IV. HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Isolasi Bakteri Kandidat Probiotik dari Saluran Pencernaan Udang Hasil isolasi bakteri kandidat probiotik dari saluran pencernaan udang didapat total sebanyak 30 isolat bakteri untuk diseleksi lebih lanjut. Isolat bakteri ini diambil berdasarkan koloni yang berbeda. Morfologi koloni isolat bakteri yang didapat adalah bulat sedang, tidak beraturan, warna krem; bulat besar menipis ke pinggir, tepian bergerigi, warna krem; bulat melebar, tepi berserabut, warna bening; bulat, menipis ke tepi, warna bening. Seleksi Bakteri Kandidat Probiotik 1. Aktivitas Proteolitik, Lipolitik dan Amilolitik Hasil uji aktivitas proteolitik, lipolitik dan amilolitik terhadap bakteri kandidat probiotik disajikan pada Gambar 2. Hasil uji aktivitas proteolitik ditandai dengan adanya zona bening di sekeliling koloni isolat, aktivitas lipolitik ditunjukkan dengan adanya warna hijau di sekeliling koloni isolat dan aktivitas amilolitik ditandai zona kuning bening di daerah isolat yang ditumbuhkan. aktivitas proteolitik aktivitas lipolitik aktivitas amilolitik Gambar 2 Hasil aktivitas proteolitik, lipolitik dan amilolitik. Hasil pengukuran luas diameter hasil aktivitas disajikan pada Gambar 3 dan Lampiran 5. Dari hasil pengukuran diameter hidrolisis protease didapatkan tiga isolat dengan diameter tertinggi sebesar 20 mm yaitu K9, K19 dan Z1. Isolat yang mampu menghidrolisis lipase paling tinggi yaitu isolat Z5 dengan diameter 12 mm disusul Z3 diameter 9 mm dan isolat yang mampu menghidrolisis amilase paling tinggi yaitu M1 dan M2 dengan diameter 15 mm. Isolat-isolat tersebut selanjutnya diuji lanjut berdasarkan tahapan seleksi bakteri probiotik. Adanya kemampuan menghidrolisis protease, lipase dan amilase ini menunjukkan bahwa
20 isolat-isolat tersebut mampu memanfaatkan sumber energi yaitu kasein, lemak dan pati yang ditambahkan pada media menjadi sumber karbon. Gambar 3 Diameter hidrolisis enzim oleh isolat proteolitik, lipolitik dan amilolitik. 2. Ketahanan terhadap Asam Lambung dan Garam Empedu Toleransi terhadap asam merupakan salah satu syarat penting suatu isolat untuk dijadikan kandidat probiotik. Hasil dari pengujian ketahanan terhadap asam lambung dan garam empedu disajikan pada Gambar 4, Gambar 5 dan Lampiran 6 Gambar 4 Selisih log (CFU/ml) antara jumlah isolat pada ph 2,5 dengan ph normal setiap periode pengamatan.
21 Gambar 5 Selisih log (CFU/ml) antara jumlah isolat pada ph 7,5 dengan ph normal. Hasil pengujian terhadap asam lambung menunjukkan bahwa isolat S3 dan K9 memiliki selisih terkecil yang berarti lebih tahan terhadap ph asam lambung dibandingkan isolat lainnya. Isolat harus tahan terhadap ph asam lambung untuk mampu bertahan hidup dalam saluran pencernaan. Apabila sel bakteri terpapar pada kondisi yang sangat asam maka membran sel dapat mengalami kerusakan dan berakibat pada hilangnya komponen-komponen intraseluler seperti Mg, K dan lemak dari sel tersebut. Pada akhirnya kerusakan ini dapat mengakibatkan kematian sel (Bender & Marquis 1987). Hasil pengujian terhadap garam empedu menunjukkan bahwa isolat K9 merupakan isolat yang paling mampu beradaptasi karena selisih log populasinya paling kecil diantara semua isolat. 3. Fase Pertumbuhan Bakteri Hasil pengamatan nilai kerapatan optik Optical Density ditunjukkan pada Gambar 6 dan Lampiran 7. Dari kurva pertumbuhan terlihat bahwa setiap isolat memiliki pertumbuhan yang bervariasi. Hasil pengamatan nilai kerapatan optik didapatkan rata rata akhir eksponensial dengan jumlah sel tertinggi terjadi pada jam ke 16 dan 18. Waktu tersebut selanjutnya digunakan sebagai dasar pemanenan sel bakteri.
