Identifikasi Mutasi Gen rpob Isolat MDR Mycobacterium tuberculosis di Bali dengan Metode Nested PCR *) Identification Of rpob Gene Mutation of MDR Mycobacterium tuberculosis Isolate in Bali Using Nested PCR Sagung Chandra Yowani 1,3), I Nengah Wirajana 2,3) 1) Jurusan Farmasi FMIPA Universitas Udayana; 2) Jurusan Kimia FMIPA Universitas Udayana; 3) Kelompok Studi MDR & XDR Tuberculosis FMIPA Universitas Udayana *Correspondence Author: cyowani@yahoo.com *) Telah dipresentasikan pada Kongres Ilmiah IAI XX, di Jakarta, 21-23 Februari 2014 ABSTRAK Tuberkulosis merupakan salah satu penyakit infeksi yang menjadi perhatian untuk ditangani pada program Millenium Development Goals (MDGs), terutama oleh meningkatnya kejadian Multi Drug Resistance (MDR_TB). Menurut WHO, resistensi terhadap rifampisin dan isoniazid telah dikategorikan sebagai MDR-TB. Dari beberapa penelitian, ditemukan bahwa hampir 90 % isolat yang resisten rifampisin, juga resisten terhadap isoniazid. Oleh karena itu,resistensi terhadap rifampisin dianggap sebagai marka penentu (surrogate marker) kejadian MDR-TB. Resistensi terhadap rifampisin dimediasi oleh adanya mutasi pada suatu region 81 bp (RRDR : Rifampicin Resistance Determinant Region) dari gen rpob. Penelitian ini bertujuan utamanya untuk mengeksplorasi mutasi pada gen rpob dari MDR- TB yang terjadi pada penderita Tuberkulosis di Bali. Isolat MDR-TB yang digunakan pada penelitian ini merupakanj koleksi Laboratorium Mikrobiologi RS Sanglah, Denpasar. Amplifikasi dilakukan dengan metode Nested Polymerase Chain Reaction menggunakan sepasang outer primer dan sepasang inner primer Hasil penelitian menunjukkan selain mutasi pada daerah RRDR, 5 dari 6 isolat yang dikerjakan memiliki titik mutasi yang sama yaitu pada kodon 418, dengan perubahan asam amino dari asam glutamat menjadi asam aspartat.oleh karenanya, dapat disimpulkan bahwa terdapat missense mutation Kata Kunci : Nested PCR, MDR-TB, Mutasi gen rpob ABSTRACT Tuberculosis is one of the infectious diseases that is important to be treated in Millenium Development Goals (MDGs) programme, mainly due to the increasing of Multidrug resistant tuberculosis (MDR-TB) cases. According to WHO, MDR-TB was defined as tuberculosis caused by strains of Mycobacterium tuberculosis that are resistant to at least isoniazid and rifampicin. Several studies found that nearly 90% of rifampin-resistant isolates, were also resistant to isoniazid. Therefore, resistance to rifampicin is a surrogate marker of MDR. Resistance to rifampicin is mediated by
mutation in a region of 81 bp (RRDR: Rifampicin Resistance Determinant Region) of the rpob gene. The aim of this research mainly was to explore mutation of MDR-TB rpob gene of tuberculosis patient in Bali. All MDR-TB isolates used for this research were the collection of Clinical Microbiology Laboratory Of Sanglah Hospital, Denpasar. Amplification were conducted by Nested Polymerase Chain Reaction methods using two pair of inner and outer primers. The result of this study showed that except at RRDR, five of six isolates had one similar mutation at codon 418 from glutamic acid to aspartic acid. Therefore, it could be concluded that there has been a missense mutation in all isolates. Key words: Nested PCR, MDR-TB, rpob gene mutation PENDAHULUAN Mycobacterium tuberculosis merupakan bakteri penyebab tuberkulosis, suatu penyakit infeksi menular yang biasanya menyerang paru (pulmonary TB), tetapi dapat juga menyerang bagian tubuh lain (nonpulmonary TB). Penyakit ini menyebar melalui udara dalam bentuk percikan dahak (droplet nuclei) dari orang yang terinfeksi (1,2). Pada tahun 2010, diperkirakan telah terjadi 8,5-9,2 juta kasus tuberkulosis. Sebanyak 1,2-1,5 juta orang dicatat meninggal karena tuberkulosis (termasuk penderita TB dengan HIV positif) (2). Indonesia merupakan negara dengan penderita TB terbanyak ke-5 di dunia, dan masuk dalam daftar 22 negara dengan masalah TB yang serius (high burden countries) (2,3). Pada tahun 2010, di Indonesia diperkirakan terjadi 690.000 kasus TB baru dengan angka kematian mencapai 64.000 jiwa (4). Prevalensi TB yang tinggi diperparah dengan terjadinya kekebalan ganda (multidrug resistance, MDR) bakteri M.tuberculosis terhadap obat antituberkulosis (OAT) (1). MDR-TB didefinisikan sebagai penyakit tuberkulosis yang disebabkan oleh strain M.tuberculosis yang resisten sekurang-kurangnya terhadap rifampisin dan isoniazid, obat-obat antituberkulosis lini pertama yang paling efektif (5). Pada tahun 2010 diperkirakan terdapat 650.000 kasus MDR-TB dari 12 juta kasus TB di dunia (3,5). Di Indonesia sendiri diperkirakan telah terjadi sekitar 5100 kasus MDR-TB dari kasus TB baru yang tercatat pada tahun 2010. Hal ini membuat Indonesia masuk dalam daftar negara dengan masalah MDR-TB yang serius (high burden MDR-TB country) (4). Rifampisin (RIF) merupakan salah satu OAT lini pertama untuk TB dan termasuk dalam regimen pengobatan standar TB (6). Lebih dari 96% resistensi terhadap RIF terjadi akibat mutasi yang terjadi pada segmen 81- bp(rrdr) gen rpob, suatu gen yang menyandi perubahan asam amino pada subunit-β dari RNA polimerase. Dari penelitian yang telah dilakukan, ditemukan bahwa 90% isolat resisten RIF juga resisten terhadap isoniazid (INH), sehingga resistensi terhadap RIF merupakan surrogate marker atau pertanda yang mewakili terjadinya MDR (7,8)
Uji sensitivitas obat (Drug Susceptibility Testing, DST) konvensional sangat sensitif dan spesifik dalam mendiagnosis MDR-TB. Namun, DST konvensional membutuhkan waktu yang lama (+ 6-9 minggu) mengingat laju pertumbuhan M.tuberculosis yang sangat lambat. Selain itu dikhawatirkan terjadi degradasi obat selama proses inkubasi (6,9). Oleh karena itu, perlu dikembangkan suatu metode uji atau diagnosis yang lebih cepat dan spesifik sehingga pengobatan dapat dilakukan dengan cepat, tepat, dan efektif. Pada saat ini, uji secara molekular banyak digunakan untuk mendiagnosis MDR-TB. Kelebihan metode ini terletak pada kecepatannya dalam memberikan hasil. Namun, uji molekular yang tersedia saat ini didesain untuk mendeteksi polimorfisme yang telah diketahui paling sering terjadi pada gen rpob pada isolat M.tuberculosis yaitu pada kodon 531, 526, dan 516. Hal ini tentunya tidak dapat diterapkan secara universal mengingat terdapat pengaruh geografis yang menyebabkan perbedaan titik-titik mutasi yang terjadi (10). Di Indonesia, penelitian mengenai daerah konservatif mutasi yang terjadi pada M.tuberculosis belum banyak dilakukan. Oleh karena itu, analisis mengenai jenis mutasi penyebab resistensi yang terjadi secara molekuler serta perbedaan asam amino yang terjadi pada isolat M.tuberculosis MDR dibandingkan dengan data wildtype-nya perlu dilakukan untuk mendapatkan database daerah konservatif terjadinya mutasi penyebab resistensi. Data ini diharapkan dapat membantu pengembangan teknik-teknik molekular dalam diagnosis MDR-TB di Indonesia pada umumnya, dan di Bali pada khususnya. Pada penelitian ini, telah dilakukan analisis pada daerah 990-1496 bp gen rpob dari isolat M.tuberculosis MDR yang ada di Bali. Dipilihnya daerah 990-1496 bp dari gen tersebut karena didalamnya telah tercakup daerah yang paling sering mengalami mutasi. Mutasi-mutasi