3. METODOLOGI. Penelitian ini dilakukan dari bulan Januari sampai Mei Proses

3. METODOLOGI 3.1 Waktu dan Lokasi Penelitian Penelitian ini dilakukan dari bulan Januari sampai Mei 2012. Proses pengambilan sampel rumput laut dilakukan pada tanggal 4 Februari 2012 di perairan Pulau Pari, Kepulauan Seribu, DKI Jakarta dengan posisi titik koordinat 05 52' 12,1'' LS dan 106 36' 45,2'' BT (Gambar 13). Analisis uji proksimat dan proses hidrolisis rumput laut dilakukan di Laboratorium Bioetanol, Surfactant and Bioenergy Research Center (SBRC), Lembaga Penelitian dan Pengabdian Masyarakat (LPPM), Institut Pertanian Bogor. Gambar 13. Peta lokasi pengambilan sampel rumput laut 24

25 3.2 Alat dan Bahan Alat dan bahan yang digunakan pada penelitian disajikan pada Tabel 2. Tabel 2. Alat dan bahan yang digunakan pada penelitian Alat Bahan Nama Spesifikasi Nama Spesifikasi GPS Garmin Map 76 SeO 2 (PA) Blender Philip BL 1516 K 2 SO 4 (PA) Neraca Analitik Precisa XT 220 A CuSO 4. H 2 O (PA) Labu Kjeldhal Pyrex 100 ml H 3 BO 3 2% (PA) Hotplate Labinco L-32 Akuades (Teknis) 1 Set Ekstrator Soxhlet Pyrex HCl 37% (PA) Gelas Beker Schott Duran 500 ml NaOH (PA) Erlenmeyer Schott Duran 500 ml N-Hexana (PA) Labu Ukur Pyrex 500 ml Kertas Saring Whatman 41 Pipet Volumetrik Pyrex 10 ml Kertas Lakmus Merck KGaA 64271 Pipet Mohr Pyrex 5 ml Phenolpthalein (PA) Gelas Ukur Pyrex 100 ml KI (PA) Buret Pyrex 100 ml Na-Tiosulfat (PA) Cawan Porselin Pyrex 30 ml Kanji 0,5% (Teknis) Pipet Mikro Gilson NG348811 Na 2 CO 3 (PA) Vortek Thermolyne MAXI Asam Sitrat (PA) Tabung Reaksi Pyrex 16 ml x 150 ml H 2 SO 4 98% (PA) Laptop Acer Aspire 4736 Asam 3,5 Dinitrosalisilat (PA) Perangkat Lunak Microsoft Excel 2007 Alumium foil Klinpak 8 m X 30 cm Oven EYELA NDO-400 Na-K-Tatrat (PA) Pembakar Sanken 562221 Fenol (PA) 1 Set Pompa Vakum Model VE115N Na-Metabisulfit (PA) Autoclave Model 19411N Rumput laut kering jenis Caulerpa racemosa Spektrofotometer Visible Light Genesys 20 Rumput laut kering jenis Sargassum crassifolium Tanur Nabertherm Rumput laut kering jenis Gracilaria salicornia

26 3.3 Prosedur Kerja 3.3.1 Preparasi Rumput Laut Preparasi rumput laut dilakukan dengan melalui tahapan proses perendaman, pengeringan, dan pencacahan (Lampiran 1). a. Perendaman Rumput laut yang diambil dari perairan Pulau Pari, Kepulauan Seribu, direndam dengan air tawar untuk menurunkan kadar garam dan menghilangkan kotoran yang melekat pada rumput laut. b. Pengeringan Rumput laut yang telah dicuci, kemudian dikeringkan di bawah sinar matahari selama kurang lebih 2-3 hari, selanjutnya dimasukkan ke dalam oven dengan suhu 60 C selama kurang lebih 6 jam. c. Pencacahan Rumput laut yang telah dikeringkan, kemudian dicacah dengan cara dimasukkan ke dalam mesin pencacah hingga terbentuk potongan-potongan kecil. 3.3.2 Uji Proksimat Uji proksimat dilakukan pada rumput laut untuk mengetahui komposisi kimia dalam tubuh rumput laut. Analisis uji proksimat dalam menentukan kadar air, kadar abu, kadar protein, kadar lemak, kadar karbohidrat, dan kadar serat kasar pada rumput laut yang menggunakan metode AOAC (1995) dideskripsikan sebagai berikut :

