III METODOLOGI PENELITIAN 3.1 BAHAN DAN ALAT Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah buah duwet yang diperoleh dari Jember Jawa Timur. Bahan-bahan lain yang digunakan adalah etanol, aquadest, buffer potasium klorida, buffer sodium asetat, H 2 O 2, HCl 37%, NaOH, DMSO, natrium benzoat, asam ferulik dan asam galat. Alat yang digunakan adalah alat-alat gelas, neraca, hand blender, hidrolic press, stirer, sentrifus, penyaring vakum, rotary vakum evaporator, freeze drying, vortek, water bath, ph meter, lampu UV, termometer, mikropipet, spektrofotometer dan khromameter. 3.2 Tempat dan Waktu Penelitian berlangsung dari bulan Maret 2007 sampai Juni 2008. Penelitian dilakukan di laboratorium Kimia Pangan, Biokimia, laboratorium Teknologi Pengolahan Departemen ITP-IPB dan laboratorium Kimia Fakultas MIPA-IPB. 3.3 Metode Penelitian Penelitian ini dilakukan dalam dua tahapan, yaitu mencari metode ekstraksi dan bagian buah yang mengandung konsentrasi antosianin tertinggi dan pengujian stabilitas antosianin terpilih. Pada tahap pertama dilakukan pengukuran total rendemen ekstrak, konsentrasi antosianin dan rendemen antosianin pada dua bagian buah duwet yaitu kulit buah duwet dan buah duwet utuh tanpa biji. Penelitian dilanjutkan ke tahap kedua yang mengukur stabilitas ekstrak antosianin buah duwet terhadap berbagai faktor yaitu: tingkatan ph, oksidator, cahaya, suhu pemanasan, dan penyimpanan, selain itu pada tahap ini juga dilakukan upaya penstabilan pigmen antosianin dengan proses kopigmentasi dengan asam galat dan asam ferulik.
3.3.1 Persiapan Buah Duwet Buah duwet yang digunakan adalah buah duwet yang berwarna ungu (sangat matang). Buah duwet dipisahkan dari bijinya sehingga diperoleh kulitdaging buah (buah duwet utuh tanpa biji), sedangkan sebagian buah duwet diambil kulitnya saja dengan menggunakan pisau stainless steel sehingga diperoleh kulit buahnya saja. Kulit buah dan buah duwet utuh tanpa biji secara terpisah diblansir selama 2 menit dengan menggunakan uap panas 80 o C untuk mengaktifkan enzim polifenol oksidase. Sampel yang diperoleh dimasukkan ke dalam kantong plastik dan disimpan dalam lemari pembeku untuk tahapan selanjutnya. 3.3.2 Optimasi Ekstraksi Antosianin. Buah duwet diekstraksi dengan menggunakan 2 perlakuan, yaitu: Bagian Buah duwet yang diekstraksi (A) A1 = kulit buah duwet A2 = kulit dan daging buah duwet (buah duwet utuh tanpa biji) Metode ekstraksi (B) B1 = Pengepresan B2 = Maserasi dengan pelarut etanol B3 = Kombinasi pengepresan dan maserasi dengan pelarut etanol Dengan kombinasi: A1B1 A1B2 A1B3 A2B1 A2B2 A2B3 Ekstraksi dilakukan pada suhu ruang. Masing-masing sebanyak 50 gram kulit dan daging buah duwet diblender secara terpisah sebelum diekstraksi dengan tujuan mengecilkan ukuran sehingga dihasilkan sampel dalam bentuk bubur. Metode ektraksi dengan cara pengepresan dilakukan dengan cara mengepres bubur buah sehingga dihasilkan filtrat. Sedangkan, untuk ekstraksi menggunakan metode maserasi menggunakan metode yang pernah dilakukan oleh Sari et al. (2005) dengan menggunakan pelarut etanol, bubur buah di ekstraksi dengan pelarut etanol (100ml) selama 60 menit. Larutan disentrifus selama 15 menit
