutkan kalsium fosfat maupun aluminium fosfat. Tabel 1 Contoh isolat Paenibacillus Bakteri Asal Isolasi Sumber Paenibacillus Saluran pencernaan rayap (Zootermopsis angusticollis) Kuhnigk et al. (1995); Kuhnigk (1996); Kuhnigk dan Konig (1997; Wenzel et al. (2002) Paenibacillus spp. Ladang pertanian Gardener (2004) Paenibacillus sp. Limbah kertas Chandra et al. (2008) Paenibacillus Tanah Thailand Akaracharaya et al. (2009) cellulositrophicus Paenbacillus durum Tanah gambut tropis Frediansyah dan Sudiana (2013) Paenibacillus polymyxa Tanah gambut tropis Frediansyah dan Sudiana (2013) Paenibacillus macerans Tanah gambut tropis Frediansyah dan Sudiana (2013) Paenibacillus azotofixans Tanah gambut tropis Frediansyah dan Sudiana (2013) Paenibacillus terrae Kayu lapuk Kim et al. (2016) Tabel 2 Aktivitas enzim isolat Paenibacillus Spesies Selulase Xilanase Sumber Paenibacillus curdlanolyticus 0.27 U/ml 3.01 U/ml Pakdeedashakiat et al Paenibacillus campinasensis IU/mg Ko et al Paenibacillus polymyxa U - Frediansyah dan Sudina (2013) Paenibacillus azotofixans U - Frediansyah dan Sudina (2013) 7 3 METODE Waktu dan Lokasi Penelitian Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Oktober 2017 sampai Juli Analisa proksimat dan van soest dilakukan di Laboratorium Ilmu dan Teknologi Pakan, pengamatan pertumbuhan bakteri dilakukan di Laboratorium Biokimia dan Mikrobiologi Nutrisi, uji aktivitas enzim dan gula reduksi dilakukan di Laboratorium Nutrisi Ternak Perah, Laboratorium Terpadu, dan Laboratorium Genetika Molekuler, Fakultas Peternakan IPB. Analisa gula total dilakukan di Laboratorium Pengujian Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Pascapanen Pertanian, Cimanggu, sedangkan analisa kerusakan fisik menggunakan scanning

22 8 electron microscope (SEM) dilakukan di Laboratorium Zoologi Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Cibinong, Bogor. Alat dan Bahan Alat yang digunakan pada penelitian ini antara lain mesin penggiling, test sieve Retsch 5657 Haan W. Germany, timbangan analitik, oven 60 C dan 110 C, tanur, laminar air flow, pipet volumetrik, ose, lampu spirtus, eppendorf 2 ml, autoklaf, inkubator suhu ruang, hotplate, magnetic stirer, water bath, circulating water bath, centrifuge 5415 R eppendorf, spektrofotometer LW Scientific Model UV-200-RS. Bahan utama pada penelitian ini antara lain isolat bakteri Paenibacillus sp. yang diperoleh dari LIPI Cibinong Bogor (InaCC B63, diisolasi dari tanah Hutan Lindung Mekongga, Tinukari, Kloaka Utara, Sulawesi Tenggara), jerami padi dan jerami jagung yang diperoleh dari Kebun Percobaan Muara Ciapus, jerami kedelai dari kebun di Desa Cikarawang Dramaga, serta bagas tebu dari kebun di daerah Kediri. Bahan penting lainnya yang digunakan adalah media pertumbuhan bakteri (polipepton, ekstrak khamir, K2HPO4, MgSO4.7H2O, nutrient broth, bacto agar), carboxymethyl cellulose (CMC), oat spelt xylan, dinitrosalysilic acid (DNS), veratril alkohol (SIGMA 3,4-dimethoxybenzyl alcohol 96%gr), D- glucose, D-xylose dan Tween 20. Prosedur Persiapan Sampel Jerami dan bagas tebu dikeringkan di bawah sinar matahari hingga kadar air ±12%. Jerami dan bagas tebu lalu digiling dan diayak menggunakan Test Sieve Retsch Mesh. No.30 dengan ukuran partikel 0.6 cm untuk dilakukan analisa komposisi kimia (proksimat dan van soest) dan Mesh No.100 dengan ukuran partikel 0.15 cm untuk digunakan sebagai inducer atau sumber karbon pada media pertumbuhan bakteri. Isolat bakteri Paenibacillus sp. ditumbuhkan pada medium nutrient agar (NA) selama tiga hari di suhu ruang, lalu disimpan pada suhu 4 C sebagai stok. Inokulum yang akan digunakan pada tahap perlakuan sebelumnya diremajakan terlebih dahulu dengan cara menginokulasikan satu ose inokulum stok ke dalam media NA yang baru lalu diinkubasi pada suhu ruang selama tiga hari. Analisa Komposisi Kimia Komposisi kimia jerami dan bagas tebu dianalisa menggunakan metode proksimat berdasarkan AOAC (2005). Selain itu juga dilakukan analisa Van Soest untuk mengetahui fraksi serat jerami dan bagas tebu (Van Soest et al. 1991). Pembuatan Media Perlakuan Bakteri ditumbuhkan pada enam jenis medium perlakuan yang terdiri dari nutrient broth (NB) dan lima jenis medium formulasi dengan komposisi dalam persen yakni pepton 0.5, ekstrak khamir 0.5, K2HPO4.3H2O 0.1, MgSO4.7H2O 0.02 dan sumber karbon 0.5 (Nakamura et al. 1993). Lima jenis sumber karbon yang digunakan adalah tepung jerami padi, jerami jagung, jerami kedelai, bagas tebu dan

23 carboxymethyl cellulose. Komposisi media ditimbang sesuai formulasi dan dimasukkan kedalam erlenmeyer, lalu ditambahkan akuades. Campuran bahan dan akuades dihomogenkan dan dipanaskan selama menit, lalu didiamkan pada suhu ruang. Setelah itu, larutan media disaring menggunakan kertas tissue untuk memisahkan fraksi serat kasar sehingga diperoleh larutan media berwarna jernih. Hal ini dimaksudkan untuk memudahkan pembacaan absorbansi pada saat pengukuran turbiditas menggunakan spektrofotometer. Pertumbuhan Bakteri Sebanyak satu loop inokulum diinokulasikan kedalam 4 ml medium perlakuan, lalu diinkubasi pada shaker water bath suhu 30 C selama tiga hari. Setiap delapan jam sekali dilakukan pengamatan turbiditas menggunakan spektrofotometer LW Scientific Model UV-200-RS pada panjang gelombang 600 nm (Frediansyah dan Sudiana 2013). Setelah diperoleh kurva pertumbuhan bakteri dari hasil pengamatan turbiditas, dilakukan juga pengamatan terhadap jumlah koloni. Bakteri diinokulasikan ke dalam 4 ml medium perlakuan dan diinkubasi pada shaker water bath suhu 30 C selama fase stasionernya, kemudian diambil sampel untuk pengamatan total plate count (Maturin dan Peeler 2001). Ekstraksi Enzim Sebanyak 25 loop inokulum diinokulasikan kedalam 100 ml medium perlakuan, lalu diinkubasi pada shaker water bath suhu 30 C hingga fase stasioner. Media yang telah mengandung bakteri selanjutnya disentrifugasi pada suhu dingin dengan kecepatan 5000 rpm selama lima belas menit. Supernatan dipisahkan dari pelet dan digunakan sebagai enzim kasar (Putri 2014). Uji Aktivitas Enzim Pengujian aktivitas selulase dan xilanase dilakukan dengan metode DNS. Sebanyak 0.03 ml filtrat enzim ditambahkan ke dalam tabung eppendorf berukuran 2 ml, lalu ditambahkan dengan 0.3 ml larutan substrat. Selanjutnya diinkubasi pada circulating water bath dengan suhu 40 C selama dua puluh menit, kemudian ditambahkan 0.15 ml larutan dinitrosalysilic acid (DNS) untuk menghentikan reaksi. Setelah itu disentrifugasi pada suhu dingin dengan kecepatan rpm selama 20 detik, kemudian dipanaskan pada air mendidih selama sepuluh menit dan diletakkan pada es balok selama lima menit. Alikuot ditambahkan dengan 2.5 ml akuades, dihomogenkan lalu dibaca absorbansinya menggunakan spektrofotmeter LW Scientific Model UV-200-RS pada panjang gelombang 530 nm (Konig 2002). Aktivitas enzim dihitung berdasarkan rumus berikut : Aktivitas enzim = Keterangan : D = faktor pengenceran (dilution) V = volume (100 ml) m = gradien kurva standar W = berat enzim t = waktu inkubasi (menit) OD 530 D V m W t 9

