BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Rancangan Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian eksperimen dengan menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan dua faktor yaitu perlakuan konsentrasi dan perlakuan fraksi dari ekstrak kulit jeruk nipis serta dua ulangan sehingga satuan unit percobaan adalah 24. Kombinasi perlakuan dapat dilihat pada Tabel 3.1 Faktor pertama adalah perlakuan konsentrasi sebagai berikut: P o : Kontrol (diberi chloramphenicol) P 1 : Konsentrasi kulit jeruk nipis 20% P 2 : Konsentrasi kulit jeruk nipis 40% P 3 : Konsentrasi kulit jeruk nipis 60% P 4 : Konsentrasi kulit jeruk nipis 80% P 5 : Konsentrasi kulit jeruk nipis 100% Faktor kedua adalah perlakuan fraksi dari ekstrak kulit jeruk nipis sebagai berikut: E 1 E 2 : Metanol : Etil asetat Tabel 3.1 Kombinasi Perlakuan E P E 1 Metanol E 2 Etil asetat P 0 0% P 0 E 1 P 0 E 2 P 1 20% P 1 E 1 P 1 E 2 P 2 40% P 2 E 1 P 2 E 2 P 3 60% P 3 E 1 P 3 E 2 P 4 80% P 4 E 1 P 4 E 2 P 5 100% P 5 E 1 P 5 E 2 Keterangan: P 0 E 1 : Konsentrasi 0% (diberi chloramphenicol) P 0 E 2 : Konsentrasi 0% (diberi chloramphenicol) P 1 E 1 : Konsentrasi 20%, ekstrak metanol P 1 E 2 : Konsentrasi 20%, fraksi etil ssetat P 2 E 1 : Konsentrasi 40%, ekstrak metanol 20
21 P 2 E 2 : Konsentrasi 40%, fraksi etil asetat P 3 E 1 : Konsentrasi 60%, ekstrak metanol P 3 E 2 : Konsentrasi 60%, fraksi etil asetat P 4 E 1 : Konsentrasi 80%, ekstrak metanol P 4 E 2 : Konsentrasi 80%, fraksi etil asetat P 5 E 1 : Konsentrasi 100%, ekstrak metanol P 5 E 2 : Konsentrasi 100%, fraksi etil asetat Model linear menurut Glover dan Mitchell (2002:233) dari rancangan acak lengkap dengan dua faktor dapat diltulis: Y ijk = µ + α i + β j + (αβ) ij + + Ɛ ijk dimana: i = 1, 2,..... t a (perlakuan) j k Y ijk = 1, 2,..... t b (perlakuan) = 1, 2,..... r (ulangan) = pengamatan pada faktor pertama taraf ke-i, faktor kedua terhadap ke-j, dan ulangan ke-k µ = rataan umum α i β j (αβ) ij Ɛ ijk = pengaruh utama faktor A = pengaruh utama faktor B = pengaruh interaksi antara faktor A dan faktor B = pengaruh acak pada perlakuan 3.2 Alat dan Bahan Alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi tabung reaksi, cawan petri, gelas piala, erlenmeyer, batang pengaduk, botol maserasi, botol konsentrasi, corong
22 kaca, corong buchner, corong pisah, gelas ukur, pipet tetes, vakum, jarum ose, rak tabung reaksi, bunsen, pinset, penjepit tabung reaksi, statif, gunting, neraca analitik, lemari es, incase, autoklaf, oven, kompor listrik, labu takar, pisau, rotary evaporator, mesin penggiling, inkubator, alat tulis, jangka sorong. Bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi chloramphenicol, metanol, etil asetat, etanol, aquadest, alkohol 70%, larutan NaCl 0,85%, kulit jeruk nipis ( C. aurantifolia (Christm.) Swingle), biakan murni E. coli, nutrien agar EMB, nutrien agar MH, Plate Count Agar (PCA), asam asetat glasial, klorofom, amoniak 0,05 M, asam sulfat pekat, asam sulfat 2N, pereaksi Mayer, pereaksi Wagner, pereaksi Dragendroff, HCl pekat, Mg, FeCl 3 1%, kertas cakram, kertas saring, tisu, koran, swab steril, kertas label, aluminium, masker, sarung tangan dan spiritus. 