II. BAHAN DAN METODE 2.1 Rancangan Perlakuan Penelitian ini terdiri dari enam perlakuan yang masing-masing diberi 3 kali ulangan. Perlakuan yang diberikan berupa perendaman dengan dosis relhp berbeda yaitu 0, 3, 6, 9, dan 12 mg/l dalam larutan NaCl 0,6% yang ditambah serum albumin sapi (BSA) 0,01%, dan kontrol yang direndam dalam larutan NaCl 0,6% tanpa BSA dan relhp. Penelitian menggunakan rancangan acak lengkap (Tabel 1). Benih ikan sidat yang digunakan yaitu stadia glass eel yang diperoleh dari pengumpul di Pelabuhan Ratu, Jawa Barat. Tabel 1. Rancangan perlakuan Perlakuan Notasi Perendaman 1 0 NaCl 0,6%, BSA 0,01%, dan relhp 0 mg/l 2 3 NaCl 0,6%, BSA 0,01%, dan relhp 3 mg/l 3 6 NaCl 0,6%, BSA 0,01%, dan relhp 6 mg/l 4 9 NaCl 0,6%, BSA 0,01%, dan relhp 9 mg/l 5 12 NaCl 0,6%, BSA 0,01%, dan relhp 12 mg/l 6 K NaCl 0,6% 2.2 Produksi Hormon Pertumbuhan Rekombinan (rhp) Penelitian ini dimulai dari produksi protein rhp dengan menggunakan bakteri Escherichia coli BL21 (DE3) yang mengandung konstruksi pcold-i/elhp (Alimuddin et al., 2010). Protein rekombinan yang dihasilkan adalah rhp ikan kerapu kertang (ElHP). Bakteri E. coli yang mengandung konstruksi pcold- I/ElHP dikultur dalam 3 ml media LB cair yang mengandung ampisilin dan NaOH 5M, dan diinkubasi pada suhu 37 0 C selama 18 jam menggunakan shaker 200 rpm. Setelah itu dilakukan subkultur dengan mengambil 1% dari kultur sebelumnya dan dimasukkan ke dalam media LB cair mengandung ampisilin dan NaOH 5M yang baru, diinkubasi lagi menggunakan shaker 200 rpm pada suhu 37 o C selama 3 jam. Induksi produksi rhp dilakukan dengan memberikan kejutan suhu 15 o C selama 30 menit, ditambahkan IPTG (100 mm) sebanyak 750 µl dan diinkubasi menggunakan shaker pada suhu 15 o C selama 24 jam. Hasil kultur kemudian disentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm selama 1 menit untuk mengendapkan sel bakteri. Setelah itu pelet bakteri dicuci menggunakan buffer 4
phosphate saline (BFS) sebanyak 1 kali, kemudian disimpan di deep-freezer (- 80 o C) hingga akan digunakan. Pelet bakteri hasil sentrifugasi dicuci menggunakan bufer tris-edta (TE) sebanyak 1 ml per 200 mg bakteri, diinkubasi pada suhu 37 o C selama 20 menit dan kemudian disentrifugasi pada suhu 4 o C dengan kecepatan 12.000 rpm selama 2 menit. Supernatan dibuang, dan ke dalam tabung berisi pelet bakteri dimasukkan 500 µl larutan lisozim (10 mg dalam 1 ml bufer TE) untuk melisis dinding bakteri. Proses dilakukan selama 20 menit pada 37 o C, lalu disentrifugasi pada 12.000 rpm selama 15 menit. Supernatan dibuang, dan endapan yang terbentuk merupakan pelet protein rhp dalam bentuk badan inklusi (inclusion body). Pelet protein rhp dicuci dengan BFS sebanyak 1 ml, pencucian dilakukan sebanyak 2 kali. Setelah selesai, protein di simpan dalam deep-freezer hingga akan digunakan. 2.3 Perendaman Ikan dalam Larutan rhp Bobot dan panjang total glass eel ikan sidat sebanyak 50 ekor diukur untuk masing-masing ulangan perlakuan sebagai data awal. Benih ikan direndam dalam media larutan NaCl 3% selama 2 menit (shock salinitas), setelah itu dipindahkan ke larutan NaCl 0,6% yang telah diberi campuran rhp dan BSA sesuai dosis perlakuan (Tabel 1). Ikan direndam dalam larutan rhp volume 200 ml selama 2 jam (Handoyo, 2012). Ikan yang sudah selesai direndam kemudian dipindahkan ke akuarium yang berukuran 20 x 30 x 20 cm 3 dengan volume air sebanyak 7 liter. Pemeliharaan dilakukan selama 8 minggu. Pengukuran biomassa ikan tiap perlakuan dilakukan setiap 2 minggu sekali. Selama pemeliharaan, ikan diberi cacing sutera secara ad libitum. Pengecekan pakan dilakukan setiap pagi dan sore hari. Kualitas air dijaga dengan melakukan pergantian air sebanyak 80% setiap dua hari sekali. Pada akhir pengamatan, dilakukan pengukuran panjang total 10 ekor ikan dari total ikan yang hidup pada masing-masing ulangan perlakuan, penimbangan bobot total atau biomassa dan perhitungan jumlah ikan yang hidup untuk masing-masing ulangan perlakuan. 5