24 10 Pengukuran gula reduksi dilakukan dengan memasukkan perolehan nilai absorban kedalam kurva standar D-glucose. Kurva standar D-glucose atau D-xylose diperoleh dengan melakukan pembacaan absorbansi larutan standar pada konsentrasi berbeda (2.5, 5, 7.5, 10, 12.5, 15 mmol L -1 ). Pengujian aktivitas lignin peroksidase (LiP) mengacu pada Arora dan Gill (2001). Sebanyak 1 ml asam tartarat 125 mm, 0.5 ml veratril alkohol 10 mm, 0.5 ml H2O2 2 mm dan 0.5 ml enzim kasar dihomogenkan dan didiamkan selama 30 menit. Selanjutnya dilakukan pembacaan absorbnsi pada panjang gelombang 310 nm pada waktu 0 dan 30 menit. Aplikasi Penambahan Enzim pada Tepung Jerami atau Bagas Tebu Aplikasi penambahan enzim dilakukan berdasarkan hasil terbaik pada pengamatan uji aktivitas enzim atau gula reduksi. Satu sampel terbaik dari jerami atau bagas tebu dipilih untuk diberi perlakuan enzim dengan dosis 5 IU per gram selulosa (Alvira et al. 2011). Sebanyak 10 gram bahan kering ditambahkan dengan 25 ml enzim kasar. Penambahan enzim dilakukan dengan cara disemprot atau spray. Bahan yang telah ditambahkan enzim diinkubasi pada suhu ruang selama dua hari, lalu dilakukan uji gula reduksi dan pengamatan fisik menggunakan scanning electron microscope (SEM). Paenibacillus sp. Pertumbuhan Bakteri Total Plate Count Turbidimetrik Ekstraksi Enzim Kasar Uji Aktivitas Selulase Uji Aktivitas Xilanase Uji Lignin Peroksidase Gula Reduksi Sumber Karbon Analisa Proksimat dan Van Soest Substrat Jerami Padi Jerami Jagung Jerami Kedelai Bagas Tebu Interaksi Terbaik Jerami atau Bagas Tebu + Enzim Gula Reduksi Mikroskop SEM Gambar 1 Bagan alir penelitian

25 11 Rancangan Percobaan Rancangan percobaan pada tahap pengamatan pertumbuhan bakteri dan pengujian aktivitas enzim selulase, xilanase dan lignin peroksidase menggunakan rancangan acak lengkap dengan enam perlakuan dan tiga ulangan. Perlakuan yang digunakan ialah media pertumbuhan bakteri dengan sumber karbon berbeda. Berikut adalah enam jenis media pertumbuhan yang digunakan sebagai perlakuan: P1 (JP) P2 (JJ) P3 (JK) P4 (BT) P5 (NB) P6 (CMC) : peptone 0.5%, ekstrak khamir 0.5%, K2HPO4 0.1%, MgSO4.7H2O 0.02%, jerami padi 0.5% : peptone 0.5%, ekstrak khamir 0.5%, K2HPO4 0.1%, MgSO4.7H2O 0.02%, jerami jagung 0.5% : peptone 0.5%, ekstrak khamir 0.5%, K2HPO4 0.1%, MgSO4.7H2O 0.02%, jerami kedelai 0.5% : peptone 0.5%, ekstrak khamir 0.5%, K2HPO4 0.1%, MgSO4.7H2O 0.02%, bagas tebu 0.5% : nutrient broth : peptone 0.5%, ekstrak khamir 0.5%, K2HPO4 0.1%, MgSO4.7H2O 0.02%, carboxymethyl cellulose 0.5% Model matematika yang digunakan adalah sebagai berikut : Yijk = μ + αi + εij Keterangan : Yijk = jumlah koloni; aktivitas enzim selulase, xilanase dan lignin peroksidase μ = nilai tengah populasi αi = pengaruh medium pertumbuhan ke-i i = jenis medium pertumbuhan bakteri εij = komponen galat oleh faktor jenis medium pertumbuhan ke-i dan ulangan ke-j Rancangan percobaan pada tahap uji gula reduksi menggunakan rancangan acak lengkap pola faktorial dengan dua faktor dan tiga ulangan. Faktor pertama ialah jenis medium pertumbuhan bakteri dan faktor kedua jenis substrat pada uji gula reduksi. Berikut adalah enam jenis medium pertumbuhan bakteri yang digunakan sebagai faktor pertama: P1 (JP) P2 (JJ) P3 (JK) P4 (BT) P5 (NB) P6 (CMC) : peptone 0.5%, ekstrak khamir 0.5%, K2HPO4 0.1%, MgSO4.7H2O 0.02%, jerami padi 0.5% : peptone 0.5%, ekstrak khamir 0.5%, K2HPO4 0.1%, MgSO4.7H2O 0.02%, jerami jagung 0.5% : peptone 0.5%, ekstrak khamir 0.5%, K2HPO4 0.1%, MgSO4.7H2O 0.02%, jerami kedelai 0.5% : peptone 0.5%, ekstrak khamir 0.5%, K2HPO4 0.1%, MgSO4.7H2O 0.02%, bagas tebu 0.5% : nutrient broth : peptone 0.5%, ekstrak khamir 0.5%, K2HPO4 0.1%, MgSO4.7H2O 0.02%, carboxymethyl cellulose 0.5%

26 12 Berikut adalah empat jenis substrat yang digunakan sebagai faktor kedua: S1 (JP) : jerami padi S2 (JJ) : jerami jagung S3 (JK) : jerami kedelai S4 (BT) : bagas tebu Berikut adalah model matematika yang digunakan pada pola rancangan acak lengkap pola faktorial: Yijk = μ + αi + βj + (αβ)ij + εijk Keterangan : Yijk = gula reduksi μ = nilai tengah populasi αi = pengaruh medium pertumbuhan ke-i βj = pengaruh jenis substrat ke-j i = jenis medium pertumbuhan bakteri j = jenis substrat (αβ)ij = pengaruh interaksi jenis medium pertumbuhan ke-i dan jenis substrat ke-j εijk = komponen galat oleh faktor medium pertumbuhan ke-i, jenis substrat ke-j dan ulangan ke-k Analisis Data Data yang diperoleh dianalisa secara statistik mengunakan analisis ragam (analysis of variance, ANOVA) dan jika ada perbedaan nyata akan dilakukan uji lanjut Duncan dan atau Tukey (Steel dan Torrie 1993). Analisis data dilakukan menggunakan software Minitab 16 dan SAS HASIL DAN PEMBAHASAN Keberlangsungan makhluk hidup berkaitan erat dengan berbagai macam reaksi kimia yang berkelanjutan. Oleh sebab itu, tanaman hijau mensintesis komoponen kimia seperti protein, lemak, dan karbohidrat sebagai bentuk penyimpanan energi. Selanjutnya komponen ini akan dipecah oleh tanaman itu sendiri atau oleh hewan yang akan mengonsumsinya, untuk selanjutnya digunakan sebagai sumber energi (McDonald 2010). Penelitian diawali dengan analisis komposisi kimia dan fraksi serat, serta pengamatan scanning electron microscope (SEM) kenampakan fisik tepung jerami padi, jerami jagung, jerami kedelai dan bagas tebu. Kandungan serat kasar dari keempat bahan berkisar antara % (Tabel 3). Secara umum selulosa menjadi fraksi serat terbesar dengan jumlah sekitar % (Tabel 4). Kenampakan serat secara fisik dari keempat bahan cukup berbeda. Jerami padi dan jerami kedelai cenderung memiliki struktur

27 yang lebih kompak dan kaku dibandingkan jerami jagung dan bagas tebu (Gambar 5-8). Tabel 3 Komposisi kimia beberapa hasil samping pertanian (dry matter) Hasil samping pertanian BK (%) Abu (%) PK (%) LK (%) SK (%) BETN (%) Jerami padi Jerami jagung Jerami kedelai Bagas tebu Keterangan : BK = bahan kering ; PK = protein kasar ; LK = lemak kasar ; SK = serat kasar ; BETN = bahan ekstrak tanpa nitrogen 13 Komposisi Kimia Jerami padi memiliki kadar abu yang cukup tinggi dibandingkan ketiga bahan lainnya. Secara umum, protein kaasar pada jerami padi dan jerami jagung lebih tinggi dibandingkan jerami kedelai dan bagas tebu. Keempat bahan mengandung lemak kasar cukup rendah, yakni kurang dari satu persen. Serat kasar menjadi komposisi terbesar pada keempat hasil samping pertanian ini. Serat kasar merupakan representasi dari lignoselulosa yang terkandung pada tanaman. Dalam bidang peternakan, serat kasar sering kali menjadi pembatas dalam hal efisiensi pakan ternak (Sarnklong et al. 2010; Nguyen et al. 2010). Kandungan serat kasar pada hasil samping pertanian telah dijelaskan pada beberapa penelitian lainnya. Kandungan serat kasar jerami padi berkisar antara % (Adlan 2015; Prasetiyono et al. 2007). Kandungan serat kasar jerami jagung, jerami kedelai, dan bagas tebu yang diperoleh pada penelitian ini tidak jauh berbeda dengan hasil penelitian lainnya (Umiyasih dan Wina 2008). Kandungan serat kasar yang berbeda dapat disebabkan oleh keragaman dan perbedaan proporsi dinding sel tanaman dimana jumlahnya dipengaruhi oleh jenis spesies dan fase pertumbuhan tanaman itu sendiri (McDonald et al. 2010). Serat kasar merupakan karbohidrat struktural yang umumnya digunakan sebagai indikator negatif kualitas bahan pakan dalam bidang nutrisi ternak, namun pada beberapa tanaman seperti hijauan tropis dan jerami, serat kasar tidak sepenuhnya merepresentasikan nilai kecernaan (McDonald et al. 2010). Fraksi Serat Kasar Analisa van soest memisahkan fraksi serat kasar berdasarkan nilai nutrisinya, fraksi ini lebih mencerminkan kualitas nutrisi hijuan (Cherney 2000). Kandungan selulosa jerami padi pada penelitian ini hampir sama dengan yang dilaporkan oleh penelitian lainnya (Binod et al 2010, Jin dan Chen 2007), sementara kandungan selulosa jerami jagung dan jerami kedelai lebih kecil dibandingkan yang dilaporkan oleh Zhong et al. (2011). Bagas tebu pada penelitian ini mengandung selulosa lebih tinggi dibandingkan yang dilaporkan oleh Dawson dan Boopathy (2008) dan Ernes et al. (2014), yakni berkisar %. Kadar selulosa yang tinggi pada bagas tebu mengindikasikan adanya potensi dalam pemanfaatannya sebagai pakan (Reddy dan Yang 2005). Selulosa ialah polimer glukosa dengan ikatan β-1,4 glikosidik. Sesuai dengan proporsinya yang cukup besar di dalam lignoselulosa, selulosa menjadi komponen terbesar yang tersedia jumlahnya di alam (Shankar dan Isaiarasu 2011).