27 a. Kadar Air Sampel rumput laut sebanyak 2 gr dimasukkan ke dalam cawan aluminium yang telah diketahui beratnya, kemudian dikeringkan dalam oven dengan suhu 100 C sampai 105 C selama 6 jam. Setelah itu, cawan didinginkan ke dalam desikator selama 30 menit sampai suhu ruang dan dilakukan proses penimbangan. Proses tersebut dilakukan hingga didapatkan berat konstan. Kadar air ditentukan dengan rumus : Kadar air (%) = B-A B X 100% (1) Keterangan : A = Berat akhir rumput laut setelah dikeringkan (gr) B = Berat awal rumput laut basah (gr) b. Kadar Abu Sampel rumput laut sebanyak 1 gr dimasukkan ke dalam cawan porselin yang telah diketahui beratnya kemudian diarangkan di atas nyala pembakar, kemudian diabukan ke dalam tanur pada suhu 550 C selama 4 jam hingga diperoleh abu berwarna putih. Setelah itu, cawan didingikan ke dalam desikator selama 30 menit sampai suhu ruang dan timbang hingga didapatkan berat konstan. Kadar abu ditentukan dengan rumus : Kadar abu (%) = B A X 100%..(2) Keterangan : A = Berat awal rumput laut basah (gr) B = Berat akhir rumput laut setelah pengabuan (gr)

28 c. Kadar Protein Sampel rumput laut sebanyak 0,5 gr dimasukkan ke dalam labu kjeldahl ukuran 100 ml. Sampel ditambahkan 2 gr campuran selen (2,5 gr SeO 2, 100 gr K 2 SO 4 dan 20 gr CuSO 4. 5H 2 O) dan 2 ml H 2 SO 4 pekat. Setelah itu, campuran dipanaskan di atas pemanas selama 90 menit sampai mendidih dan larutan menjadi jernih kehijauan. Larutan diencerkan menggunakan akuades dalam labu ukur 100 ml sampai batas tera. Larutan dari labu ukur diambil menggunakan pipet 5 ml dan ditambahkan 10 ml NaOH pekat hingga berwarna cokelat kehitaman kemudian dilakukan proses destilasi. Larutan hasil destilasi dimasukkan ke dalam Erlenmeyer 125 ml yang berisi 5 ml H 3 BO 3 dan 2 tetes indikator (campuran metil merah dan metil biru dalam alkhohol) kemudian larutan dititrasi dengan menggunakan HCl 0,02 N. Kadar protein ditentukan dengan rumus : (No) (%) = (V 1 V 2 ) X N X 14,007 X 100% (3) w Kadar protein (%) = (No) (%) X 6,25..(4) Keterangan : w = Berat contoh rumput laut (mg) V 2 = Volume HCl penitaran contoh rumput laut (ml) V 1 = Volume HCl penitaran blanko N = Normalitas HCl No = Kadar Nitrogen d. Kadar Lemak Sampel rumput laut sebanyak 5 gr dibungkus dengan kertas saring kemudian dimasukkan ke dalam tabung soklet. Labu lemak ditambahkan pelarut non polar sebanyak 150 ml dan direfluks diatas penangas selama 6 jam. Setelah itu, labu lemak dan sisa dari pelarut non polar dimasukkan ke dalam oven dengan