tersebut dapat menyebabkan perubahan asam amino yang dapat menghilangkan aktivitas pengikatan RIF pada RNA polimerase. Hilangnya aktivitas pengikatan ini akan menyebabkan resistensi bakteri M.tuberculosis terhadap RIF. METODE PENELITIAN Desain primer Primer yang digunakan, didesain dan dianalisis secara in silico menggunakan program Clone Manager Suite 6 (University of Groningen). Isolasi DNA dari isolat M.tuberculosis MDR Proses ekstraksi dilakukan dengan menambahkan larutan PBS ke dalam isolat M.tuberculosis MDR. Sel dilisiskan dengan menggunakan larutan pelisis L6 (GuSCN, Tris-HCl, EDTA, NaOH, dan Triton-X) serta suspensi diatom. Campuran dikocok dengan kecepatan 100 rpm selama 15 menit kemudian disentrifuga selama 1 menit dengan kecepatan 14.006 x g. Pelet yang diperoleh, dicuci dengan washing buffer L2 (GuSCN dan Tris HCl) sebanyak dua kali serta dengan etanol 70% dingin dan aseton masing-masing satu kali, kemudian dikeringkan pada suhu 56 C. Pelet yang telah dikeringkan ditambahkan aquades steril dan diinkubasi pada suhu 56 C selama 10 menit untuk kemudian disentrifuga kembali. DNA pada supernatan yang diperoleh
digunakan sebagai templat PCR. Seluruh prosedur inokulasi dan ekstraksi DNA dilakukan dalam Biological safety cabinet class II (11). Amplifikasi gen rpob M.tuberculosis dengan metode nested PCR Gen rpob diamplifikasi dengan metode nested PCR menggunakan sepasang primer luar (outer primer) dan sepasang primer dalam (inner primer). PCR dilakukan menggunakan alat thermalcycler (Applied Biosystems) dengan denaturasi awal pada 95 C selama 15 menit, 40 siklus amplifikasi (1 menit pada 94 C, 1 menit pada 72 C), dan elongasi akhir pada 72 C selama 10 menit. Amplifikasi pertama menggunakan outer primer FNdeR1 5 -GCCATATGA TGTCTCCGATCGACCACTTC 3 dan RBamR1 5 GTGGATCCTGTCGTG CATCACAGTGATGTAG 3 (12). Produk hasil PCR berupa fragmen gen rpob sebesar 1,7 kb diamplifikasi kembali menggunakan primer kedua (primer inner) yang telah didesain. Deteksi dan analisis produk PCR Produk PCR dideteksi dengan metode elektroforesis menggunakan 1,5% agarosa (Promega) yang dilarutkan dalam TBE 1X (Invitrogen) dan mengandung etidium bromida (0,5 μg/ml). Produk PCR divisualisasi pada GelDoc (BioRad). Deteksi serta analisis produk hasil PCR dengan sekuensing dilakukan di First Base Laboratory, Malaysia, menggunakan primer yang dirancang sebelumnya. Homologi hasil sekuensing akan dianalisis dengan mengacu pada database yang ada pada www.ncbi.nlm.nih.gov. Sekuen asam amino dapat diperoleh dengan translasi sekuen nukleotida menjadi asam amino menggunakan program MEGA4. HASIL DAN PEMBAHASAN Elektroforegram hasil amplifikasi menggunakan inner primer dapat dilihat pada gambar 1. Pada gambar tersebut dapat dilihat bahwa amplikon yang dihasilkan adalah segmen DNA dengan ukuran kurang lebih + 1,7 kb. Hasil amplifikasi pertama ini, diencerkan 100x terlebih dahulu sebelum digunakan sebagai templat pada amplifikasi kedua. Hal ini dilakukan untuk mencegah terjadinya pita DNA yang berekor atau smear akibat konsentrasi templat yang terlalu tinggi (13). Hasil amplifikasi menggunakan outer primer sebagai templat dengan produk PCR menggunakan inner primer ditunjukkan pada gambar 2 dan 3. Elektroforegram tersebut menunjukkan bahwa amplifikasi fragmen 0,5 kb gen rpob M.tuberculosis pada semua isolat dengan menggunakan metode nested PCR telah berhasil dilakukan. Analisis Produk PCR dengan Sekuensing Sekuensing produk hasil PCR dilakukan di laboratorium First Base,Malaysia. Sekuensing dilakukan satu arah menggunakan primer forward inner FrTb. Analisis homologi Analisis homologi data sekuen nukleotida yang diperoleh dibandingkan terhadap sekuen galur standar M.tuberculosis H37Rv menggunakan program online BLASTN pada www.ncbi.nlm.nih.gov. Berdasarkan hasil analisis