28 14 Selulosa dapat dijadikan sebagai sumber energi yang potensial bagi berbagai jenis mikroorganisme untuk menghasilkan produk, misalnya enzim (Shahzadi et al. 2014). Melalui proses biokonversi, selulosa dapat diubah bentuk menjadi glukosa yang digunakan sebagai sumber energi. Kadar hemiselulosa jerami padi dan bagas tebu pada penelitian ini secara umum tidak berbeda dengan penelitian lainnya (Jin dan Chen 2007; Zhong et al. 2011). Jerami kedelai memiliki kadar hemiselulosa lebih rendah dibandingkan penelitian lain (Maheri-Sis et al. 2011). Sedangkan jerami jagung mengandung hemiselulosa yang lebih tinggi dibandingkan dengan yang dilaporkan oleh Zhong et al. (2011). Hemiselulosa menempati ruang antara selulosa dan lignin. Menurut Shahzadi et al. (2014), hemiselulosa ialah makromolekul yang pada umumnya tersusun dari rangkaian polimer pentosa dan heksosa. Komponen ini umumnya tersusun dari glukosa, xilosa, galaktosa, arabinosa dan manosa (Reddy dan Yang 2005). Dua komponen yang paling banyak menyusun hemiselulosa ialah xilan dan mannan (Shahzadi et al. 2014). McDonald (2010) mendeskripsikan hemiselulosa sebagai suatu polisakarida dinding sel tanaman, bersifat alkali, dan berkaitan erat dengan selulosa. Kandungan lignin jerami padi pada penelitian ini (15.52%) lebih tinggi dibandingkan penelitian lain dengan kadar lignin berkisar % (Jin dan Chen 2006; Jin dan Chen 2007). Kandungan lignin jerami jagung dan jerami kedelai yang diperoleh pada penelitian ini relatif sama dengan penelitian lain (Zhong et al. 2011; Zhong et al. 2012; Reddy dan Yang 2009; Xu et al. 2007). Sedangkan kandungan lignin pada bagas tebu (7.27%) tiga kali lebih rendah dibandingkan yang dijelaskan oleh Dawson dan Boopathy (2008) dan Ernes et al. (2014), yakni %. Lignin menjadi salah satu fokus dalam bidang nutrisi ternak karena proteksinya terhadap degradasi kimia. Fungsinya adalah sebagai lapisan fisik serat tanaman sehingga menyebabkan enzim tidak mampu menjangkau komponen sel di dalamnya dan menjadi sulit dicerna (McDonald 2010). Lignin tersusun dari tiga komponen alkohol aromatik (coniferyl, sinapyl, p-coumaryl) yang dihasilkan dari proses biosintesis dan membentuk suatu kompleks yang menutupi area di sekitar selulosa dan hemiselulosa (Shahzadi et al. 2014). Zijlstra et al. (2010) menerangkan bahwa dalam ilmu nutrisi ternak, peranan serat keseluruhan memang telah banyak diketahui, namun mekanisme dari masing-masing fraksi serat terkait dengan proses pencernaan seperti kompleksitas laju digesta, populasi mikroba rumen, dan kesehatan saluran pencernaan masih memerlukan penelitian lebih lanjut. Tabel 4 Fraksi serat beberapa hasil samping pertanian (dry matter) Hasil samping pertanian Seluosa (%) Hemiselulosa (%) Lignin (%) Silika (%) Jerami padi Jerami jagung Jerami kedelai Bagas tebu Kenampakan Fisik Keempat hasil samping pertanian memiliki kenampakan serat yang cukup berbeda. Jerami padi dan jerami kedelai terlihat lebih kaku dan memiliki

29 kristalinitas yang lebih tinggi dibandingkan jerami kedelai dan bagas tebu. Hal ini dapat disebabkan oleh kadar lignin kedua bahan yang cukup tinggi (Tabel 4). 15 (a) (b) Gambar 2 SEM tepung jerami padi: (a) perbesaran 500x; (b) perbesaran 1000x (a) (b) Gambar 3 SEM tepung jerami jagung: (a) perbesaran 500x; (b) perbesaran 1000x (a) (b) Gambar 4 SEM tepung jerami kedelai: (a) perbesaran 500x; (b) perbesaran 1000x (a) (b) Gambar 5 SEM tepung bagas tebu: (a) perbesaran 500x; (b) perbesaran 1000x

30 16 Kenampakan serat pada jerami jagung dan bagase tebu cenderung lebih halus. Hal ini diduga disebabkan oleh kadar ligninnya yang cukup rendah dibandingkan jerami padi dan jerami kedelai (Tabel 4). Faktor kristalinitas bahan juga dapat disebabkan oleh adanya ikatan hidrogen pada area selulosa yang terikat bersama-sama membentuk rantai paralel. Keberadaan area kristalin menyebabkan substrat tidak mudah diakses oleh enzim. Substrat yang memiliki sifat kristalin akan lebih resisten terhadap deradasi enzim. Namun, pada penilitian lain juga dilaporkan bahwa derajat kristalinitas tidak mengalami perubahan selama proses hidrolisis, hal ini diduga disebabkan oleh adanya lignin pada kompleks substrat yang memiliki efek negatif terhadap proses hidrolisis (Eriksson 2002). Gambar 6 Jerami padi Gambar 7 Jerami jagung Gambar 8 Jerami kedelai Gambar 9 Bagas tebu Lignin merupakan polisakarida penyusun bahan berkayu yang menjadi indikator tingkat kekerasan suatu bahan. Semakin tinggi kandungan lignin suatu bahan, akan semakin keras teksturnya. Misalnya, kayu lunak normal mengandung lignin sekitar 26-32%, sedangkan kayu tekan mengandung lignin sebesar 35-40% (Sjostrom 1995). Berdasarkan data kandungan lignin pada Tabel 2, diasumsikan bahwa persentase lignin jerami padi, jerami jagung, jerami kedelai dan bagas tebu terhadap kayu lunak (kayu berdaun jarum, golongan gymnospermae) berturut-turut adalah 53.52%, 27.55%, 45.48% dan 25.07%, sedangkan persentasenya terhadap kayu tekan (kayu berdaun lebar, golongan angiospermae dikotiledon) yakni 41.39%, 21.31%, 35.17%, dan 19.39% (Iswanto 2008). Nilai tersebut dapat dijadikan asumsi dalam mengukur tingkat kekerasan keempat hasil pertanian. Pertumbuhan Bakteri Tahap kedua pada percobaan ini yakni mengamati pertumbuhan bakteri yang diadaptasikan pada media dengan sumber karbon berupa jerami padi, jerami jagung, jerami kedelai, dan bagas tebu serta dua media komersil sebagai kontrol atau