3.3 Prosedur Penelitian 3.3.1 Sterilisasi alat dan bahan Alat dan bahan yang digunakan disterilkan agar terhindar dari kontaminasi mikroorganisme yang tidak diinginkan. Sterilisasi alat menggunakan oven suhu 160 o C dalam waktu 2 jam. Sedangkan sterilisasi bahan menggunakan autoklaf suhu 121 o C pada tekanan uap 15 lbs dapat disterilkan dalam waktu 15 sampai 30 menit (Darmadi, 2008:81). Alat yang disterilkan antara lain: tabung reaksi, cawan petri, gelas piala, erlenmeyer, batang pengaduk, corong pisah, corong kaca, botol konsentrasi, labu
23 takar, pinset, gelas ukur dan pipet tetes. Bahan yang disterilkan antara lain: nutrien agar Eosin Methylene Blue (EMB), Plate Count Agar (PCA), Mueller Hilton Agar (MHA), kertas cakram dan aquadest. 3.3.2 Pembuatan ekstrak kulit jeruk nipis Buah jeruk nipis diperoleh dari Pasar Angso Duo Jambi. Sebanyak 12 kg buah jeruk nipis yang berwarna hijau berdiameter 3,5 cm 5 cm dicuci dengan air bersih dan dipotong menjadi dua bagian, dikupas bagian dalam buah jeruk nipis dan diambil kulitnya serta dikeringkan. Kulit buah jeruk nipis seberat 2 kg dibuat menjadi serbuk simplisia sebanyak 1,1 kg menggunakan mesin penggiling, kemudian dimaserasi dengan metanol selama 3 x 24 jam pada temperatur kamar. Setelah itu didekantasi dengan kertas saring menggunakan corong buchner sehingga diperoleh filtrat (Ledgard, 2006:25). Filtrat yang diperoleh sebanyak 3.540 ml kemudian diuapkan dengan menggunakan rotary evaporator sehingga didapat ekstrak metanol sebanyak 320 ml, dibagi menjadi dua bagian. Bagian pertama sebanyak 160 ml dievaporasi hingga diperoleh ekstrak metanol yang akan diuji. Bagian kedua sebanyak 160 ml dipartisi dengan etil asetat menggunakan corong pisah sehingga diperoleh fraksi etil asetat, kemudian dievaporasi hingga mengental sehingga diperoleh fraksi etil asetat yang akan diuji (Ledgard, 2006:22).
24 3.3.3 Pembuatan media 3.3.3.1 Eosin Methylene Blue Agar (EMBA) Sebanyak 35,96 gram nutrient agar EMBA masing-masing dilarutkan dalam satu liter aquadest dan dipanaskan serta dibiarkan hingga mendidih sampai larut, kemudian dibiarkan dingin. Larutan ini dituang dalam tabung reaksi sebanyak 10 ml. Selanjutnya disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 o C tekanan uap 15 lbs selama 15 menit (Himedia, 2011:1). 3.3.3.2 Plate Count Agar (PCA) Sebanyak 23,5 gram nutrient PCA masing-masing dilarutkan dalam satu liter aquadest dan dipanaskan serta dibiarkan hingga mendidih sampai larut, kemudian dibiarkan dingin dan disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 o C tekanan uap 15 lbs selama 15 menit (Himedia, 2011:1). 3.3.3.3 Mueller Hilton Agar (MHA) MHA berfungsi sebagai media uji untuk pengujian kesensitifitasan antimikroba. Cara pembuatannya: sebanyak 38 gram nutrient MHA masing-masing dilarutkan dalam 1000 ml aquadest dan dipanaskan serta dibiarkan hingga mendidih sampai larut, kemudian dibiarkan dingin dan disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 o C tekanan uap 15 lbs selama 15 menit (Himedia, 2011:2).