Gambar 6 Kurva nilai kerapatan optik (Optical Density). 22
23 4. Aktivitas Antagonistik terhadap Bakteri Patogen Hasil uji aktivitas antagonistik ditunjukkan pada Gambar 7. Isolat bakteri kandidat probiotik rata-rata memiliki daya hambat terhadap bakteri patogen yaitu V.harveyi dimana aktivitas ini ditandai dengan adanya zona hambat di sekeliling isolat yang ditanam. Gambar 7 Aktivitas antagonistik bakteri kandidat probiotik terhadap V. harveyi. Hasil pengukuran zona hambat isolat kandidat probiotik disajikan pada Gambar 8 dan Lampiran 8. Kandidat probiotik diharapkan mampu menekan pertumbuhan bakteri patogen dalam saluran pencernaan. Hal ini dapat terjadi karena kandidat yang mampu menekan pertumbuhan bakteri patogen mampu menghasilkan antibakteri. Pemilihan probiotik salah satu kriterianya berdasarkan kemampuannya memiliki aktivitas antagonistik dimana pada penelitian ini ditujukan untuk bakteri patogen udang yatu Vibrio harveyi. Gambar 8 Diameter zona hambat bakteri kandidat probiotik terhadap V.harveyi.
24 Dari hasil uji aktivitas antagonistik didapatkan hasil bahwa bakteri kandidat probiotik rata-rata mampu menekan pertumbuhan V.harveyi. Zona hambat terbaik dihasilkan oleh isolat S2 dengan diameter 13 mm namun ada satu isolat yang tidak mampu menghambat bakteri patogen yaitu isolat bakteri Z10. 5. Penempelan Bakteri Kandidat Probiotik Faktor penempelan atau adherence factor merupakan faktor yang dimiliki oleh bakteri untuk menempel dan membentuk biofilm pada permukaan padat (Characklis 1990). Hal yang mempengaruhi sifat penempelan bakteri pada permukaan padat adalah sifat hidrofobisitas antar sel bakteri, jarak antar sel dan adanya reseptor pada sel inang (Zita & Hermannson 1997). Uji penempelan terhadap kandidat probiotik memberikan hasil yang berbeda pada setiap kandidat probiotik seperti ditunjukkan pada Gambar 9 dan Lampiran 9. Untuk kandidat probiotik terpilih (Z3, K9, S3 dan M2) menunjukkan adanya kemampuan menempel pada substrat. Isolat K9 memiliki jumlah koloni 14.000 koloni /mm 2 yang artinya isolat ini mampu menempel dengan baik. Gambar 9 Hasil uji penempelan bakteri kandidat probiotik pada lempeng baja. 6. Aktivitas Patogenisitas Hasil yang didapat dari uji patogenisitas membuktikan bahwa kandidat probiotik yang terpilih (M2, Z3, K9 dan S3) tidak bersifat patogen. Hal ini
25 dibuktikan dari hasil kelangsungan hidup udang 100 %. Udang yang disuntik dengan isolat bakteri kandidat probiotik mampu bertahan hidup selama masa uji dan kondisi tubuhnya tidak ada perbedaan dengan udang kontrol atau yang disuntik dengan larutan fisiologis. Dengan hasil ini maka kandidat probiotik dapat diaplikasikan sebagai probiotik pada penambahan pakan yang akan diberikan pada udang. Pakan Percobaan Udang vaname 1. Pertumbuhan Udang Hasil uji pertumbuhan disajikan pada Tabel 2 yang meliputi beberapa parameter yang dianalisis. Pemberian pakan yang ditambahkan kandidat probiotik yang memiliki aktivitas enzim memberikan pengaruh yang nyata (P<0,05) terhadap pertumbuhan udang vaname dibandingkan dengan pertumbuhan udang yang diberikan pakan kontrol atau tanpa penambahan probiotik. Tabel 2 Pertumbuhan relatif (PR), kelangsungan hidup (SR), konversi pakan (KP), retensi protein (RP), kecernaan total (KT) dan kecernaan protein (KP ) udang vaname Parameter Perlakuan (jenis bakteri) M2 Z3 K9 S3 Kontrol PR (%) 71,2±8,9 bc 63,3±2,9 b 91,1±0,01 d 79,5±0,04 c 48,9±0,04 a SR(%) 95,56 ± 0,57 a 96,67 ± 0,57 a 98,02 ± 0,5 a 100,0 ± 0,00 a 81,11 ± 4,04 a KP(%) 2,16±0,112 a 2,21±0,15 a 1,83±0,09 b 1,83±0,036 b 2,29±0,083 a RP(%) 37,12±2,22 bc 32,87±3,21 b 46,97±3,27 d 39,78±2,02 c 23,38±1,96 a KT (%) 72,97±1,80 a b 76,16±2,33 cd 75,61±1,54 bc 78,55±0,76 d 71,78±1,98 a KP (%) 76,34±2,03 bc 76,75±2,64 cd 79,93±1,37 d 79,27±1,03 d 73,36±1,36 a Keterangan : (p<0,05) Huruf yang berbeda pada garis yang sama menunjukkan perbedaan antar perlakuan. Hasil terbaik pertumbuhan udang vaname ditunjukkan oleh perlakuan K9 yaitu pemberian pakan yang ditambah isolat yang memiliki aktivitas enzim protease dan selanjutnya perlakuan S3 yaitu pemberian pakan yang ditambah isolat yang memiliki aktivitas protease, lipase dan amilase. Hasil pertumbuhan
26 udang vaname pada kedua perlakuan ini lebih baik dibandingkan perlakuan lainnya (Lampiran 10 dan Lampiran 11). Hal ini diduga karena dengan kecernaan protein yang tinggi yaitu 79,93%±1,37 (Lampiran 12) sehingga mampu meningkatkan retensi protein sebesar 46,97%±3,27 (Lampiran 13 dan Lampiran 14). Perlakuan K9 juga menunjukkan hasil konversi pakan yang baik yaitu 1,83±0,09 (Lampiran 15) yang berarti bahwa pakan yang dibutuhkan untuk menjadikan kg daging sebesar 1,83 kg dan ini lebih efektif dalam penggunaan protein baik sebagai sumber energi atau sebagai zat pembangun tubuh sehingga protein yang tidak tercerna dan keluar dalam bentuk sisa metabolisme dapat dikurangi. Kelangsungan hidup selama pemeliharaan udang vaname menunjukkan tidak ada perbedaan yang nyata antara perlakuan dengan kontrol (Lampiran 16). Selama pemeliharaan salinitas air 15 sesuai dengan kondisi di tambak udang, DO berkisar di 5,0 6,8 dan amoniak berkisar di 0,01 0,02 dan ph berkisar pada 7,5 7,9 (Lampiran 17). 3. Aktivitas Enzim Saluran Pencernaan Hasil uji aktivitas enzim saluran pencernaan udang disajikan pada Tabel 3 dan Lampiran 18. Dari hasil analisis aktivitas enzim pada saluran pencernaan udang didapatkan aktivitas enzim protease, lipase dan amilase saluran udang yang sejalan dengan kemampuan bakteri dalam menghidrolisis protein, lemak dan karbohidrat pada uji in vitro. Sehingga bakteri yang mampu menghidrolisis protein, lemak dan karbohidrat ini pada saat ditambahkan ke dalam pakan mampu menyumbangkan enzim eksogenous pada udang vaname. Tabel 3 Aktivitas enzim protease, lipase, amilase dan populasi bakteri (PB) Parameter Perlakuan (jenis bakteri) M2 Z3 K9 S3 Kontrol Protease (UA/menit) 0,0892 0,0975 0,1157 0,1742 0,0182 Lipase (µmol AL/menit) 1,565 157,165 33,985 131,255 22,255 Amilase (UA/ menit) 0,0022 0,0028 0,0063 0,0348 0,0134 PB (Log cfu/g) 7,14±0,019 b 7,86±0,16 b 7,96±0,33 b 7,96±0,63 b 6,07±0,05 a
