METODE PENELITIAN 3.1. Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Kesehatan Masyarakat Veteriner (kesmavet) Bambu Apus DKI Jakarta, dimulai sejak bulan September 2005 sampai dengan bulan Januari 2006. 3.2. Sampel Penelitian Materi penelitian sebanyak 31 (tiga puluh satu) ekor ayam pedaging diperoleh dari 6 pasar tradisional di Wilayah Kabupaten Tangerang. Materi tersebut diambil dari pasar tradisional selama 6 hari berturut-turut. Selanjutnya seluruh sampel yang diperoleh dilakukan pengujian terhadap residu antibiotika di laboratorium Kesmavet Bambu Apus DKI Jakarta. 3.3. Alat dan Bahan Alat yang digunakan adalah, erlenmeyer, pipet volumetrik, mixer, sentrifus, water bath, magnetik stirer, homogenizer/stomacher, autoclave, refrigerator, freezer, kertas cakram dan stomacher plastik bags. Bahan yang digunakan yaitu, bacto peptone, bacto agar, beef extract, yeast extract, D(+) glucose, tryptone, spora bakteri Bacillus calidolactis, Bacillus cereus, Bacillus subtilis dan Micrococcus luteus. 3.4. Cara Pengujian Residu Antibiotika Pengujian antibiotika dilakukan dengan metode biologik yaitu, metode Bio-Assay/Screening test menggunakan spora bakteri Bacillus calidolactis, Bacillus cereus, Bacillus subtilis dan Micrococcus luteus. Laboratorium Kesmavet Bambu Apus DKI Jakarta menggunakan metode ini untuk pengujian residu antibiotika pada produk ternak seperti, daging, susu dan telur. Metode ini diadopsi dari beberapa literatur dengan beberapa modifikasi.
3.4.1. Golongan Penisilin Pembuatan Spora Bakteri Uji Bakteri Bacillus calidolactis ditambahkan dalam agar miring dan diinkubasi pada suhu 55 0 C selama 2 (dua) minggu. Kemudian bakteri yang ditumbuhkan tersebut dipanen dan dimasukkan ke dalam larutan aquabides steril 20 ml, sebanyak 4 tabung sentrifuge, lalu dipanaskan dalam waterbath pada suhu 65 0 C selama 30 menit. Selanjutnya suspensi dipusing 3000 rpm selama 10 menit buang supernatan (lapisan atasnya). Kedalam endapan tambahkan aquabides secukupnya, dikocok dan dimasukkan kedalam refrigerator dengan suhu 4 0 C selama 18-24 jam. Kemudian larutan dipanaskan kembali dalam waterbath dengan suhu 65 0 C selama 30 menit, setelah itu dipusing dengan kecepatan 1000 rpm selama 5 menit dan diambil lapisan atasnya. Hasilnya disimpan dalam refrigerator sebagai spora. Pembuatan Kultur Media Uji Sebanyak 5 gr tryptone, 12 gr yeast extract, 1 gr dextrose dan 15-16 gr bacto agar dilarutkan dalam 1000 ml aquades, kemudian diukur pada ph 5,7 ± 0,1 dan dididihkan. Media disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121 o C selama 15 menit. Pembuatan Larutan Dapar Fosfat (Buffer) Sebanyak 13,3 gr KH 2 PO 4 dan 6,2 gr Na 2 HPO 4 dilarutkan dalam 1000 ml aquades, kemudian larutan disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121 o C selama 15 menit. 3.4.2. Golongan Tetrasiklin Pembuatan Spora Bakteri Uji Bakteri Bacillus cereus ditambahkan dalam agar miring dan diinkubasi pada suhu 30 0 C selama 1 (satu) minggu. Kemudian bakteri yang ditumbuhkan tersebut dipanen dan dimasukkan ke dalam larutan NaCl fisiologis steril 20 ml, sebanyak 4 tabung sentrifus, lalu dipanaskan dalam waterbath pada suhu 65 0 C 27