29 suhu 105 C selama 1 jam. Kemudian labu lemak didinginkan ke dalam desikator selama 30 menit dan ditimbang hingga didapatkan berat konstan. Kadar lemak ditentukan dengan rumus : Kadar lemak (%) = C-B A X 100% (5) Keterangan : A = Berat contoh rumput laut (gr) B = Berat labu lemak sebelum ekstraksi (gr) C = Berat labu lemak setelah ekstraksi (gr) e. Kadar Karbohidrat Sampel rumput laut sebanyak 5 gr dimasukkan ke dalam Erlenmeyer ukuran 500 ml. Setelah itu, sampel ditambahkan 200 ml HCl 3% dan selanjutnya dididihkan selama 3 jam dengan pendingin tegak. Larutan hidrolisat didinginkan dan dinetralkan menggunakan NaOH 30%. Larutan hidrolisat ditambahkan indikator phenolpthalein 3 tetes dan diencerkan dengan akuades sampai batas tera 500 ml dalam labu ukur kemudian disaring menggunakan kertas saring. Larutan hidrolisat diambil 10 ml menggunakan pipet dan dimasukkan ke dalam Erlenmeyer 500 ml, lalu larutan ditambahkan 25 ml larutan Luff Schrool dan 15 ml akuades serta batu didih. Larutan dipanaskan selama 3 jam dengan waktu hitung dimulai saat mendidih. Larutan hidrolisat yang telah didinginkan kemudian ditambahkan 15 ml larutan KI 20% dan 25 ml H 2 SO 4 25%. Larutan hidrolisat dititrasi dengan larutan natrium tiosulfat 0,1 N yang telah distandarisasi dan kadar karbohidrat dihitung menggunakan Tabel Luff Schrool (Lampiran 2).

30 Kadar karbohidrat ditentukan dengan rumus : G = (V 1 V 2 ) X N 0,1.. (6) Kadar karbohidrat (%) = 0,9 X G X P g X 100%..(7) Keterangan : P = Jumlah pengenceran G = Glukosa setara dengan (ml) natrium tiosulfat g = Berat contoh rumput laut (mg) 0,9 = Faktor pembanding berat molekul satu unit gula dalam molekul pati V 1 = Volume natrium tiosulfat blanko (ml) V 2 = Volume natrium tiosulfat sampel (ml) N = Normalitas natrium tiosulfat (N) f. Kadar Serat Kasar Sampel rumput laut sebanyak 5 gr dimasukkan ke dalam Erlenmeyer 500 ml. Setelah itu, sampel ditambahkan 50 ml larutan H 2 SO 4 1,25% kemudian dididihkan selama 30 menit. Sampel ditambahkan 50 ml NaOH 3,25% dan dididihkan lagi selama 30 menit. Sampel disaring dengan corong bucheri berisi kertas saring yang telah dikeringkan dan telah diketahui beratnya dengan pompa vakum dalam keadaan panas. Endapan yang terdapat pada kertas saring dicuci dengan H 2 SO 4 1,25% panas, akuades dan etanol 96%. Kertas saring dan isinya dimasukkan ke dalam oven dengan suhu 105 C selama 3 jam. Kertas saring dan isinya didinginkan dalam desikator selama 30 menit sampai suhu ruang dan ditimbang hingga didapatkan berat konstan.

31 Kadar serat kasar ditentukan dengan rumus : Kadar serat kasar % = B A X 100% (8) Keterangan : B = Berat endapan rumput laut kering (gr) A = Berat contoh rumput laut (gr) 3.3.3 Hidrolisis Rumput Laut Hidrolisis dilakukan untuk memecah polisakarida menjadi monosakarida dengan memutus dan memotong rantai ikatan 1,4 alfa-glikosida pada rumput laut. Hidrolisis rumput laut dilakukan melalui proses pembuatan asam sulfat encer dan hidrolisis asam. a. Proses Pembuatan Asam Sulfat Encer Proses pembuatan asam sulfat encer dilakukan dengan dua tahap pengenceran. Tahap pertama adalah proses pembuatan asam sulfat encer dengan konsentrasi 10% (v/v). Tahap pertama dilakukan dengan cara asam sulfat pekat dengan konsentrasi 98% (v/v) diambil 105 ml menggunakan pipet lalu dimasukkan ke dalam labu ukur 1 lt. Setelah itu, asam sulfat diencerkan dengan akuades hingga batas tera 1 lt pada labu ukur dan dilakukan pengadukan agar terjadi proses homogenisasi. Tahap kedua adalah proses pembuatan asam sulfat encer dengan konsentrasi 1%, 2% dan 3% (v/v). Tahap kedua dilakukan dengan cara mengencerkan kembali asam sulfat encer konsentrasi 10% (v/v) menjadi asam sulfat dengan konsentrasi 1%, 2% dan 3% (v/v). Tahap kedua dilakukan dengan cara mengambil asam sulfat konsentrasi 10% (v/v) sebanyak 100 ml, 200 ml dan 300 ml menggunakan pipet lalu dimasukkan ke dalam 3 buah labu ukur