2.4 Analisis Proksimat Analisis proksimat dilakukan di Laboratorium Nutrisi, Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor. Analisis proksimat (kadar protein, kadar lemak, kadar abu, kadar air, serat kasar, dan BETN) dilakukan pada kontrol dan perlakuan terbaik. Pengujian parameter ini ditujukan untuk menguji pengaruh penggunaan rhp terhadap kandungan gizi (kadar protein, kadar lemak, kadar air, kadar abu, serat kasar, dan BETN) pada ikan sidat. Rumus perhitungan kandungan proksimat daging dilampirkan pada Lampiran 1. 2.4.1 Kadar Air Prinsip kerja analisis kadar air adalah menguapkan air yang terdapat dalam bahan menggunakan oven 100 o -105 o C dalam jangka waktu tertentu hingga penyusutan berat badan tidak berubah lagi. Pertama, botol dikeringkan dalam oven selama 1 jam pada suhu 105 o C. Lalu didinginkan dalam eksikator dan ditimbang bobotnya (x). Sampel sebanyak 5 g (y) dimasukkan ke dalam oven 105 0 C selama 4-6 jam, lalu didinginkan lagi dalam eksikator dan ditimbang. Langkah ini dilakukan 3 kali hingga berat kering bahan konstan (z). 2.4.2 Kadar Abu Prinsip kerja analisis kadar abu adalah membakar bahan dalam tanur (Furnace) pada suhu 600 o C selama 3-8 jam sehingga hanya tersisa abu yang merupakan kumpulan mineral-mineral dalam bahan. Pertama, cawan dikeringkan dalam oven selama 1 jam pada suhu 105 o C lalu didinginkan dalam eksikator dan ditimbang (x). Sampel bahan 5 g (y) dimasukkan ke dalam cawan porselen dan dipijarkan diatas api pembakar bunsen sampai tidak berasap lagi, kemudian dimasukkan dalam tanur listrik pada suhu 400 o -600 o C. Setelah sampel abu berwarna putih, sampel dipindahkan ke dalam eksikator dan biarkan selama 1 jam lalu ditimbang kembali (z). 6
2.4.3 Kadar Protein Prinsip pengukuran kadar protein adalah pengukuran kadar nitrogen bahan dengan metode Kjeldahl melalui 3 tahap yaitu destruksi, destilasi, dan titrasi. Pada tahap destruksi, 0,3 g bahan dimasukkan ke dalam labu destruksi dan ditambahkan sekitar 3 sendok katalis campuran dan 20 ml H 2 SO 4 pekat teknis secara homogen. Kemudian campuran tersebut dipanaskan pada alat destruksi dengan posisi low selama 10 menit, medium 5 menit dan high sampai larutan menjadi jernih dan berwarna kehijauan. Tahap kedua yaitu destilasi, labu destruksi didinginkan dan dimasukkan ke dalam labu penyuling dan diencerkan dengan 300 ml akuades. Ke dalam larutan ditambahkan batu didih dan larutan NaOH 22% 100 ml, kemudian labu penyuling dipasang dengan cepat di atas alat penyuling. Proses penyulingan berlangsung sampai 2/3 cairan dalam labu penyuling telah menguap. Tahap ke tiga yaitu titrasi, hasil penyulingan dalam labu erlemeyer dititrasi dengan larutan NaOH 1,3 N sampai larutan tersebut berwarna biru kehijauan. Volume NaOH dicatat (z ml) dan dibandingkan dengan blanko (y ml). 2.4.4 Kadar Lemak Pengukuran kadar lemak dilakukan dengan metode sochlet. Labu lemak dengan beberapa butir batu didih dikeringkan di dalam oven dengan suhu 105-110 C selama 1 jam dan kemudian didinginkan dalam eksikator selama 1 jam dan ditimbang (a). Sampel yang sudah ditimbang (x) dimasukkan ke dalam selongsong yang terbuat dari kertas saring dan ditutup dengan kapas yang bebas lemak. Setelah itu selongsong dimasukkan kea lat FATEX-S (suhu 60 o C dalam waktu 25 menit) dan ditambahkan larutan petroleum ether sebagai larutan pengekstrak. Kemudian dilakukan proses evaporasi dengan mengubah suhu menjadi 105 o C, ditunggu hingga alat berbunyi. Proses dilakukan sebanyak 2 kali. Kemudian labu dikeringkan dalam oven dengan suhu 105 o C selama 1 jam. Setelah itu didinginkan dalam eksikator selama 1 jam dan ditimbang (b). 7
2.4.5 Serat Kasar Sampel bahan sebanyak 1 gram (x) dimasukkan ke dalam gelas piala 500 ml dan ditambahkan 50 ml H 2 SO 4 0,3 N, lalu dipanaskan selama 30 menit hingga mendidih. Setelah itu, ditambahkan 25 ml NaOH 1,5 N, dan terus dididihkan kembali selama 30 menit kedua. Kemudian cairan tersebut disaring dengan kertas saring yang sudah ditimbang (a) menggunakan corong Bucher. Proses penyaringan berturut-turut dilakukan dengan menggunakan 50 ml air panas, 50 ml H 2 SO 4 0,3 N, 50 ml air panas, 25 ml Aceton. Kertas saring dan isinya dipindahkan ke cawan porselen dan dikeringkan dalam oven pada suhu 105 o C kemudian didinginkan dalam eksikator selama 1 jam dan ditimbang (y). Setelah itu kertas saring dan isinya dipijarkan dalam tanur sampai putih dan ditimbang (z). 2.5 Analisis Statistik Parameter yang diamati pada penelitian ini meliputi laju pertumbuhan spesifik, pertumbuhan panjang, tingkat kelangsungan hidup, biomassa, dan kandungan proksimat daging. Rumus yang digunakan untuk menghitung parameter pertumbuhan, biomassa, dan kelangsungan hidup adalah seperti dalam Lampiran 2. Parameter pertumbuhan dan kandungan proksimat daging dianalisis secara deskriptif, dan diolah dengan menggunakan perangkat lunak Microsoft Excel 2007. 8