27 Keterangan : (p<0,05) Huruf yang berbeda pada garis yang sama menunjukkan perbedaan antar perlakuan. Penambahan probiotik pada pakan komersial terhadap udang uji juga memberikan pengaruh yang nyata pada populasi bakteri di saluran pencernaan udang uji (Tabel 3 dan Lampiran 19). Hal ini memacu peningkatan aktivitas enzim endogenous yang diproduksi oleh bakteri dalam saluran pencernaan. Ini dibuktikan dengan populasi bakteri yang lebih tinggi pada saluran pencernaan udang uji pada perlakuan M2, Z3, K9 dan S3 dibandingkan kontrol. Peningkatan populasi bakteri sejalan dengan aktivitas enzim protease, lipase dan amilase pada saluran pencernaan udang vaname. Pembahasan Seleksi probiotik dari saluran pencernaan udang vaname menghasilkan kandidat probiotik yang mampu mensekresikan enzim yaitu enzim protease (K9), enzim lipase (Z3) dan enzim amilase (M2) ataupun ketiga enzim baik protease, lipase dan amilase (S3). Isolat K9 sebagai bakteri proteolitik yaitu bakteri yang mampu mensekresikan enzim protease yang akan merombak protein menjadi asam amino. Isolat Z3 sebagai bakteri lipolitik yaitu bakteri yang mampu mensekresikan enzim lipase yang akan mencerna trigliserida dan menghasilkan asam lemak rantai panjang dan gliserol. Sedangkan isolat M2 sebagai bakteri amilolitik yaitu bakteri yang mampu mensekresikan enzim amilase yang akan mendegradasi pati menjadi maltosa dan glukosa yang kemudian diangkut ke dalam sitoplasma sel dan digunakan sebagai sumber karbon dan energi. Syarat lain suatu bakteri dapat dijadikan kandidat probiotik adalah mampu bertahan pada paparan ph asam dan basa dengan selisih log populasi yang kecil antara ph normal dengan ph asam dan ph normal dengan ph basa. Hal ini sangat penting karena bakteri probiotik harus mampu untuk bertahan pada ph asam lambung dan setelah itu probiotik akan akan berhadapan dengan garam empedu yang ber-ph basa. Bakteri yang mampu bertahan pada ph rendah atau asam dinyatakan bersifat asam atau resisten terhadap asam lambung dan yang berhasil bertahan pada ph basa dinyatakan resisten terhadap garam empedu (Chou & Weimer 1999). Keempat bakteri kandidat probiotik yang terpilih rata-rata
28 memiliki ketahanan terhadap ph asam dan basa dan tetap hidup sampai akhir pengamatan 8 jam. Hal ini diduga karena isolat diseleksi dari saluran pencernaan yang sudah beradaptasi dengan kondisi asam lambung dan garam empedu pada saluran pencernaan. Peran lainnya yang harus dimiliki suatu bakteri untuk dapat dijadikan kandidat bakteri probiotik yaitu mampu menghasilkan senyawa antibakteri yaitu peptida yang disintesis dalam ribosom sehingga menghambat perkembangan bakteri patogen khususnya V.harveyi yang banyak terdapat pada saluran pencernaan udang vaname dan mampu menjaga keseimbangan bakteri dalam saluran pencernaan. Supaya mampu hidup dan berkembang dengan baik pada saluran pencernaan maka kandidat probiotik harus mempunyai kemampuan menempel sehingga mampu mengkolonisasi substrat dengan baik. Apabila tidak mampu mengkolonisasi maka bakteri probiotik akan terlepas oleh konstraksi usus (Havenaar et al. 1992). Kandidat probiotik yang terpilih memiliki jumlah koloni yang relatif tinggi menempel pada substrat. Penambahan probiotik pada pakan komersial terhadap udang uji juga memberikan pengaruh yang nyata pada populasi bakteri di saluran pencernaan udang uji. Ini dibuktikan dengan populasi bakteri yang lebih tinggi pada saluran pencernaan udang uji pada perlakuan M2, Z3, K9 dan S3 dibandingkan kontrol. Hal ini memacu peningkatan aktivitas enzim endogenous yang diproduksi oleh bakteri dalam saluran pencernaan (Ziaei-Nejad et al. 2006). Peningkatan populasi bakteri sejalan dengan aktivitas enzim protease, lipase dan amilase pada saluran pencernaan udang vaname. Dari hasil aktivitas enzim terlihat bahwa enzim protease yang membantu penyederhanaan protein menjadi asam amino memiliki preferensi yang lebih besar digunakan sebagai energi oleh udang dibandingkan dengan enzim lipase atau enzim amilase sehingga mampu meningkatkan pertumbuhan. Penambahan probiotik ke dalam pakan komersial juga memberikan pengaruh yang nyata pada pertumbuhan udang vaname. Perlakuan K9 yaitu
