BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Januari hingga Juli 2011 di Laboratorium Bagian Fungsi Hayati dan Perilaku Hewan Departemen Biologi FMIPA IPB. Koleksi Sampel Sampel yang digunakan adalah sampel darah sapi madura berasal dari koleksi Laboratorium Bagian Fungsi Hayati dan Perilaku Hewan Departemen Biologi FMIPA IPB dan sampel darah sapi aceh berasal dari Balai Pembibitan Ternak Unggul (BPTU) Indrapuri Aceh besar. Jumlah keseluruhan sampel yang digunakan 83 sampel (Tabel 1). Tabel 1 Sampel sapi yang digunakan pada penelitian No. Bangsa Sapi Lokasi 1 Sapi aceh BPTU Indrapuri, Kab. Aceh Besar 2 Sapi madura Kab. Sampang & Kab. Bangkalan Kode Jenis Jumlah Tahun Sampel Kelamin Sampel Koleksi Kml_BosA 23 2010 AF 43 2009 17 2009 Keterangan ; Kab = Kabupaten, Kml = Kamaliah (Kolektor), AF = Achmad Farajallah (Kolektor), Bos = Genus sapi, A=Aceh. Ekstraksi Sampel Ekstraksi yang digunakan untuk amplifikasi gen leptin menggunakan Kapa Express Extract (Kapabiosystems). Ekstraksi yang digunakan untuk amplifikasi gen miostatin menggunakan Genomic DNA Mini Kit for Fresh Blood (Geneaid). Sebelum dilakukan tahap ekstraksi, sampel darah di dalam alkohol absolut dicuci dengan air destilata steril dan diendapkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm selama 5 menit. Pencucian sampel darah dilakukan sebanyak dua kali. Sampel darah diambil sebanyak 10 μl untuk proses ekstraksi menggunakan Kapa Express Extract dan 200 μl untuk proses ekstraksi Genomic DNA Mini Kit for Fresh Blood (Geneaid).
Tahapan ekstraksi Kapa Express Extract terdiri atas proses lisis dan inaktivasi enzim protease. Endapan sel darah sebanyak 10 μl dilarutkan dalam 10x buffer Kapa Express Extract dan 1 unit enzim protease Kapa Express Extract. Larutan dilisis pada suhu 75 0 C selama 10 menit. Selanjutnya, enzim protease dilakukan inaktivasi pada suhu 95 0 C selama 5 menit. Reaksi diendapkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm selama 1 menit. Supernatan merupakan larutan yang diambil untuk tahap amplifikasi. Ekstraksi Genomic DNA Mini Kit for Fresh Blood (Geneaid) yang digunakan dimodifikasi pada tahap pencucian sampel darah dari alkohol dan tahap resuspensi yang menggunakan air destilata steril. Endapan sel darah sebanyak 200 μl dilisis menggunakan larutan GB buffer sebanyak 200 μl, kemudian diinkubasi pada suhu 35 0 C selama 10 menit. Selanjutnya DNA diikat pada matriks di dalam tabung. Tahap pengikatan DNA pada matriks bertujuan untuk memisahkan DNA dari makromolekul sel lainnya. DNA terikat pada matriks, sedangkan makromolekul sel lainnya mengendap pada bagian dasar tabung. DNA pada matriks dicuci menggunakan larutan 400 μl W1 buffer dan 600 μl Wash buffer. Selanjutnya DNA diencerkan menggunakan larutan Elution buffer sebanyak 100 μl. Amplifikasi Gen Leptin Gen leptin yang diamplifikasi yaitu ekson 2 hingga ekson 3 menggunakan mesin PCR (Polymerase Chain Reaction) ESCO Swift Maxi Thermal Cycler. Pasangan primer yang digunakan mengapit daerah ekson 2, yaitu primer forward L5 (5 -CCATGGCAGACAGCAAATCTCGT-3 ) dan primer reverse L6 (5 - TGGTGTCATCCTGGACCTTCC-3 ) (Buchanan et al. 2002). Panjang daerah ekson 2 yang diapit oleh sepasang primer tersebut 234 pb. Volume total reaksi amplifikasi sebanyak 25 μl terdiri atas 12,5 μl 1 unit KAPA2G Robust Hotstart ReadyMix (MgCl 2 2mM dan masing-masing dntp 0,2 mm), masing-masing primer 0,5 μm 1,25 μl, dan genom DNA 10 ng. Kondisi PCR yang digunakan untuk amplifikasi daerah ekson 2 terdiri atas tahap pradenaturasi pada suhu 95 0 C selama 3 menit. Tahap selanjutnya 30 siklus dengan kondisi denaturasi pada suhu 95 0 C selama 15 detik, penempelan primer pada suhu 55 0 C selama 15 detik, dan