31 Absorbansi (A) pembanding. Penggunaan jerami padi, jerami jagung, jerami kedelai dan bagas tebu sebagai sumber karbon diharapkan dapat menginduksi enzim yang dihasilkan agar mampu mendegradasi substrat yang dimaksud. Adaptasi populasi bakteri dapat menjadi alternatif untuk menginduksi enzim, yakni melalui seleksi jenis sel yang mampu menghasilkan enzim yang sesuai dengan kebutuhan untuk tumbuh di dalam media tersebut (Wiseman 1975). Paenibacillus sp. yang ditumbuhkan pada media dengan sumber karbon berbeda menghasilkan jumlah koloni yang berbeda pula (P<0.05). Media dengan sumber karbon bagas tebu menghasilkan jumlah koloni paling banyak, sedangkan pada media yang menggunakan jerami jagung menghasilkan jumlah koloni paling sedikit (Tabel 5). Hasil pengamatan turbiditas menunjukkan bahwa kurva pertumbuhan bakteri dengan media NB berada pada level paling bawah, lalu diatasnya terdapat kurva JP. Kurva CMC, JJ dan BT berada pada level yang hampir sama, sedangkana pada level paling atas ditempati oleh kurva JK (Gambar 10) ,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0, Waktu (jam) Gambar 10 Pertumbuhan Paenibacillus sp. pada media perlakuan JP JJ JK BT NB CMC Tabel 5 Jumlah koloni Paenibacillus sp. (fase stasioner) Jenis media / sumber karbon Waktu inkubasi Jumlah koloni (jam) (x 10 5 CFU ml -1 ) Jerami padi (JP) 57 99b Jerami jagung (JJ) d Jerami kedelai (JK) c Bagas tebu (BT) a Nutrient broth (NB) 51 25cd Carboxy methyl cellulose (CMC) ab a Angka-angka pada kolom yang sama yang diikuti oleh huruf yang sama tidak berbeda nyata pada taraf uji 5% (uji Duncan) Pertumbuhan bakteri merupakan salah satu metode percobaan biokimia (Monod 1949). Pengamatan pertumbuhan bakteri dilakukan terhadap dua parameter, yakni total bakteri yang mencerminkan konsentrasi sel dan turbiditas atau kekeruhan yang merepresentasikan berat jenis sel. Dalam hal kimia bakteri, metabolisme dan nutrisi, variabel berat jenis sel merupakan variabel yang signifikan. Konsentrasi sel yang tidak linier terhdap berat jenis pada penelitian ini diduga disebabkan oleh perubahan rata-rata ukuran sel yang berubah seiring interval waktu

32 18 pertumbuhan. Rata-rata ukuran sel akan berubah pada setiap fase dalam suatu siklus pertumbuhan (Monod 1949). Setiap mikroorganisme hidup membutuhkan nutrisi untuk menjalankan fungsi dan pertumbuhan selnya secara normal. Substrat yang tepat akan mampu menyediakan nutrisi untuk pertumbuhan optimum bakteri. Media dengan sumber karbon bagas tebu menghasilkan pertumbuhan tertinggi berdasarkan jumlah koloninya. Selain itu, nilai turbiditas pada kurva pertumbuhan bakteri juga menunjukkan bahwa media tersebut menghasilkan pertumbuhan paling cepat di fase eksponensial. Hal ini dapat disebabkan oleh kualitas nutrien bagas tebu yang cukup baik, yakni mengandung selulosa tinggi serta abu, lignin dan silika yang rendah. Kandungan selulosa yang cukup tinggi menjadi potensial dalam pemanfaatannya sebagai sumber karbon, selain itu kandungan abu yang rendah juga memberikan keuntungan dalam aplikasi penggunaannya dalam proses biokonversi menggunakan kultur bakteri (Pandey et al. 2000). Kandungan lignin dan silika yang rendah semakin meningkatkan ketersediaan nutrisi bagas tebu. Lignin merupakan rantai panjang unit fenil propana yang berfungsi sebagai pengisi ruang antara selulosa dan hemiselulosa. Lignin mengikat bagian dinding sel tanaman yang membuatnya tidak dapat dijangkau oleh enzim yang akan mendegradasi komponen sel, sehingga tidak dapat dicerna (Shahzadi et al. 2014). Aktivitas Enzim Bakteri yang telah ditumbuhkan pada media perlakuan selanjutnya diekstraksi enzim kasarnya. Enzim kasar yang diperoleh kemudian diukur aktivitasnya dalam mendegradasi lignoselulosa, yakni meliputi aktivitas selulase, xilanase dan lignin peroksidase. Pemberian jerami atau bagas tebu sebagai sumber karbon medium pertumbuhan bakteri memberikan pengaruh yang berbeda nyata terhadap aktivitas selulase dan xilanase (P<0.05). Aktivitas selulase tertinggi dihasilkan oleh medium pertumbuhan yang disuplementasi dengan carboxy methyl cellulose (0.51 U ml -1 ). Hal ini sejalan dengan penelitian Narasimhaet al. (2006) yang menerangkan bahwa carboxymethyl cellulose menyediakan sumber karbon terbaik (selulosa) untuk produksi selulase oleh A. niger dengan aktivitas CMCase sebesar U ml -1. Bagas tebu menghasilkan aktivitas selulase lebih tinggi (22.83 U g -1 ) dibandingkan jerami padi, jerami jagung dan jerami kedelai. Hasil ini selaras dengan kandungan selulosa pada bagas tebu (42.27%) yang jauh lebih tinggi dibandingkan ketiga bahan lainnya (Tabel 4). Hasil yang diperoleh menunjukkan adanya korelasi positif (93.24%) antara kandungan selulosa dan aktivitas selulase yang dihasilkan oleh bakteri (Gambar 11). Sumber karbon dengan menggunakan jerami padi menghasilkan aktivitas selulase terkecil (Tabel 6). Hal ini sejalan dengan Pakdeedashakiat et al. (2008) yang menemukan bahwa aktivitas selulase terendah oleh Paenibacillus curdlanolyticus diperoleh pada medium yang disuplementasi jerami padi. Pada penelitian lain, penggunaan serbuk gergaji sebagai sumber karbon menghasilkan aktivitas FPase dan CMCase (0.775 U ml -1 ) yang lebih tinggi dibandingkan penggunaan sumber karbon dengan daun kering tembakau dan jerami padi (Narasimha et al. 2006). Penggunaan selulosa murni sebagai substrat dalam produksi selulase skala besar menjadi hal yang tidak ekonomis (Narasimha et al. 2006). Pemanfaatan biomasa lignoselulosa sebagai

33 Aktivitas Selulase (IU/ml) sumber karbon pertumbuhan bakteri penghasil selulase dapat menjadi alternatif untuk meminimalisir biaya produksi. Aktivitas xilanase tertinggi dihasilkan oleh medium pertumbuhan nutrient broth dengan aktivitas sebesar 0.27 IU ml -1. Nilai ini tidak berbeda dengan Richana et al. (2008) yang melaporkan bahwa aktivitas xilanase oleh 25 koloni asal isolasi tanah tempat pembuangan limbah tapioka atau onggok berkisara antara U ml -1. Nutrient broth merupakan medium komersil pertumbuhan bakteri kaya nutrisi yang telah umum digunakan untuk menumbuhkan berbagai jenis bakteri (Ohta dan Hattori 1979). Aktivitas xilanase yang dihasilkan pada medium pertumbuhan dengan substrat jerami padi, jerami jagung, jerami kedelai atau bagas tebu tidak berbeda nyata (P>0.05), namun secara deskriptif bagas tebu menghasilkan aktivitas lebih tinggi. Xilanase merupakan enzim ekstrseluler yang dapat menghidrolisis xilan menjadi xilo-oligosakarida atau xilosa (Richana 2008). Menurut beberapa penelitian lainnya, hasil samping pertanian yang cukup potensial dijadikan sebagai sumber karbon untuk produksi xilanase ialah jerami gandum (Nagar et al. 2011; Okafor et al. 2007). Jenis substrat jerami atau bagas tebu tidak berpengaruh nyata terhadap aktivitas lignin peroksidase (P>0.05). Secara deskriptif medium nutrient broth menghasilkan aktivitas lignin peroksidase tertinggi. Namun, dibandingkan ketiga bahan lignoselulosa lainnya, bagas tebu menghasilkan aktivitas lignin peroksidase yang lebih tinggi (Tabel 6). Tabel 6 Aktivitas selulase, xilanase dan LiP enzim kasar Paenibacillus sp. Jenis medium pertumbuhan Selulase (IU ml -1 ) Xilanase (IU ml -1 ) LiP (U) Jerami padi (JP) 0.06c 0.00b Jerami jagung (JJ) 0.09c 0.03b Jerami kedelai (JK) 0.26b 0.04b Bagas tebu (BT) 0.34b 0.05b Nutrient broth (NB) 0.34b 0.27a Carboxy methyl cellulose (CMC) 0.51a 0.01b a Angka-angka pada kolom yang sama yang diikuti oleh huruf yang sama tidak berbeda nyata pada taraf uji 5% (uji Duncan) 19 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 y = 0,0271x - 0,7833 R² = 0, Selulosa (%) Gambar 11 Korelasi kadar selulosa dan aktivitas selulase Selain aktivitas selulase, xilanase, dan liginin peroksidse, kemampuan spesifik enzim dalam mendegradasi masing-masing hasil samping pertanian dapat dilihat dari jumlah gula reduksi yang dihasilkan. Gula reduksi merupakan produk yang dihasilkan dari proses hidrolisis karbohidrat. Oleh sebab itu, gula reduksi