25 3.3.4 Pembuatan kurva Escherichia coli diperoleh dari Balai Laboratorium Kesehatan Jambi. Pembuatan kurva pertumbuhan dengan cara inokulasi bakteri E. coli yang berumur 24 jam ke dalam media miring EMBA pada suhu 37 o C. Kemudian biakan bakteri dimasukkan dalam tabung yang telah berisi 9 ml NaCl 0,85% lalu dikocok. Diambil 1 ml dari tabung pertama dan dimasukkan dalam tabung kedua, demikian seterusnya sampai tabung ketujuh pengenceran dihentikan. Suspensi bakteri dari tabung ketujuh diambil 0,1 ml dimasukkan dalam cawan petri dan disebarkan di atas media PCA sampai merata dengan cara distreak. Kemudian ditutup dengan alumunium foil dan diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37 o C selama 24 jam. Kegiatan ini diamati setiap 30 menit sekali. Dihitung koloni yang terbentuk sampai tidak ada lagi penambahan jumlah koloni dan hasil yang diperoleh dibuat kurva pertumbuhan. Pertumbuhan optimal pada bakteri ditentukan oleh kurva pertumbuhan (Capuccino dan Sherman, 2013:144). 3.3.5 Uji ekstrak kulit jeruk nipis terhadap Escherichia coli Pengujian penghambatan pertumbuhan E. coli menggunakan metode Kirby- Bauer, dicelupkan swab steril hingga meresap ke dalam kapas. Kemudian swab steril diangkat dan diperas dengan menekankan pada dinding tabung reaksi bagian dalam sambil diputar-putar. Kemudian diratakan dengan metode streak pada media MHA dibiarkan selama 5 menit (Soemarno, 2013:117). Selanjutnya kertas cakram berdiameter 6 mm dicelupkan pada masing-masing jenis konsentrasi ekstrak kulit
26 jeruk nipis. Kertas cakram yang telah dicelupkan selama satu menit selanjutnya diletakkan dan ditekan secara perlahan di atas permukaan media MHA secara higienis dan diinkubasi di dalam inkubator pada suhu 37 o C selama 24-48 jam (Parija, 2009:71). Pengamatan dengan melihat zona hambat disekeliling kertas cakram dan diukur diameter zona hallow dengan menggunakan jangka sorong (Pelczar, 2009:536). Menurut Morales, dkk (2003:37) besarnya diameter dari aktivitas antibakteri dikelompokkan menjadi empat kategori, yaitu aktivitas lemah (<5 mm), sedang (5-10 mm), kuat (>10-20 mm) dan sangat kuat (>20-30 mm). 3.3.6 Uji fitokimia 3.3.6.1 Uji Tanin Sebanyak 20 mg sampel, ditambah etanol. Kemudian sebanyak 1 ml larutan dipindahkan kedalam tabung reaksi dan ditambahkan 2-3 tetes larutan FeCl 3 1 %. Hasil positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna hitam atau hijau (Sangi, dkk, 2008:49). 3.3.6.2 Uji Saponin Sebanyak 2 g sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambah air suling, didihkan selama 2-3 menit dan didinginkan. Kemudian dikocok kuat-kuat. Hasil positif ditunjukkan dengan terbentuknya buih yang stabil (Sangi, dkk, 2008:49).
27 3.3.6.3 Uji Flavonoid Sebanyak 200 mg sampel dengan 5 ml etanol dipanaskan selama 5 menit di dalam tabung reaksi. Selanjutnya, ditambah beberapa tetes HCl pekat, ditambahkan 0,2 g Mg. Hasil positif ditunjukkan dengan timbulnya warna merah tua dalam waktu 3 menit (Sangi, dkk, 2008:49). 3.3.6.4 Uji Alkaloid Sebanyak 4 g sampel ditambahkan kloroform. Kemudian ditambah 10 ml amoniak dan 10 ml kloroform. Larutan disaring ke dalam tabung reaksi dan fitrat ditambahkan asam sulfat 2N sebanyak 10 tetes. Filtrat dikocok dengan teratur kemudian dibiarkan beberapa lama sampai terbentuk dua lapisan. Lapisan atas dipindahkan ke dalam tabung reaksi masing-masing 2,5 ml. Ketiga larutan ini dianalisis dengan pereaksi Mayer, Dragendroff dan Wagner. Hasil positif di tunjukkan dengan adanya endapan: pereaksi Mayer bewarna putih, Dragendroff berwarna merah jingga dan Wagner berwarna coklat (Sangi, dkk, 2008:48). 3.3.6.5 Uji Triterpenoid dan Steroid Sebanyak 50-100 mg sampel ditempatkan pada tabung reaksi dan ditambahkan asam asetat glasial selam 15 menit, enam tetes larutan dipindahkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 2-3 tetes asam sulfat pekat. Hasil positif ditunjukkan jika triterpenoid bewarna merah jingga atau ungu sedangkan steroid berwarna biru (Sangi, dkk, 2008:48).
28 3.4 Pengamatan Pengamatan dilakukan antara lain: a. Pengamatan didasarkan atas diameter zona hambat yang terbentuk pada 24 jam pertama diukur dengan menggunakan jangka sorong. b. Uji fitokimia berdasarkan atas perubahan warna yang terbentuk. Dimana, keterangannya: - : Tidak terjadi perubahan warna + : Terjadi perubahan warna 3.5 Analisis Data Data statistik yang diperoleh dari pengamatan diameter zona hambat dianalisis secara statistik melalui Analisis of Variable (ANOVA). Apabila hasil ANOVA menyatakan pengaruh, maka dilanjutkan dengan uji Duncan Multiple Range Test (DNMRT) pada taraf kepercayaan 5%. 3.6 Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilakukan di Laboratorium Biologi FKIP Universitas Jambi, Laboratorium Instrumen dan Tugas Akhir FST Universitas Jambi dan Balai Laboratorium Kesehatan Jambi bulan April sampai Juli 2016.