elongasi pada suhu 72 0 C selama 15 detik. Elongasi akhir pada suhu 72 0 C selama 10 menit. Amplifikasi daerah ekson 3 menggunakan pasangan primer forward L1 (5 -GTCTGGAGGCAAAGGGCAGAGT-3 )dan primer reverse L2 ( 5 - CCACCACCTCTGTGGAGTAG-3 ) (Lien et al. 1997). Panjang daerah ekson 3 yang diapit oleh sepasang primer tersebut 522 pb. Reaksi dan kondisi amplifikasi gen leptin daerah ekson 3 sama dengan reaksi dan kondisi amplifikasi pada daerah ekson 2, tetapi amplifikasi daerah ekson 3 menggunakan suhu penempelan primer pada 64 0 C selama 15 detik. Amplifikasi Gen Miostatin Gen miostatin pada ruas promotor diamplifikasi menggunakan mesin PCR (Polymerase Chain Reaction) ESCO Swift Maxi Thermal Cycler. Pasangan primer yang digunakan untuk amplifikasi gen miostatin ruas promotor adalah primer forward AF56 (5 -TTCAGGCTACTGAGTTGCATTTT-3 )dan reverse AF74 (5 -GCTTTCCAGCGGTAAAAGAA-3 ). Urutan basa primer yang digunakan disusun menggunakan program Primer3 berdasarkan species Bos taurus (No. akses AF348479.1) dari data GenBank. Sepasang primer tersebut mengapit daerah sekuen target sepanjang 580 pb. Volume reaksi total amplifikasi sebanyak 12 μl terdiri atas 1 unit KapaTaq DNA Polymerase ReadyMix (MgCl 2 2mM dan dntp 0,4 mm), masing-masing primer 0,4 μm, dan genom DNA 10-100 ng. Kondisi amplifikasi yang digunakan terdiri atas tahap pradenaturasi pada suhu 95 0 C selama 3 menit, dilanjutkan dengan 30 siklus dengan kondisi denaturasi 95 0 C selama 15 detik, penempelan primer pada suhu 58 0 C selama 15 detik, pemanjangan primer pada suhu 72 0 C selama 15 detik, dan pemanjangan primer akhir pada suhu 72 0 C selama 10 menit. Visualisasi Produk Amplifikasi Produk amplifikasi gen leptin daerah ekson 2, gen leptin daerah ekson 3, dan gen miostatin pada ruas promotor dimigrasikan menggunakan teknik Elektroforesis Gel Poliakrilamid (PAGE 6%) dengan konsentrasi bufer 1Χ TBE (Tris-HCl 0,5; Asam Borat 0,65; EDTA 0,02 M). Visualisasi DNA menggunakan
pewarnaan perak berdasarkan Byun et al. (2009). Penentuan ukuran pita DNA dilakukan menggunakan rumus Fungsi Regresi Linier. Pengurutan Nukleotida Pengurutan nukleotida menggunakan jasa pelayanan perusahaan sekuensing. Primer yang digunakan untuk pengurutan nukleotida pada gen leptin daerah ekson 2 sama dengan primer yang digunakan pada tahap amplifikasi (L5 dan L6). Sedangkan primer yang digunakan untuk gen miostatin pada ruas promotor adalah primer forward (AF56). Gen leptin daerah ekson 3 tidak dapat dilanjutkan ke tahap sekuensing karena produk amplifikasi gen leptin daerah ekson 3 memberikan pita DNA lainnya yang bukan merupakan pita target. Analisis Data Data dalam bentuk urutan basa nukleotida diedit menggunakan program BioEdit versi 7.0.9.0 dan Genetyx-Win versi 4.0. Data tersebut disejajarkan menggunakan program Geneious versi 5.4.4. Kemudian data diedit kembali dan dianalisis menggunakan program Mega 5.05. Urutan nukleotida disejajarkan dengan data dari data GenBank. Gen Leptin disejajarkan dengan Bos indicus haplotipe ATGCT (No. akses FJ626856.1), Bos indicus haplotipe GCATC (No. akses FJ626855.1), Bos taurus (No. akses AJ512638.1), Bos frontalis (No. akses EU642566.1), dan Bos taurus Χ Bos indicus (No. akses EU921637.1). Gen Miostatin disejajarkan dengan Bos taurus (No. akses AF348479.1). Persentase komposisi nukleotida pada gen Leptin dan gen Miostatin menggunakan aplikasi yang telah tersedia pada program Mega 5.05. Urutan nukleotida yang telah diedit disejajarkan menggunakan pensejajaran Crustal W. Pada gen Leptin perubahan nukleotida menjadi asam amino menggunakan program Genetyx-Win versi 4.0. Rekonstruksi pohon filogeni pada gen Leptin dilakukan menggunakan metode Neighbour-Joining (NJ) berdasarkan urutan nukleotida dan asam amino. Filogeni berdasarkan nukleotida menggunakan model Kimura-2-parameter
dengan nilai bootstrap 1000x pengulangan. Filogeni berdasarkan urutan asam amino menggunakan nilai bootstrap 1000x pengulangan. Rekonstruksi pohon filogeni pada gen Miostatin dilakukan berdasarkan urutan nukleotida menggunakan metode Neighbour-Joining (NJ), model Kimura- 2-parameter, dan nilai bootstrap 1000x pengulangan.