34 20 dijadikan sebagai indikator terjadinya aktivitas enzim dalam mendegradasi substrat. Menurut Shao dan Lin (2017), gula reduksi adalah jenis gula yang mengandung gugus hemiasetal atau hemiketal bebas. Berikut akan disajikan data gula total dari keempat hasil samping pertanian serta hasil pengukuran jumlah gula reduksi yang dihasilkan oleh enzim kasar Paenibacillus sp. dalam mendegradasi substrat jerami padi, jerami jagung, jerami kedelai dan bagas tebu : Tabel 7 Kadar gula beberapa hasil samping pertanian Bahan Gula total (%) Jerami padi 0.71 Jerami jagung 1.14 Jerami kedelai 0.56 Bagas tebu 3.05 Kadar gula total keempat hasil pertanian berkisar antara %. Nilai ini tidak jauh berbeda dengan kadar gula total pada jenis tanaman hijauan pakan seperti rumput gajah, yakni berkisar antara % (Budiman et al. 2011) dan cenderung lebih rendah dibandingkan kadar gula pada tanaman berkayu ( %) (Chow dan Landhausser 2004). Secara umum jerami padi memiliki kandungan gula yang lebih tinggi, kemudian diikuti oleh bagas tebu, jerami jagung dan jerami kedelai. Kadar gula total yang tinggi pada jerami padi diduga disebabkan oleh kandungan selulosa dan hemiseluosa yang juga cukup tinggi pada jerami padi (Tabel 4). Kadar gula total pada keempat hasil pertanian memiliki kecenderungan berkorelasi positif terhadap jumlah kadar selulosa dan hemiselulosa. Semakin besar jumlah kadar selulosa dan hemiselulosa, semakin tinggi pula kadar gula totalnya. Ekstrak tanaman mengandung beberapa macam gula seperti glukosa, fruktosa, galaktosa, sukrosa, maltosa, melibiosa, rafinosa dan stakiosa. (Chow dan Landhausser 2004). Pengamatan gula reduksi dilakukan menggunakan rancangan faktorial dengan faktor pertama adalah sumber karbon medium pertumbuhan bakteri dan faktor kedua adalah substrat target jerami atau bagas tebu. Hasil penelitian menunjukkan adanya interaksi antara sumber karbon pada medium pertumbuhan bakteri dengan jenis substrat target (P<0.05). Secara umum aktivitas enzim kasar Paenibacillus sp. dalam mendegradasi substrat jerami padi dan jerami jagung menghasilkan jumlah gula reduksi cukup rendah. Hal ini dapat disebabkan karena tingginya lignin dan silika yang ada pada jerami padi sehingga menghalangi akses enzim dalam menjangkau selulosa dan hemiselulosa. Jerami jagung dilaporkan memiliki kualitas nutrisi kurang baik karena laju kecernaanya yang cukup rendah (Zhong et al. 2012). Perlakuan medium pertumbuhan bakteri dengan sumber karbon bagas tebu dan jenis substrat target bagas tebu menghasilkan gula reduksi tertinggi dibandingkan perlakuannya lainnya (Tabel 8). Semakin banyak gula reduksi yang dihasilkan mengindikasikan semakin banyak pula nutrien yang tersedia. Kesesuaian antara aktivitas enzim dan substrat menjadi hal yang sangat penting dalam memahami sifat kimia polisakarida bukan pati. Menurut Zijlstra et al. (2010), dampak positif enzim terhadap kecernaan energi telah terbukti, selama suplementasi enzim cocok dengan substrat yang membatasi utilisasi nutrien.

35 Tabel 8 Gula reduksi (mm) a yang dihasilkan oleh enzim kasar Paenibacillus sp. dalam mendegradasi substrat hasil samping pertanian Jenis medium pertumbuhan Jenis substrat Jerami padi Jerami jagung Jerami kedelai Bagas tebu Jerami padi (JP) d d bcd d Jerami jagung (JJ) d cd d bcd Jerami kedelai (JK) d d abc abc Bagas tebu (BT) d cd cd a Nutrient broth (NB) d ab bcd ab Carboxy methyl cellulose (CMC) bcd bcd abc bcd a Angka-angka yang diikuti oleh huruf yang sama tidak berbeda nyata pada taraf uji 5% (uji Tukey) Persentase jumlah gula reduksi terhadap gula total disajikan pada Tabel 9. Penggunaan sumber karbon berbeda pada media pertumbuhan bakteri dan jenis substrat target berpengaruh nyata terhadap persentase gula reduksi terhadap gula total (P<0.05). Persentase gula reduksi terhadap gula total diasumsikan sebagai indikator kekuatan enzim dalam mendegradasi substrat. Semakin besar persentase gula reduksi terhadap gula total, semakin tinggi kekuatan enzim dalam mendegradasi substrat. Gula reduksi adalah keompok gula yang menandung gugus hemiasetal atau hemiketal. Pengukuran gula reduksi banyak digunakan pada penelitian terkait karbohidrat, misalnya analisis hidrolisat polisakarida serta kinetika dan aktivitas enzim pendegradasi karbohidrat (Shao dan Lin 2017). Media dengan sumber karbon CMC atau jerami kedelai dan dengan substrat target jerami kedelai menghasilkan persentase paling tinggi (P<0.05). Hal ini menunjukkan bahwa enzim yang dihasilkan oleh perlakuan tersebut mampu mendegradasi cukup baik substrat jerami kedelai, meskipun secara fisik jerami kedelai memiliki struktur yang lebih kaku. Tabel 9 Persentase gula reduksi terhadap gula total (%) Jenis medium pertumbuhan Jenis substrat Jerami padi Jerami jagung Jerami kedelai Bagas tebu Jerami padi (JP) cdef f bc f Jerami jagung (JJ) f def f f Jerami kedelai (JK) cdef f a ef Bagas tebu (BT) ef def bcd cdef Nutrient broth (NB) f b b def Carboxy methyl cellulose (CMC) bcde cdef a f a Angka-angka yang diikuti oleh huruf yang sama tidak berbeda nyata pada taraf uji 5% (uji Tukey) Perlakuan sumber karbon asal jerami kedelai dan substrat target jerami kedelai juga menghasilkan presentasi gula reduksi-gula total paling tinggi. Hal ini dapat disebabkan oleh keberhasilan inducer (dalam hal ini yakni tepung jerami kedelai yang digunakan sebagai sumber krbon medium pertumbuhan bakteri) dalam menstimulus bakteri untuk menghasilkan enzim yang sesuai dengan sumber karbon pada media tempat ditumbuhkannya. Induksi enzim yang mampu memecah substrat di lingkungan tempat tumbuhnya merupakan keuntungan ekologikal tersendiri. Proses induksi ini berdampak pada perubahan fenotip sepanjang proses dihasilkannya energi untuk metabolisme atau pertumbuhan. Hal ini menunjukkan adanya potensi genetik yang muncul akibat penambahan inducer, selanjutnya 21

36 Gula Reduksi (mm) 22 enzim akan dihasilkan dengan kecepatan yang sama di setiap sel bakteri. Proses adaptasi kultur bakteri seyogyanya dipandang sebagai alternatif proses induksi, meskipun seleksi sel juga mampu menghasilkan enzim yang dibutuhkan untuk pertumbuhan (Wiseman 1975). Aplikasi Penambahan Enzim Perlakuan terbaik berdasarkan hasil uji gula reduksi (Tabel 8), yakni sumber karbon berupa bagas tebu dan substrat bagas tebu selanjutnya diaplikasikan pada percobaan penambahan enzim kasar Paenibacillus sp. pada tepung bagas tebu. Produksi enzim kasar dilakukan dengan menumbuhkan Paenibacillus sp. ke dalam media bagas tebu selama dua hari atau hingga mencapai fase stasionernya. Pengambilan sampel enzim kasar dilakukan setiap hari untuk diukur aktivitasnya (H-0, H-1, dan H-2). 0,25 0,2 0,15 0,1 0, Hari ke- Gambar 12 Produksi gula reduksi enzim kasar Paenibacillus sp. dengan substrat bagas tebu Enzim kasar Paenibacillus sp. H-0, H-1 dan H-2 ini selanjutnya digunakan sebagai perlakuan. Kurva gula reduksi menunjukkan bahwa terjadi peningkatan aktivitas enzim hingga hari kedua. Laju aktivitas enzim pada hari pertama cukup rendah. Peningkatan laju aktivitas enzim yang cukup tinggi terjadi pada hari kedua. Pada hari pertama bakteri mengalami fase lamban, yakni proses adaptasi sel terhadap lingkungannya. Pada fase ini mulai terjadi pertambahan substansi intraseluler, namun aktivitas enzim yang dihasilkan masih rendah (Pelczar dan Chan 2008). Pada hari kedua mulai memasuki fase logaritma atau eksponensial, yakni ketika pertumbuhan sel dan aktivitas metabolik mulai konstan, sehingga enzim yang dihasilkan juga memiliki aktivitas yang cukup tinggi (Pelczar dan Chan 2008). yang cukup berarti. Pada perlakuan H-1, terjadi intensitas kerusakan yang cukup banyak namun dengan tingkat kerusakan yang tidak terlalu tinggi. Secara umum perlakuan H-2 menghasilkan tingkat kerusakan paling tinggi. Hal ini selaras dengan aktivitas enzim yang semakin tinggi pada H-0, H-1, dan H-2 (Gambar 12). Beberapa teknik pengolahan telah banyak digunakan untuk mengatasi struktur kristalin dari lignin, misalnya adalah dengan hidrolisis menggunakan asam pekat dan penambahan enzim. Perlakuan dengan menggunakan asam-asam kuat akan mengubah struktur lignoselulosa selama hidrolisis. Sedangkan perlakuan dengan menggunakan enzim pada dasarnya akan mempertahankan struktur asli lignoselulosa tanpa perubahan (Sjostrom 1995).