32 ukuran 1 lt yang berbeda. Kemudian asam sulfat diencerkan dengan akuades hingga batas tera 1 lt pada tiap labu ukur dan dilakukan pengadukan agar terjadi proses homogenisasi. Pengenceran asam sulfat ditentukan dengan rumus : V 1 X M 1 = V 2 X M 2.(9) Keterangan : V 1 = Volume awal atau volume yang dipakai (ml) V 2 = Volume akhir atau volume yang dibutuhkan (ml) M 1 = Konsentrasi awal (% (v/v)) M 2 = Konsentrasi akhir (% (v/v)) b. Hidrolisis Asam Sulfat Hidrolisis asam sulfat pada rumput laut dilakukan menggunakan konsentrasi padatan sebesar 15% (b/v) pada suhu 121 C dan tekanan 1 atm selama 45 menit. Yoon et al. (2010) mengatakan hidrolisis asam sulfat optimum Gelidium amansii menggunakan konsentrasi padatan sebesar 15% (b/v). Setyaningsih et al. (2011) menambahkan hidrolisis asam sulfat optimum Sargassum sp dan limbah agar Gracilaria sp menggunakan konsentrasi padatan sebesar 15% (b/v) pada suhu 121 C dan tekanan 1 atm selama 45 menit. Sampel sebanyak 3 gr dimasukkan ke dalam botol selai. Sampel ditambahkan 20 ml asam sulfat encer 1%, 2% dan 3% (v/v) ke dalam botol selai pada tiap perlakuan dengan tiga kali ulangan. Botol selai dimasukkan ke dalam autoclave dan dilakukan proses hidrolisis pada suhu 121 C dan tekanan 1 atm selama 45 menit. Sampel rumput laut hasil hidrolisis didinginkan dan dinetralkan menggunakan NaOH 20% (v/v). Rumput laut hasil hidrolisis disaring dengan pompa vakum dan corong bucheri berisi kertas saring yang telah dikeringkan dan telah diketahui berat keringnya hingga didapatkan cairan hidrolisat dan padatan tersuspensi.

33 3.3.4 Uji Gula Pereduksi Gula pereduksi merupakan gula yang mampu mereduksi dan mengubah gugus aldehid dan keton menjadi karboksilat. Uji gula pereduksi melalui tahapan proses persiapan pereaksi asam 3,5 dinitrosalisilat (DNS), penentuan kurva standar asam 3,5 dinitrosalisilat (DNS), dan penentuan kandungan gula pereduksi. a. Persiapan Pereaksi Asam 3,5 Dinitro Salisilat (DNS) Pereakasi asam 3,5 dinitro salisilat (DNS) dibuat dengan sebanyak 10,6 gr asam 3,5 dinitrosalisilat dan 19,8 NaOH dilarutkan ke dalam 1.416 ml akuades. Setelah itu, larutan ditambahkan 306 gr Na-K Tatrat, 7,6 gr fenol yang dicairkan pada suhu 50 C dan 8,3 gr Na-Metabisulfit. Larutan diaduk hingga merata kemudian larutan dititrasi dengan HCl 0,1 N dengan indikator phenolphthalein. b. Penentuan Kurva Standar Penentuan kurva standar dibuat dengan mengukur absorbansi sampel untuk mengetahui nilai kandungan gula pereduksi glukosa pada selang 0,2-0,5 mg/lt, kemudian kadar gula pereduksi ditentukan dengan metode DNS. Hasil yang didapatkan kemudian diplotkan ke dalam grafik secara linear. c. Penentuan Gula Pereduksi Cara kerja yang digunakan dalam penetuan kadar gula pereduksi adalah cairan hidrolisat sebanyak 1 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan 3 ml pereaksi DNS. Setelah itu, larutan dihomogenisasi menggunakan alat vorteks. Larutan kemudian dipanaskan dalam gelas ukur yang berisi akuades selama 5 menit dan didinginkan pada suhu ruang. Absorbansi larutan tersebut diukur menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 550 nm.