dengan kecepatan 4000 rpm untuk memisahkan filtrat dan residu. Filtrat yang diperoleh ditampung dalam erlenmeyer, dan residu diekstrak kembali dengan cara yang sama. Filtrat dari hasil maserasi dengan pelarut etanol yang diperoleh digabung, kemudian difiltrasi dengan vakum filter, dan dievaporasi dengan rotary vacumm evaporator pada suhu 36 o C, sehingga menghasilkan ekstrak pekat dan di keringkan dengan freeze drying. Untuk ekstraksi dengan menggunakan metode kombinasi pengepresan dan maserasi, sampel berupa bubur buah dipres sehingga menghasilkan filtrat dan residu, kemudian residu diekstraksi kembali dengan metode maserasi dengan menggunakan pelarut etanol sesuai dengan metode sebelumnya, filtrat yang diperoleh dari hasil pengepresan dan ekstraksi dengan pelarut etanol digabungkan dalam erlenmeyer, dievaporasi dan kemudian dikeringkan dengan freeze drying. Setelah dikeringkan, ekstrak yang diperoleh diukur total rendemen ekstrak, konsentrasi antosianin menggunakan metoda phdifferential (Prior et al., 1998) dan rendemen pigmen antosianin. 3.3.3 Karakterisasi Pigmen Antosianin Kulit Buah Duwet pada Beberapa Variasi ph Ekstrak kulit buah duwet dianggap sebagai antosianin Petunidin-3- rhamnosa (BM = 463), yang didasarkan dari penelitian sebelumnya oleh Leimena (2008). Karakteristik antosianin ekstrak buah duwet dalam beberapa variasi ph dilakukan dengan cara melarutkan ekstrak (dianggap sebagai petunidin-3- rhamnosa) dalam buffer potasium klorida (0.06 M) untuk ph 1 sampai 4 dan buffer sodium asetat (0.06 M) untuk ph 5 sampai 8 dengan konsentrasi 0.6mM. Larutan antosianin dicampur dengan perbandingan 1:1 dengan buffer ph masingmasing, sehingga konsentrasi akhir larutan antosianin adalah 0.3mM. Kemudian larutan yang telah dicampur diatur phnya menjadi ph 1 sampai 8 dengan 10M HCl atau 25% NaOH dan didiamkan selama 30 menit. Pengujian karakteristik antosianin dengan penambahan asam ferulik dan asam galat sebagai kopigmen dilakukan dengan melarutkan antosianin dalam potasium klorida (0.06 M) untuk ph 1 sampai 4 dan buffer sodium asetat (0.06 M) untuk ph 5 sampai 8 dengan konsentrasi 0.6mM. Kopigmen asam ferulik dilarutkan dalam 30% DMSO dalam masing-masing buffer dengan konsentrasi
0.06M (Lampiran 1), sedangkan asam galat dilarutkan dalam 10% DMSO dalam masing-masing buffer dengan konsentrasi 0.06M. Larutan antosianin dan kopigmen dicampur dengan perbandingan 1:1, sehingga konsentrasi akhir larutan campuran adalah 0.3mM antosianin dan 0.03M kopigmen, sehingga perbandingan molar kedua larutan 1:100. Kemudian larutan yang telah dicampur diatur phnya menjadi ph 1 sampai 8 dengan 10 M HCl atau 25% NaOH dan didiamkan selama 30 menit. Metode kopigmentasi ini didasarkan pada metode yang digunakan oleh Maarit et al. (2002) yang dimodifikasi. Spektra UV-visibel larutan antosianin pada setiap nilai ph diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 400 sampai 650 nm untuk melihat pergeseran panjang gelombang maksimum. Perubahan nilai absorbansi akibat perlakuan ph juga diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 520 nm yang merupakan panjang gelombang maksimum (λ max ) pigmen antosianin buah duwet (Sari et al. 2005). 