37 23 (a) (b) (c) (d) Gambar 13 SEM tepung bagas tebu (perbesaran 500x): (a) tanpa perlakuan, (b) penambahan enzim H-0, (c) penambahan enzim H-1, dan (d) penambahan enzim H-2 (a) (b) (c) (d) Gambar 14 SEM tepung bagas tebu (perbesaran 1000x) : (a) tanpa perlakuan, (b) penambahan enzim H-0, (c) penambahan enzim H-1, dan (d) penambahan enzim H-2 Berdasarkan gambar diatas, dapat dilihat bahwa kerusakan serat oleh perlakuan H-1 memiliki kesamaan dengan struktur permukaan pulp kraft, sedangkan perlakuan H-2 cenderung memiliki kemiripan dengan perlakuan wall board. Secara teori, terdapat ikatan-ikatan kimia antara lignin dan semua konstituen hemiselulosa, bahkan juga terdapat indikasi adanya ikatan lignin dengan selulosa. Ikatan-ikatan yang terjadi dapat berupa ester atau eter, atau bahkan glikosida. Misalnya, gugus benzil alkohol bebas dapat diganti atau ditempati posisinya oleh ikatan ester dengan gugus asam 4-O-metil glukuronat yang ada pada xilan atau melalui ikatan eter dengan unit arabinosa atau manosa yang ada pada arabinoxilan dan glukomanan. Pada umumnya ikatan eter antara lignin dan karbohidrat lebih stabil dibandingkan ikatan ester, dalam hal ini ikatan-α adalah yang mungkin terjadi antara lignin dan hemiselulosa. Pada xilan kayu lunak, gugus penghubung yang terjadi dapat berupa unit arabinosa (HO-2 dan HO-3), sedangkan pada galaktomanan unit yang diduga berperan sebagai penghubung ialah galaktosa (HO- 3). Ikatan-ikatan ester ini mudah dipecah oleh alkali, sedangkan ikatan glikosida mudah dipecah dengan asam (Sjostrom 1995). Untuk meningkatkan nilai kebermanfaatan pakan bagi ternak, pemberian enzim harus dilakukan dengan tepat sasaran. Ketika hal ini dapat tercapai, suplementasi enzim yang tepat pada pakan dapat menjadi altarnatif solusi dalam substitusi bahan pakan dengan memanfaatkan hasil samping pertanian yang banyak tersedia (Officer 2000).

38 24 5 SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Bagas tebu menjadi sumber karbon terbaik pada pertumbuhan Paenibacillus sp. Jenis sumber karbon berpengaruh nyata terhadap aktivitas selulase dan xilanase enzim kasar Paenibacillus sp. Aktivitas selulase tertinggi dihasilkan oleh perlakuan dengan medium carboxymethyl cellulose, sedangkan aktivitas xilanase tertinggi dihasilkan oleh perlakuan dengan medium nutrient broth. Interaksi antara sumber karbon berupa bagas tebu dan substrat target bagas tebu menghasilkan gula reduksi tertinggi. Aktivitas atau kekuatan enzim tertinggi dilihat berdasarkan persentase gula total dihasilkan oleh perlakuan sumber karbon berupa carboxymethyl cellulose dan jerami kedelai dengan substrat target jerami kedelai. Penambahan enzim dengan aktivitas tertinggi menghasilkan tingkat kerusakan paling tinggi pada tepung bagas tebu. Saran Enzim yang akan digunakan pada pakan harus memiliki aktivitas tinggi yang mampu memutus ikatan senyawa lignoselulosa sehingga dapat meningkatkan ketersediaan nutrien. Aktivitas enzim pada waktu tumbuh bakteri seteah hari ke-2 masih mungkin untuk naik, perlu dilakukan pengukuran aktivitas enzim pada waktu tumbuh bakteri yang lebih lama. Peningkatan aktivitas enzim perlu ditingkatkan antara lain dengan melakukan optimasi suhu, ph, dan waktu inkubasi.selanjutnya hasil penambahan enzim pada pakan perlu diukur nilai kecernaannya baik secara in vitro maupun in vivo. DAFTAR PUSTAKA Adlan F Pemanfaatan pakan lokal dari limbah pertanian untuk mendukung pengembangan budidaya ternak sapi potong di Kabupaten Tasikmalaya [skripsi]. Bogor (ID) : Institut Pertanian Bogor. Akaracharanya A, Lorliam W, Tanasupawat S, Lee KC, Lee JS Paenibacillus cellulositrophicus sp. nov., a cellulolytic bacterium from Thai soil. Inter. J Syst Evolut Microbiol. 59: Alvira P, Negro MJ, Ballesteros M Effect of endoxylanase and α-larabinofuranosidase supplementation on the enzymatic hydrolysis of steam exploded wheat straw. Bior Technol. 102: Antorida D Potensi limbah tanaman pangan di Kabupaten Garut Jawa Barat untuk pengembangan budidaya ternak sapi perah [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Arora DS, Gill PK Comparison of two assay procedures for lignin peroxidase. Enzyme Microb Technol. 28: [AOAC] Association of Analytical Communities Official Methods of Analysis of AOAC International (18 th Ed). Arlington (US): Association of Official Analytical Chemical.

39 [BPS] Badan Pusat Statistik Produksi Padi Berdasarkan Provinsi. Jakarta (ID): Badan Pusat Statistik. Binod P, Sindhu R, Singhania RR, Vikram S, Devi L, Nagalakshmi S, Kurien N, Sukumaran RK, Pandey A Bioethanol production from rice straw: an overview. Bior Technol. 101: Budiman, Soetrisno RD, Budhi SP, Indrianto A Total non-structural carbohydrate (TNC) of three cultivars of napier grass (Pennisetum purpureum) at vegetative and reproductive phase. J Indo Trop Anim Agric. 36(2): Carrasco GC, Johnsen PO, Oyaas K Structural quantification of wood fibre surfaces-morphological effects of pulping and enzymatic treatment. Micron. 41: Chandra R, Singh S, Reddy MMK, Patel DK, Purohit HJ, Kapley A Isolation and characterization of bacterial strains Paenibacillus sp. and Bacillus sp. for kraft lignin decolorization from pulp paper mill waste. J Gen Appl Microbiol. 54: Cherney DJR Forage Evaluation in Ruminant Nutrition: Characterization of Forages by Chemical Analysis. New York (US): CAB International Publishing. Chow PS, Landhausser SM A method for routine measurements of total sugar and starch content in woody plant tissues. Tree Physiol. 24: Dawson L, Boopathy R Cellulosic ethanol production from sugarcane bagasse without enzymatic saccharification. Bior. 3(2): Eriksson T, Borjesson J, Tjerneld F Mechanism of surfactant effect in enzymatic hydrolysis of lignocellulose. Enzyme Microb Technol. 31: Ernes A, Ratnawati L, Wardani AK, Kusnadi J Optimasi fermentasi bagas tebu oleh Zymomonas mobilis (NRRL B-14023) untuk produksi bioetanol. Agritech. 34(4): Frediansyah A, Sudiana IM Potensi Paenibacillus spp. sebagai pemacu pertumbuhan tanaman pada ekosistem gambut tropis. Widyariset. 16(2): Gardener BBM Ecology of Bacillus and Paenibacillus spp. in agricultural systems. Phytopatol. 94(11): Ilmi IM, Kuswytasari ND Aktifitas enzim lignin peroksidase oleh Gliomastix sp. T3.7 pada limbah bonggol jagung dengan berbagai ph dan suhu. J Sains Seni Pomits. 2(1): Imjongjairak S, Jommuengbout P, Karpilanondh P, Katsuzaki H, Sakka M, Kimura T, Pason P, Tachaapaikoon C, Romsaiyud J, Ratanakhanokchai K, Sakka K Paenibacillus curdlanolyticus B-6 xylanase Xyn10C capable of producing a doubly arabonise-substituted xylose, α-l-araf-(1 2)-[α-L- Araf-(1 3)]-D-Xylp, from rye arabinoxylan. Enzyme Microb Technol. 72:1-9. Isobe K, Sasaki Y, Kataoka M, Urano N, Ogawa J, Shimizu S A novel alcohol oxidase from Paenibacillus sp. AIU 311 and Its Application. J Biotechnol. 150S:S1-S576. Iswanto AH Struktur anatomi kayu daun lebar (hardwoods) dan kayu daun jarum (softwoods) [karya tulis]. Medan (ID): Universitas Sumatera Utara. 25