34 3.3.5 Uji Efisiensi Hidrolisis Efisiensi hidrolisis diperoleh dengan membagi selisih antara nilai total berat awal rumput laut sebelum proses hidrolisis dan nilai total berat rumput laut yang mengendap pada kertas saring setelah proses hidrolisis dengan nilai total berat awal rumput laut sebelum proses hidrolisis. Efisiensi hidrolisis dalam penelitian ini lebih diutamakan pada proses hidrolisis. Efisiensi hidrolisis dihitung dengan rumus : Efisiensi hidrolisis % = B-A B X 100 %.(10) Keterangan : B = Total berat awal rumput laut sebelum proses hidrolisis (gr) A = Total berat akhir rumput laut setelah proses hidrolisis (gr) 3.3.6 Rancangan Percobaan Rancangan percobaan yang digunakan dalam penentuan nilai gula pereduksi dan efisiensi hidrolisis untuk tiap spesies rumput laut terhadap konsentrasi asam sulfat 1%, 2% dan 3% (v/v) dengan tiga kali ulangan pada tiap perlakuan dilakukan menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL). Rancangan percobaan yang digunakan untuk membandingkan nilai gula pereduksi dan efisiensi hidrolisis antara ketiga kelompok rumput laut terhadap konsentrasi asam 1%, 2% dan 3% (v/v) dengan tiga kali ulangan pada tiap perlakuan dilakukan menggunakan Rancangan Acak Kelompok (RAK).

35 Rancangan Acak Lengkap (RAL) dinyatakan dengan model rumus : Y ij = µ + A i + Є ij (11) Keterangan : Y ij = Nilai pengamatan rumput laut perlakuan ke-i ulangan ke-j i = Perbedaan konsentrasi asam j = Ulangan dari tiap perlakuan µ = Nilai tengah umum A i = Pengaruh perlakuan ke-i Є ij = Pengaruh galat ke-i ulangan ke-j Rancangan Acak Kelompok (RAK) dinyatakan dengan model rumus : Y ij = µ + A i + B j + Є ij..(12) Keterangan : Y ij = Nilai pengamatan rumput laut perlakuan ke-i ulangan ke-j i = Perbedaan konsentrasi asam j = Ulangan dari tiap perlakuan µ = Nilai tengah umum A i = Pengaruh perlakuan ke-i B j = Pengaruh kelompok ke-j Є ij = Pengaruh galat ke-i ulangan ke-j 3.3.7 Analisis Data a. Analisis Data Uji Proksimat Analisis data uji proksimat dilakukan dengan tiga kali ulangan kemudian dihitung nilai rata-rata dan nilai standar deviasi dari tiap parameter. Nilai rata-rata menunjukkan kadar komposisi kimia, sedangkan standar deviasi menunjukkan tingkat penyimpangan analisis kadar komposisi kimia rumput laut.

36 b. Analisis Data Gula Pereduksi dan Efisiensi Hidrolisis Analisis data gula pereduksi dan efisiensi hidrolisis dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak Microsoft Excel 2007. Analisis ragam uji F terhadap variabel yang diamati dilakukan untuk mengetahui pengaruh perlakuan yang diberikan dengan hipotesis sebagai berikut : Pengaruh faktor konsentrasi asam: H : α =... = α = 0 (faktor konsentrasi asam tidak berpengaruh) 0 1 2 H 1 : paling sedikit ada satu taraf dimana α i 0 Pengaruh faktor jenis spesies: H 0 : α 1 =... = α 2 = 0 (faktor jenis spesies tidak berpengaruh) H 1 : paling sedikit ada satu taraf dimana α i 0 Kriteria pengambilan keputusan untuk kriteria yang diuji adalah : F hitung < F tabel : terima H 0 F hitung > F tabel : tolak H 0