3.3.4 Uji Stabilitas dan Kopigmentasi Pigmen Antosianin Buah Duwet Terpilih Pengujian stabilitas terhadap oksidator, cahaya, suhu pemanasan dan penyimpanan dilakukan pada buffer ph 3 untuk antosianin dari ekstrak buah duwet tanpa dan dengan penambahan asam ferulik dan asam galat sebagai kopigmen untuk mempertahankan kestabilan warna antosianin. Ekstrak kulit buah duwet dianggap sebagai antosianin Petunidin-3- rhamnosa (BM = 463), yang didasarkan dari penelitian sebelumnya oleh Leimena (2008). Pengujian stabilitas antosianin ekstrak buah duwet dilakukan dengan cara melarutkan ekstrak (dianggap sebagai petunidin-3-rhamnosa) dalam buffer KCl 0.06M dengan konsentrasi 0.6mM. Larutan antosianin dicampur dengan perbandingan 1:1 dengan buffer KCl 0.06M, sehingga konsentrasi akhir larutan antosianin adalah 0.3mM. Kemudian larutan yang telah dicampur diatur phnya menjadi ph 3 dengan 10M HCl atau 25% NaOH. Pengujian antosianin dengan penambahan asam ferulik dan asam galat sebagai kopigmen dilakukan dengan melarutkan antosianin dalam buffer KCl 0.06M dengan konsentrasi 0.6mM. Kopigmen asam ferulik dilarutkan dalam 30%
DMSO dalam buffer KCl 0.06M dengan konsentrasi 0.06M (Lampiran 1), sedangkan asam galat dilarutkan dalam 10% DMSO dalam buffer KCl 0.06M dengan konsentrasi 0.06M. Larutan antosianin dan kopigmen dicampur dengan perbandingan 1:1, sehingga konsentrasi akhir larutan campuran adalah 0.3mM antosianin dan 0.03M kopigmen, sehingga perbandingan molar kedua larutan 1:100. Kemudian larutan yang telah dicampur diatur phnya menjadi ph 3 dengan 10M HCl atau 25% NaOH. Metode kopigmentasi ini didasarkan pada metode yang digunakan oleh Maarit et al. (2002) yang dimodifikasi. ph 3 dipilih untuk analisis karena antosianin lebih stabil pada ph 3 dibanding dengan ph asam lainnya (ph 1, 2, 4 dan 5), dan ph 3 umumnya merupakan ph untuk produk pangan asam seperti juice dan minuman berkarbonasi, sehingga dapat menggambarkan penerapannya dalam produk pangan. Pengujian stabilitas antosianin buah duwet dilakukan dengan melihat karakteristik terhadap beberapa variasi ph, serta mengukur kestabilannya terhadap oksidator, cahaya, suhu pemanasan, dan kondisi penyimpanan (suhu dingin dan suhu ruang),. Stabilitas digambarkan dalam retensi warna atau pigmen (%) yang dihitung dengan menggunakan persamaan: B/A 100%, dimana A adalah nilai absorbansi antosianin sebelum diberi perlakuan dan B adalah nilai absorbansi antosianin setelah diberi perlakuan. 3.3.4.1 Stabilitas terhadap Oksidator Larutan antosianin ekstrak dan larutan antosianin ekstrak yang telah ditambah kopigmen ditambah 0.25 ml H 2 O 2 (1%) (volume akhir larutan dijaga tetap 10ml) dimasukkan ke dalam botol gelap dan diukur absorbansinya dengan spektrofotometer (λ = 520 nm) serta dilakukan juga pengukuran dengan khromameter pada setiap waktu kontak 0, 3, 6, 9, 12 dan 15 jam. 3.3.4.2 Stabilitas terhadap Sinar Larutan antosianin ekstrak dan larutan antosianin ekstrak yang telah ditambah kopigmen dimasukkan ke dalam botol gelap dan botol bening kemudian disinari dengan 2 lampu UV 40 watt (intensitas sinar 2500 lux) dalam wadah