40 26 Jin S, Chen H Structural properties and enzymatic hydrolysis of rice straw. Proc Biochem. 41(6): Jin S, Chen H Near-infrared analysis of the chemical composition of rice straw. Industrial Crops Products. 26: Kim DR, Lim HK, Lee KI, Hwang IT Identification of a novel cellulosebinding domain within the endo-β-1,4-xylanase KRICT PX-3 from Paenibacillus terrae HPL-003. Enzyme Microb Technol : Ko CH, Tsai CH, Tu J, Lee HY, Ku LT, Kuo PA, Lai YK Molecular cloning and characterization of a novel thermostable xylanase from Paenibacillus campinasensis BL11. Proc Biochem. 45: Komar A Teknologi Pengolahan Jerami. Bandung (ID): Yayasan Dian Grahita Indonesia. Konig J, Grasser R, Pikor H Determination of xylanase, β-glucanase, and cellulase activity. Anal Bioanal Chem. 374: Konig H Bacillus species in the intestine of termites and othet soil invertebrates. J Appl Microbiol. 101: Kuhnigk T, Borst EM, Breunig A, Konig H, Collins MP, Hutson RA, Kampfer P Bacillus oleronius sp. Nov., a member of the hindgut flora of the termite Reticulitermes santonensis. Can J. Microbiol. 41: Kuhnigk T Bakterian aus dem Termitendarm [tesis]. Ulm: Ulm University. Kuhnigk T, Konig H Degradation of dimeric lignin model compounds by aerobic bacteria isolated from the hindgut of xylophagous termites. J Basic Microbiol. 37: Kuswandi Teknologi pakan untuk limbah tebu (fraksi serat) sebagai pakan ternak ruminansia. Wartazoa. 17(2): Lemaire G, Franzluebbers A, Carvalho PC, Dedieu B Integrated croplivestock systems: strategies to achive synergy between agricultural production and environment quality. Agr Eco Env. xx:xxx-xxx. Loomis WD, Lile JD, Sandstrom RP, Burbott AJ Adsorbent polystyrene as an aid in plant enzyme isolation. Phytochem. 18: Maheri-Sis N, Abdollahi-Ziveh BA, Salamatdoustnobar R, Ahmadzadeh A, Aghajanzadeh-Golshani A, Mohebbizadeh M Determining nutritive value of soybean straw for ruminants using nylon bags technique. Pakistan J Nutr. 10(9): Mariyono, Umiyasih U, Anggraeny Y, Zubardi M Pengaruh substitusi konsentrat komersial dengan tumpi jagung terhadap performans sapi PO bunting muda. Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner Martawidjaja M Pemanfaatan jerami padi sebagai pengganti rumput untuk ternak ruminansia kecil. Wartazoa. 13(3): Maturin L, Peeler T Bacteriological analytical manual chapter 3 Aerobic plate count. Food and Drug Administration. Mc Donald P, Edwards RA, Greenhalgh JFD, Morgan CA, Sinclair LA, Wilkinson RG Animal nutrition. London (UK): Prentice Hall. Moir RJ The comparative physiology of ruminant-like animals. Di dalam: Dougherty RW, Allen RS, Burroughs W, Jacobson N, McGilliard AD, editor.

41 Physiology of Digestion in The Ruminant Agustus; Ames, Iowa. Washington (US): Butterworth Inc. hlm Monod J The growth of bacterial cultures. Annu Rev Microbiol. 3: Nagar S, Mittal A, Kumar D, Kumar L, Kuhad RC, Gupta VK Hyper production of alkali stable xylanase in lesser duration by Bacillus pumilus SV-85S using wheat bran under solid state fermentation. New Biotechnol. 28: Nakamura S, Wakabayashi K, Nakai R, Aono R, Horikoshi K Purification and some properties of an alkaline xylanase from alkaliphilic Bacillus sp. strain 41M-1. Appl Environ Microbiol. (59): Narasimha, Sridevi A, Buddolla V, Subhosh CM, Rajasekhar RB Nutrient effects on production of cellulolytic enzymes by Aspergillus niger. African J Biotechnol. 5(5): Ngili Y Protein dan Enzim. Bandung (ID): Rekayasa Sains. Nguyen TD, Kim KR, Han SJ, Cho HY, Kim JW, Park SM, Park JC, Sim SJ Pretreatment of rice straw with ammonia and ionic liquid for lignocellulose conversion to fermentable sugars. Bior Technol. 101: Ni J, Tokuda G Lignocellulose degrading-enzymes from termites and their symbiotic microbiota. Biotechnol Adv. xxx:xxx-xxx. Officer DI Feed Animal Metabolism and Nutrition: Feed Enzymes. P Mello [editor]. Edinburgh (UK): CABI Publishing. Ohkuma M, Shimizu H, Thongaram T, Kosono S, Moriya K, Trakulinaleamsai S, Noparatnarapor N, Kudo T An alkaliphilic and xylanolytic Paenibacillus species isolated from the gut of a soil-feeding termite. Microb Environ. 18(3): Ohta H, Hattori T Bacteria sensitive to nutrient broth medium in terrestrial environment. Soil Sci Plant Nutr. 26(1): Okafor UA, Okochi VI, Onyegeme BM, Nwodo S Xylanase production by Aspergillus niger ANL 301 using agro-wastes. African J Biotechnol. 6(14): Okano K, Fukui S, Kitao R, Usagawa T Effects of culture length of Pleurotus eryngii grown on sugarcane bagasse on in vitro digestibility and chemical compositiion. Animal Sci Feed Technol. 136: Pakdeedashakiat W, Leelavatcharamas V, Piyatheerawong W Utilization of lignocellulosic wastes for xylanase and cellulase production by Paenibacillus curdlanolyticus B6. J Biotechnol. 13: Pandey A, Soccol CR, Nigam P, Soccol VT Biotechnological potential of agro-industrial residues I : sugarcane bagasse. Bioresour Technol. 74: Pelczar MJ Jr, Chan ECS Dasar-Dasar Mikrobiologi. Hadioetomo RS, Imas T, Tjitrosomo SS, Angka SL, penerjemah. Jakarta (ID) : UI Press. Terjemahan dari: Elements of Microbiology. Petersen CF, Sauter EA. Enzyme sources and their value in barley rations for chick growth and egg production. Poultry Sci. 47(4): Prasetiyono B, Suryahadi, Toharmat T, Syarief R Strategi suplementasi protein ransum sapi potong berbasis jerami dan dedak padi. Media Peternakan. 30(3):

42 28 Price RG, Robinson D A comparison of the β-d-glucosidase and β-dgalactosidase activities from eleven enzyme sources. Comp Biochem Physiol. 17: Putri FICE Optimasi produksi selulase dari bakteri laut Bacillus cereus [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Reddy N, Yang Y Biofibers from agricultural byproducts for industrial applications. Trends Biotechnol. 239(1): Richana N, Irawadi TT, Nur A, Syamsu K Isolasi identifikasi bakteri penghasil xilanase serta krakterisasi enzimnya. J Agr Biogen. 4(1): Sarnklong C, Cone JW, Pellikaan W, Hendriks WH Utilization of rice straw and different treatments to improve its feed value for ruminants : a review. Asian-Aust J Anim Sci. 23(5): Septiningrum K, Apriana C Produksi xilanase dari tongkol jagung dengan sistem bioproses menggunakan Bacillus circulans untuk pra-pemutihan pulp. J Riset Industri. 5(1): Shahzadi T, Mehmood S, Irshad M, Anwar Z, Afroz A, Zeeshan N, Rashid U, Sughra K Advances in lignocellulosic biotechnology: a brief review on lignocellulosic biomass and cellulases. Advs Biosci Biotechnol. 5: Shankar T, Isaiarasu L Cellulase production by Bacillus pumilus EWBCM1 under varying cultural conditions. Middle-East J Sci Res. 8(1): Shao Y, Lin AH Improvement in the quantification of reducing sugars by miniaturizing the Somogyi-Nelson assay using a microtiter plate. Food Chem. 240: Silveira MHL, Rau M, Silva Bon EP, Andreaus J A simple and fast method for determination of endo- and exo- cellulase activity in cellulase preparations using filter paper. Enzyme Microb Technol. 51: Sjostrom E Kimia Kayu, Dasar-dasar dan Penggunaan. Sastrohamidjojo H, penerjemah; Prawirohatmodjojo S, editor. Yogyakarta (ID): Gadjah Mada University Press. Terjemahan dari: Wood Chemistry, Fundamentals and Applications. Ed ke-2. Steel RGD, Torrie JH Prinsip dan Prosedur Dasar Statistika. Sumantri B, penerjemah. Jakarta (ID): PT. Gramedia Pustaka Utama. Terjemahan dari: Principles and Procedures of Statistics. Suyitno, Murhadi, Marsono Amoniasi jerami padi kering sebagai pakan alternatif ternak sapi pada musim kemarau di kabupaten Gunung Kidul. Pelita. 1:2. Umiyasih U, Wina E Pengolahan dan nilai nutrisi limbah tanaman jagung sebagai pakan ternak ruminansia. Wartazoa. 18(3): Van Soest PJ, Robertson JB, Lewis BA Methods for dietary fiber, neutraldetergent fiber and nonstarch polysaccharides in relation to animal nutrition. J Dairy Sci. 74: Van Soest PJ Rice straw, the role of silica and treatments to improve quality: A review. J Anim Feed and Tech.130: Weiss PHE, Alvares ACM, Gomes AA, Miletti LC, Skoronski E, Silva GF, Freitas SM, Magalhaes MLB Beta glucosidase from Bacillus polymyxa is activated by glucose-6-phosphate. Archive Biochem Biophys. 580:50-56.