selama 18-24 jam. Selanjutnya suspensi dipusing 3000 rpm selama 10 menit buang supernatan (lapisan atasnya). Kedalam endapan tambahkan NaCl fisiologis secukupnya, dikocok dan dimasukkan kedalam refrigerator dengan suhu 4 0 C selama 18-24 jam. Kemudian larutan dipanaskan kembali dalam waterbath dengan suhu 65 0 C selama 30 menit, setelah itu dipusing dengan kecepatan 1000 rpm selama 5 menit dan diambil lapisan atasnya. Hasilnya disimpan dalam refrigerator sebagai spora. Pembuatan Kultur Media Uji Sebanyak 6 gr peptone, 1,5 gr beef extract, 3 gr yeast extract, 1,35 gr KH 2 PO 4, dan 15-16 bacto agar dalam 1000 ml aquadest, kemudian diukur pada ph 5,7 ± 0,1 dan dididihkan. Media disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121 o C selama 15 menit. Pembuatan Larutan Dapar Fosfat (Buffer) Sebanyak 3,5 gr KH 2 PO 4 dan 3 gr Na 2 HPO 4 dilarutkan dalam 1000 ml aquades, kemudian larutan disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121 o C selama 15 menit. 3.4.3. Golongan Makrolida Pembuatan Spora Bakteri Uji Bakteri Micrococcus luteus ditambahkan dalam agar miring dan diinkubasi pada suhu 36 0 C selama 18-24 jam. Kemudian diambil 1 ose kuman biakan Micrococcus luteus ke dalam 10 ml media Heart Infusion Broth (HIB). Selanjutnya diinkubasikan selama 18-24 jam dalam inkubator suhu 36 0 C. Kuman siap digunakan untuk pengujian. Pembuatan Kultur Media Uji Sebanyak 6 gr peptone, 1,5 gr beef extract, 3 gr yeast extract, 1 gr D(+)glukosa dan 15-16 gr bacto agar dilarutkan dalam 1000 ml aquades, kemudian diukur pada ph 5,7 ± 0,1 dan dididihkan. Media disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121 0 C selama 15 menit. 28
Pembuatan Larutan Dapar Fosfat (Buffer) Sebanyak 7 gr KH 2 PO 4 dan 6 gr Na 2 HPO 4 dilarutkan dalam 1000 ml aquades, kemudian larutan disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121 0 C selama 15 menit. 3.4.4. Golongan Aminoglikosida Pembuatan Spora Bakteri Uji Bakteri Bacillus subtilis ditambahkan dalam agar miring dan diinkubasi pada suhu 36 0 C selama 1 (satu) minggu. Kemudian bakteri yang ditumbuhkan tersebut dipanen dan dimasukkan ke dalam larutan aquabides 20ml, sebanyak 4 tabung sentrifuge, lalu dipanaskan dalam waterbath pada suhu 65 0 C selama 30 menit. Selanjutnya suspensi dipusing 3000 rpm selama 10 menit dibuang supernatan (lapisan atasnya). Kedalam endapan tambahkan aquabides secukupnya, dikocok dan dimasukkan kedalam refrigerator dengan suhu 4 0 C selama 18-24 jam. Kemudian larutan dipanaskan kembali dalam waterbath dengan suhu 65 0 C selama 30 menit, setelah itu dipusing dengan kecepatan 1000 rpm selama 5 menit dan diambil lapisan atasnya. Hasilnya disimpan dalam refrigerator sebagai spora. Pembuatan Kultur Media Uji Sebanyak 5 gr peptone, 3 gr beef extract, 3 gr yeast extract, dan 15-16 gr bacto agar dilarutkan dalam 1000 ml aquades, kemudian diukur pada ph 5,7 ± 0,1 dan dididihkan. Media disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121 0 C selama 15 menit. Pembuatan Larutan Dapar Fosfat (Buffer) Sebanyak 6,4 gr KH 2 PO 4 dan 18,9 gr Na 2 HPO 4 dilarutkan dalam 1000 ml aquades, kemudian larutan disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121 0 C selama 15 menit. 29