kotak selama 7 hari. Pengukuran absorbansi dilakukan setiap hari dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 520 nm dan dengan khromameter. 3.3.4.3 Stabilitas terhadap Suhu Pemanasan Larutan antosianin tanpa kopigmen dan larutan antosianin ekstrak yang telah ditambah kopigmen dimasukkan ke dalam botol gelap dan diinkubasi pada suhu 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, dan 100 o C, selama 2 jam kemudian diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 520 nm yang merupakan panjang gelombang maksimum antosianin kulit buah duwet pada ph 3 dan juga dengan khromameter setiap interval waktu 30 menit. 3.3.4.4 Pengaruh Suhu Selama Penyimpanan Larutan antosianin ekstrak dan larutan antosianin ekstrak yang telah ditambah kopigmen dimasukkan ke dalam botol gelap dan disimpan pada suhu kamar (30 o C) dan suhu dingin (10 C), selama 1 bulan. Kemudian dilakukan pengukuran absorbansi dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 520 nm dan dengan khromameter dengan interval waktu pengamatan 0, 5, 10, 15, 20, 25 dan 30 hari. 3.3.5 Metode Analisis Pengamatan meliputi analisis total rendemen, konsentrasi antosianin, rendemen antosianin, dan analisis warna dengan khromameter.3.3.5.1 Total Rendemen Ekstrak (Sari et al. 2005) Total rendemen dihitung dalam persen sebagai berat ekstrak yang telah dikeringkan dengan frezee dryer dibagi berat buah duwet basah. Berat ekstrak ker ing ( g) Total Rendemen (%) = 100% Berat buah duwet ( g) 3.3.5.2 Konsentrasi Antosianin dengan Metoda ph-differential (Prior et al. 1998). Konsentrasi antosianin diukur dengan melarutkan ekstrak kering dalam pelarut yang digunakan untuk ekstraksi dan ditera sampai volume 25 ml.
Sebanyak masing-masing 0.05 ml sampel dimasukkan ke dalam 2 buah tabung reaksi. Tabung reaksi pertama ditambah larutan buffer potasium klorida (0.025 M) ph 1 sebanyak 4.95 ml dan tabung reaksi kedua ditambahkan larutan buffer sodium asetat (0.4 M) ph 4.5 sebanyak 4.95 ml. Pengaturan ph dalam pembuatan buffer potasium klorida dan sodium asetat menggunakan HCl pekat. Absorbansi dari kedua perlakuan ph diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 515 nm dan 700 nm setelah didiamkan selama 15 menit. Nilai absorbansi dihitung dengan rumus : A = [(A 515 A 700 ) ph 1 (A 515 A 700 ) ph 4.5 ]. Konsentrasi antosianin dihitung sebagai sianidin-3-glikosida menggunakan koefisien ekstingsi molar sebesar 29 600 L cm -1 dan berat molekul sebesar 448.8. Konsentrasi antosianin (mg/l) = (A x BM x FP x 1000) / (ε x 1), dimana A adalah absorbansi, BM adalah berat molekul (448.8), FP adalah faktor pengenceran (5 ml / 0.05 ml), dan ε adalah koefisien ekstingsi molar (29 600 L cm -1 ). 3.3.5.3 Rendemen Pigmen Antosianin (Sari et al. 2005) Rendeman antosianin dihitung dalam persen yang menyatakan banyaknya antosianin yang terdapat dalam sampel berdasarkan berat basah. Konsentrasi antosianin ( g) Rendemen antosianin (%) = 100% berat sampel ( g) 3.3.5.4 Pengukuran Warna dengan Spektofotometer Pengukuran absorbansi dilakukan untuk ekstrak antosianin duwet dengan penambahan buffer dan ekstrak antosianin buah duwet. Absorbansi sampel diukur dengan spektofotometer pada panjang gelombang maksimum antosianin. Panjang gelombang maksimum yang digunakan