43 Wenzel M, Schonig I, Berchtold M, Kampfer P, Konig H Aerobic and facultatively anaerobic cellulolytic bacteria from the gut of the termite Zootermopsis angusticollis. J App Microbiol. 92: Wiseman A Enzyme induction in microbial organisms. Di dalam: Parke DV, editor. Volume 6. Basic Life Science. New York (US) : Plenum Press. hlm Wulandari D Potensi dan ketersediaan limbah pertanian untuk mendukung budidaya sapi potong di Kabupaten Cirebon [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Xu Z, Wang Q, Jiang ZH, Yang XX, Ji Y Enzymatic hydrolysis of pretreated soybean straw. Biom Bioe. 31: Yesiladali SK, Pekin G, Bermek H, Arslan-Alaton I, Orhon D, Tamerler C Bioremediation of textile azo dyes by Trichophyton rubrum LSk-27. J Microb Biotech. 22: Zhong W, Zhang Z, Qiao W, Fu P, Liu M Comparison of chemical and biological pretreatment of corn straw for biogas production by anaerobic digestion. Renew Energy. 36: Zhong W, Zhang Z, Luo Y, Qiao W, Xiao M, Zhang M Biogas productivity by co-digesting Taihu blue algae with corn straw as an external carbon source. Bior Technol. 114(2012): Zijlstra RT, Owusu-Asiedu A, Simmins PH Future of NSP-degrading enzymes to improve nutrient utilization of co-products and gut health in pigs. Livestock Sci. 134:

44 30 Lampiran 1 Hasil analisis ragam jumlah koloni Paenibacillus sp. One-way ANOVA: JumlahKoloni versus SumberKarbon Source DF SS MS F P SumberKarbon ,42 0,000 Error Total S = 12,19 R-Sq = 96,81% R-Sq(adj) = 94,15% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ,00 14,14 (---*---) 2 2 9,50 0,71 (---*---) ,50 6,36 (----*---) ,00 21,21 (---*---) ,00 0,00 (---*---) ,00 14,14 (----*---) Pooled StDev = 12,19

45 31 Lampiran 2 Hasil analisis ragam dan uji lanjut aktivitas selulase One-way ANOVA: Selulase versus SumberKarbon Source DF SS MS F P SumberKarbon ,3 383,5 15,52 0,000 Error ,5 24,7 Total ,9 S = 4,971 R-Sq = 86,61% R-Sq(adj) = 81,02% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ,059 0,879 (----*-----) 2 3 6,088 6,975 (----*----) ,250 2,325 (----*-----) ,831 5,488 (----*----) ,831 7,610 (----*----) ,993 2,325 (----*-----) Pooled StDev = 4,971

46 32 Lampiran 3 Hasil analisis ragam dan uji lanjut aktivitas xilanase One-way ANOVA: Xilanase versus SumberKarbon Source DF SS MS F P SumberKarbon 5 15,536 3,107 9,95 0,001 Error 12 3,747 0,312 Total 17 19,283 S = 0,5588 R-Sq = 80,57% R-Sq(adj) = 72,47% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ,0000 0,3933 (-----*-----) 2 3 0,3028 0,6937 (-----*----) 3 3 0,3784 0,5714 (-----*-----) 4 3 0,5298 0,5714 (----*-----) 5 3 2,7248 0,6008 (-----*-----) 6 3 0,1514 0,4727 (-----*-----) ,0 1,2 2,4 3,6 Pooled StDev = 0,5588

47 33 Lampiran 4 Hasil analisis ragam dan uji lanjut aktivitas lignin peroksidase One-way ANOVA: LiP versus SumberKarbon Source DF SS MS F P SumberKarbon 5 0,4289 0,0858 0,96 0,505 Error 6 0,5335 0,0889 Total 11 0,9624 S = 0,2982 R-Sq = 44,57% R-Sq(adj) = 0,00% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ,2802 0,3760 ( * ) 2 2 0,2524 0,3637 ( * ) 3 2-0,1746 0,2155 ( * ) 4 2 0,2889 0,3704 ( * ) 5 2 0,4341 0,1807 ( * ) 6 2 0,1508 0,2088 ( * ) ,50 0,00 0,50 1,00 Pooled StDev = 0,2982

48 34 Lampiran 5 Hasil analisis ragam dan uji lanjut gula reduksi General Linear Model: GulaReduksi versus SumberKarbon; SubstratTarget Factor Type Levels Values SumberKarbon fixed 6 1; 2; 3; 4; 5; 6 SubstratTarget fixed 4 1; 2; 3; 4 Analysis of Variance for GulaReduksi, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P SumberKarbon 5 0, , , ,45 0,000 SubstratTarget 3 0, , , ,22 0,000 SumberKarbon*SubstratTarget 15 0, , , ,52 0,000 Error 48 0, , , Total 71 0, S = 0, R-Sq = 83,71% R-Sq(adj) = 75,91% Unusual Observations for GulaReduksi Obs GulaReduksi Fit SE Fit Residual St Resid 34 0, , , , ,41 R 36 0, , , , ,36 R 46 0, , , , ,02 R 47 0, , , , ,46 R 48 0, , , , ,44 R R denotes an observation with a large standardized residual. Grouping Information Using Tukey Method and 95,0% Confidence SumberKarbon N Mean Grouping ,14346 A ,13204 A ,12519 A ,11948 A ,06583 B ,05213 B Means that do not share a letter are significantly different. Grouping Information Using Tukey Method and 95,0% Confidence SubstratTarget N Mean Grouping ,16870 A ,11720 B ,08929 B ,05023 C Means that do not share a letter are significantly different.

49 35 Grouping Information Using Tukey Method and 95,0% Confidence SumberKarbon SubstratTarget N Mean Grouping ,29376 A ,22222 A B ,22070 A B ,19635 A B C ,19330 A B C ,18874 A B C ,13394 B C D ,13090 B C D ,10654 B C D ,09893 B C D ,09893 B C D ,09589 B C D ,08828 C D ,08676 C D ,08067 C D ,05936 D ,05936 D ,04262 D ,03957 D ,03653 D ,02435 D ,02435 D ,01979 D ,01065 D Means that do not share a letter are significantly different.

50 36 Lampiran 6 Hasil analisis ragam dan uji lanjut persentase gula reduksi terhadap gula total General Linear Model: %Gula versus SumberKarbon; Substrat Factor Type Levels Values SumberKarbon fixed 6 1; 2; 3; 4; 5; 6 Substrat fixed 4 1; 2; 3; 4 Analysis of Variance for %Gula, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P SumberKarbon 5 0, , , ,61 0,000 Substrat 3 0, , , ,88 0,000 SumberKarbon*Substrat 15 0, , , ,26 0,000 Error 48 0, , , Total 71 2, S = 0, R-Sq = 93,66% R-Sq(adj) = 90,63% Unusual Observations for %Gula Obs %Gula Fit SE Fit Residual St Resid 20 0, , , , ,71 R 21-0, , , , ,90 R 43 0, , , , ,44 R 47 0, , , , ,07 R 68 0, , , , ,09 R 69 0, , , , ,09 R R denotes an observation with a large standardized residual. Grouping Information Using Tukey Method and 95,0% Confidence SumberKarbon N Mean Grouping ,27930 A ,23522 A ,22096 A B ,16998 B C ,12517 C D ,08627 D Means that do not share a letter are significantly different. Grouping Information Using Tukey Method and 95,0% Confidence Substrat N Mean Grouping ,37671 A ,14099 B ,12734 B ,09956 B Means that do not share a letter are significantly different. Grouping Information Using Tukey Method and 95,0% Confidence SumberKarbon Substrat N Mean Grouping ,63112 A

51 ,62133 A ,34847 B ,34247 B ,30822 B C ,27886 B C D ,25082 B C D E ,17337 C D E F ,15621 C D E F ,15049 C D E F ,15049 C D E F ,13939 D E F ,13115 D E F ,12737 D E F ,11139 E F ,10033 E F ,07905 F ,07828 F ,07725 F ,06174 F ,05768 F ,05016 F ,02515 F ,01682 F Means that do not share a letter are significantly different.

52 38 Lampiran 7 Dokumentasi kegiatan Gambar 15 Isolat bakteri Paenibacillus sp. InaCC B63 Gambar 16 Stok isolat Paenibacillus sp. Gambar 17 Inkubasi bakteri pada suhu ruang Gambar 18 Inkubasi bakteri pada shaker supernatan pellet Gambar 19 Pertumbuhan bakteri untuk pengamatan kurva pertumbuhan Gambar 20 Ekstraksi enzim kasar Gambar 21 Sampel enzim kasar Gambar 22 Inkubasi circulating water bath

53 39 Gambar 23 Sampel uji DNS Gambar 24 Pembacaan absorbansi Gambar 25 Alat dan bahan penambahan enzim pada tepung bagas tebu Gambar 26 Preparasi sampel uji SEM Gambar 27 Pengamatan SEM

54 40 Lampiran 8 Gambar kenampakan fisik mikroskop SEM pada berbagai perlakuan (Carrasco et al. 2010) (a) (b) (c) (d) Gambar 16 Perbedaan struktur permukaan pulp dengan perlakuan berbeda : (a) wall board, (b) kraft, (c) chemi-thermo mechanical, dan (d) thermo-mechanical