3.4.5. Kalibrasi Spora/Kuman Media di panaskan dan simpan di dalam waterbath pada suhu 55 0 C. Kemudian di ambil sebanyak 100 ml, tambahkan spora yang akan diuji dan di kocok hingga larutan media dan kuman tercampur rata. Di pipet kultur media masing-masing sebanyak 8 ml (dilakukan 3 kali pengulangan) dan dibiarkan memadat. Kertas cakram (paper disk) diletakkan diatas permukaan kultur media dan ditetesi dengan larutan baku standar antibiotika. Sebelum diinkubasikan spora dibiarkan pada suhu kamar selama 1 jam. Inkubasikan di dalam inkubator dengan suhu sesuai dengan spora yang diuji, selama 18-24 jam. Hasil ditentukan dengan mengukur diameter daerah hambatan dengan menggunakan jangka sorong/kaliper 3.4.6. Penghitungan Spora Bakteri Dari contoh suspensi diatas dibuat pengenceran berseri sampai dengan 10-8, setiap konsentrasi pengenceran ditu ang ke dalam cawan petri masing-masing 1 ml (dilakukan 2 kali pengulangan), kemudian di tambahkan media agar sebanyak 15-20 ml dan digoyang hingga merata dan ditunggu sampai memadat. Selanjutnya cawan petri di inkubasi selama 18-24 jam pada masing-masing temperatur tergantung jenis sporanya dan tiap cawan petri di hitung dan koloni yang di hitung jumlahnya antara 25-250. Gambar 2. Bagan Penghitungan Spora 1 ml SPORA 10 0 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml + 9 ml + 9 ml + 9 ml + 9 ml + 9 ml + 9 ml + 9 ml + 9 ml 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 + 1 ml + 1 ml + 1 ml + 1 ml + 1 ml + 1 ml + 1 ml + 1 ml 30
Masing-masing cawan petri diisi dengan 15-20 ml media agar dan 1 ml spora. 3.4.7. Cara Menyatakan Hasil Hasil yang dilaporkan hanya terdiri dari dua angka, yaitu angka pertama di depan koma dan angka kedua dibelakang koma. Jika angka yang ketiga sama dengan atau lebih besar dari 5, harus dibulatkan satu angka lebih tinggi pada angka yang kedua. Tabel 3. Standar Penghitungan Cawan Jumlah Koloni Standar Per Pengenceran Penghitungan Cawan Keterangan 10-1 10-2 10-3 200 23 1 20 x 10-4 23 dan 1 < 25 700 125 10 1,3 x 10-5 700>250 ; 10<25 Jika cawan dari dua tingkat pengenceran menghasilkan koloni dengan jumlah antara 25 dan 250, dan perbandingan antara hasil tertinggi dan terendah dari kedua pengenceran tersebut lebih kecil dari atau sama dengan 2, tentukan rata-rata dari kedua nilai tersebut dengan memperhitungkan pengencerannya. Jika perbandingan antara hasil tertinggi dan terendah lebih besar 2, yang dilaporkan hanya hasil yang terkecil. Tabel 4. Standar Penghitungan Cawan Jumlah Koloni Per Pengenceran Standar Penghitungan Cawan Keterangan 10-2 10-3 10-4 250 41 4 4,1 x 10-4 Hitung rata-rata : 41000\25000=1,64 (<2) 140 32 2 1,4 x 10-4 Hitung rata-rata : 32000\14000=2,3 (>2) 31
3.4.8. Pembuatan Larutan Standar Kerja Penisilin Masing-masing standar baku ditimbang dengan memperhatikan potensi standar Penisilin dengan larutan dapar sampai konsentrasi 0,1 µg/ml. Larutan Stok Standar Konsentrasi 1000 µg/ml Konsentrasi menjadi 100 µg/ml Konsentrasi menjadi 10 µg/ml Konsentrasi menjadi 1 µg/ml Konsentrasi menjadi 0,1 µg/ml Konsentrasi menjadi 0,01 µg/ml (sebagai larutan standar kerja) Tetrasiklin Masing-masing standar baku ditimbang dengan memperhatikan potensi standar Tetrasiklin dengan larutan dapar sampai konsentrasi 1µg/ml. 32