adalah 520 nm. 3.3.5.5 Analisis Warna dengan Kromameter (Francis, 1998) Pengukuran warna pada ekstrak tanpa dan dengan kopigmen yang dilarutkan pada buffer ph 3 dilakukan dengan alat Minolta Chroma Meters CR- 310. Prinsip dari Minolta Chroma Meters adalah pengukuran perbedaan warna melalui pantulan cahaya oleh permukaan sampel. Pengukuran dilakukan dengan meletakkan sampel di dalam wadah sampel barukuran seragam dan selanjutnya dilakukan pengukuran pada skala nilai L, a, b, dan o h. Nilai L menyatakan
parameter kecerahan (lightness) yang mempunyai nilai dari 0 (hitam) sampai 100 (putih). Nilai a menyatakan cahaya pantul yang menghasilkan warna kromatik campuran merah-hijau dengan nilai +a (positif) dari 0 100 untuk warna merah dan nilai a (negatif) dari 0- (-80) untuk warna hijau. Notasi b menyatakan warna kromatik campuran biru-kuning dengan nilai +b (positif) dari 0 70 untuk kuning dan nilai b (negatif) dari 0-(-70) untuk warna biru. Hue diperoleh dari tan -1 a/b, nilai hue ini berkisar antara 0 360 o. Nilai ΔE merupakan parameter terjadinya perubahan warna antosianin secara keseluruhan. Nilai ΔE dihitung dengan persamaan: ΔE = [(ΔL*) 2 + (Δa*) 2 + (Δb*) 2 ] 1/2 Gambar 5. Pola kromasitas warna (Anonim, 2005) 3.3.5.6 Kinetika Degradasi Antosianin terhadap Suhu Pemanasan Kinetika degradasi antosianin pada ekstrak dilakukan dengan uji estimasi kurva regresi antara hubungan retensi warna dengan lama pemanasan. Kinetika degradasi antosianin secara umum berlangsung pada ordo ke-1 (Calvi dan Francis, 1978; Ahmed et al. 2000; Cho et.al., 2001; Ozkan et al., 2002; Maarit, 2005). Persamaan reaksi pada ordo ke-1 dapat dilihat pada persamaan sebagai berikut:
da = ka dt Penentuan variabel kuantitatif degradasi antosianin dilakukan melalui integrasi terhadap persamaan tersebut hingga diperoleh persamaan matematis. Melalui persamaan matematis tersebut dapat diinterpretasikan nilai konstanta degradasi antosianin (Singh, 1994). Persamaan matematis tersebut adalah: At A0 da/ A = t 0 k dt Ln At - ln Ao = -kt Ln At/A 0 = -kt + C Ln (Retensi Warna) = -kt + C Keterangan: At = konsentrasi antosianin setelah pemanasan A 0 = konsentrasi antosianin sebelum pemanasan k = konstanta degradasi antosianin t = waktu pemanasan Parameter besarnya ketergantungan laju reaksi terhadap suhu dapat dilihat dalam nilai energi aktivasinya (Lund, 1977). Hal ini dapat dinyatakan dalam persamaan Arrhenius berikut: k = ko.e -Ea/RT ln k = ln ko Ea R 1 T Dimana: k = konstanta laju reaksi ko = faktor frekuensi Ea = energi aktivasi R = tetapan gas (1,987 kal/mol.k atau 8,3145 J/mol.K) T = suhu mutlak ( o C + 273) o K
3.4 Rancangan Percobaan Rancangan percobaan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) secara faktorial terdiri dari dua faktor dengan tiga kali ulangan. Adanya perbedaan yang diperoleh akan diuji lanjut dengan uji BNT pada taraf uji 5%. Y ijk = μ + α i + β j + αβ ij + ε ijk Dimana: Yijk = nilai pengamatan akibat faktor A taraf ke i faktor B taraf ke j dan ulangan ke k μ = rata-rata α i β j = pengaruh utama faktor A = pengaruh utama faktor B αβ ij = pengaruh interaksi faktor A dan faktor B ε ijk = pengaruh acak yang menyebar normal (0, σ 2 )