29 udang yang diberikan pakan komersial yang ditambah probiotik penghasil enzim protease menghasilkan pertumbuhan tertinggi dibandingkan perlakuan lainnya dan hal ini didukung dengan retensi protein yang tinggi serta kecernaan protein yang tinggi. Kecernaan yang tinggi menyebabkan protein dan energi nutrien pakan yang dapat diserap udang lebih tinggi sehingga energi akan lebih banyak tersimpan untuk pertumbuhan. Kecernaan pakan meningkat dengan adanya penambahan probiotik dalam pakan dibandingkan dengan pakan tanpa penambahan probiotik. Hal ini sesuai dengan hasil penelitian Handayani et al. (2000) bahwa bakteri pengurai yang ikut termakan akan membantu proses pencernaan dalam saluran pencernaan udang karena bakteri ini mampu memproduksi enzim protease, amilase serta lipase dan meningkatkan keseimbangan bakteri dalam saluran pencernaan. Enzim enzim khusus yang dimiliki oleh bakteri ini sangat membantu dalam pemecahan molekul kompleks menjadi molekul sederhana sehingga akan mempermudah pencernaan lanjutan dan penyerapan oleh saluran pencernaan udang. Pertumbuhan yang baik pada perlakuan K9 juga didukung dengan hasil uji in vitro bahwa isolat K9 paling besar mensekresikan enzim protease dengan diameter hidrolisa mencapai 20 mm, populasi bakteri yang menempel pada saluran pencernaan lebih banyak dibandingkan isolat lainnya dan tahan terhadap kondisi asam dan basa saluran pencernaan. Sehingga isolat K9 berkembang dengan baik pada saluran pencernaan udang dan mampu menyumbangkan enzim protease yang mendukung pertumbuhan udang vaname. Enzim protease yang disebut juga endopeptidase merupakan kelompok enzim yang paling penting pada udang karena peranannya lebih dari 60% pada pencernaan udang (Galgani et al. 1984; Tsai et al. 1986). Udang vaname memiliki preferensi yang lebih tinggi untuk memanfaatkan protein sebagai sumber energi dibandingkan karbohidrat dan lemak. Sebagaimana diketahui bahwa udang vaname membutuhkan protein yang tinggi dibandingkan ikan tawar dan protein berperan sebagai zat pembangun tubuh (Watanabe 1988). Perlakuan K9 memiliki nilai retensi protein yang paling tinggi dengan konversi pakan yang
30 baik yang artinya dengan jumlah konsumsi pakan yang sama (Lampiran 20) udang perlakuan K9 lebih mampu memanfaatkan protein pakan sehingga protein yang keluar dalam bentuk amoniak akan berkurang dan hal ini berdampak baik bagi lingkungan. Selain itu dengan nilai konversi pakan yang jauh lebih rendah dibandingkan kontrol maka hal ini sangat menguntungkan bagi usaha budidaya udang. Dari hasil penelitian ini kelangsungan hidup udang uji memberikan hasil yang tidak berbeda nyata antar perlakuan. Hal ini diakibatkan oleh kuantitas serta kualitas pakan yang diberikan cukup untuk mempertahankan kebutuhan pokok udang serta lingkungan yang terjaga dengan baik selama pemeliharaan.