Larutan Stok Standar Konsentrasi 1000 µg/ml Konsentrasi menjadi 100 µg/ml Konsentrasi menjadi 10 µg/ml Konsentrasi menjadi 1 µg/ml (sebagai larutan standar kerja) Aminoglikosida Masing-masing standar baku ditimbang dengan memperhatikan potensi standar Aminogliksida dengan larutan dapar sampai konsentrasi 1µg/ml. Larutan Stok Standar Konsentrasi 1000 µg/ml Konsentrasi menjadi 100 µg/ml Konsentrasi menjadi 10 µg/ml Konsentrasi menjadi 1 µg/ml (sebagai larutan standar kerja) 33
Makrolida Masing-masing standar baku ditimbang dengan memperhatikan potensi standar Makrolida dengan larutan dapar sampai konsentrasi 1µg/ml. Larutan Stok Standar Konsentrasi 1000 µg/ml Konsentrasi menjadi 100 µg/ml Konsentrasi menjadi 10 µg/ml Konsentrasi menjadi 1 µg/ml (sebagai larutan standar kerja) 3.4.9. Pengujian Sampel Sebanyak 10 gram contoh masing-masing sampel (daging paha, sayap, dada, hati, ginjal dan kaki bagian metatarsal) dimasukkan kedalam tabung sentrifuge, ditambahkan 20 ml larutan dapar dihomogenkan, kemudian di sentrifuge 3000 rpm selama 10 menit untuk mendapatkan larutan supernatannya. Sementara itu kultur media agar disiapkan untuk masing-masing kelompok antibiotika. Selanjutnya kertas cakram steril diletakkan di atas permukaan kultur media. Tiap cawan petri berisi 5 buah kertas cakram, 4 buah kertas cakram ditetesi dengan mikro pipet steril berisi larutan sampel dan 1 buah kertas cakram ditetesi dengan larutan standar antibiotika. Selanjutnya kultur media diinkubasikan pada suhu 30 0 C untuk golongan tetrasiklin 30 0 C, untuk golongan makrolida dan aminoglikosida pada suhu 36 0 C sedangkan penisilin pada suhu 55 0 C masingmasing selama 16-18 jam. Pengujian sampel dilakukan sebanyak 2 kali 34
pengulangan. Setelah itu hasil uji ditentukan dengan menggunakan jangka sorong/kaliper. Sampel yang terbentuk zona hambatan diplotkan pada kertas semi logaritma kurva standar masing-masing antibiotika. 3.4.10. Pengukuran Hasil Diamati dan diukur diameter zona hambat yang terbentuk di sekeliling kertas cakram dengan menggunakan jangka sorong (kaliper). Sampel dinyatakan positif mengandung antibiotik apabila zona hambat yang terbentuk 2 mm dari tepi kertas cakram. Sampel dinyatakan negatif apabila zona hambat yang terbentuk 0 2 mm. Karena zona hambat yang terbentuk < 2 mm dianggap akibat adanya natural inhibitor. Kontrol positif harus membentuk zona hambat 15 30 mm, sedangkan kontrol negatif harus tidak membentuk zona hambat. 3.4.11. Pembuatan Standar Kurva Antibiotika Kultur media disiapkan untuk masing-masing antibiotika. Kemudian di encerkan larutan stock solution standar untuk masing-masing standar antibiotika dengan komposisi konsentrasi bervariasi. Variasi konsentrasi untuk antibiotika oksitetrasiklina, aminoglikosida dan makrolida adalah 0,25 ; 0,5 ; 1,0 ; 2,0 dan 4,0. Sedangkan variasi konsentrasi untuk antibiotika penisilina adalah 0,01 ; 0,1 ; 0,25 dan 1 µg/ ml. Selanjutnya kertas cakram steril diletakkan diatas permukaan kultur media. Tiap cawan petri berisi 4 buah kertas cakram Sebelum di inkubasi, kultur media dibiarkan pada suhu kamar selama 30-60 menit. Inkubasikan di dalam inkubator, untuk oksitetrasiklin pada suhu 30 0 C, makrolida dan tilosin pada suhu 36 0 C dan penisilin pada suhu 55 0 C, masing-masing selama 18-24 jam. Hasil uji ditentukan dengan menggunakan jangka sorong/kaliper dan dikonfirmasi pada kurva standar masing-masing anti biotika. 35