homologi yang dilakukan, tingkat kesamaan fragmen gen rpob dibandingkan dengan galur standar sekitar 97-99% Analisis mutasi serta perubahan asam amino yang terjadi dilakukan menggunakan program MEGA4 (14). Sekuen nukleotida isolat sampel dibandingkan dengan sekuen nukleotida gen rpob M.tuberculosis H37Rv (GenBank: U12205) sebagai wildtype Berdasarkan analisis tersebut, diketahui terdapat missense mutation yang menyebabkan perubahan asam amino pada beberapa kodon. Sistem penomoran kodon dilakukan menggunakan nomor kodon rpob Escherichia coli, bukan nomor kodon M.tuberculosis sebenarnya (15,16). Perubahan yang terjadi jika dibandingkan dengan database gen rpob M.tuberculosis H37Rv wildtype (GenBank: U12205) dapat dilihat pada tabel 1. Berdasarkan perubahan tersebut, dapat diamati bahwa terdapat mutasi yang terjadi pada daerah RRDR (kodon 507-533) pada semua isolat sampel. Di samping itu, 5 dari 6 isolat yang diteliti menunjukkan adanya mutasi pada kodon 418 dengan perubahan asam amino dari asam glutamat menjadi asam aspartat. Perubahan pada kodon 516 menyebabkan perubahan sifat asam amino dari asam aspartat yang bersifat polar dan asam menjadi tirosin yang bersifat polar dan netral Perubahan pada kodon 510 juga mengubah sifat asam amino yaitu dari glutamin yang bersifat polar dan netral menjadi arginin yang bersifat polar dan basa Mutasi pada kodon 510 dan 516 merupakan mutasi yang umum terjadi, dengan angka kejadian yang sedikit bervariasi pada seluruh wilayah geografis. Mutasi pada kodon 510 ditemukan dengan frekuensi sebesar 15% pada penelitian di Filipina (17), 12,51% pada penelitian di Iran (18), dan 47,7% pada penelitian di Belarus (19). Mutasi pada kodon 516 ditemukan dengan frekuensi sebesar 4% pada penelitian di Brazil (15), 13% pada penelitian di India (10), 24% pada penelitian di Pakistan (9) serta 12,2% pada penelitian di Korea (20). Pada penelitian ini juga ditemukan, seperti telah disebutkan di atas, mutasi baru di luar daerah RRDR pada lima isolat yaitu E418D. Mutasi tersebut menyebabkan perubahan struktur asam amino yang terbentuk. Mutasi pada kodon 418 menyebabkan perubahan asam glutamat menjadi asam aspartat. Kedua asam amino tersebut bersifat polar dan asam namun gugus R yang menyusun asam amino tersebut berbeda. Gugus R asam glutamat adalah karboksi etil, sedangkan gugus R asam aspartat adalah karboksi metil Mutasi di luar daerah RRDR cukup jarang ditemukan. Pada suatu penelitian di India, hanya 5% isolat yang memiliki mutasi di luar RRDR yaitu pada kodon 145 hingga 184 (10). Pada penelitian di Afrika juga ditemukan adanya mutasi pada kodon 504 yang hanya terjadi pada dua dari total 105 isolat yang diteliti (21). Perubahan asam amino yang terjadi pada gen rpob berkaitan dengan timbulnya resistensi kedua isolat tersebut terhadap RIF. Satu saja mutasi titik yang menyebabkan perubahan atau substitusi asam amino dapat
menyebabkan penurunan atau hilangnya aktivitas pengikatan dan bertanggung jawab terhadap timbulnya fenotip yang resisten (22). Meskipun perubahan sifat atau struktur asam amino pada kedua isolat berbeda, tetapi fenotip yang tampak adalah sama yaitu penurunan atau hilangnya aktivitas pengikatan yang dalam hal ini menyebabkan terjadinya resistensi. KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, maka dapat ditarik kesimpulan sebagai berikut: 1. Jenis mutasi yang terjadi pada gen rpob daerah 990-1496 bp dari whole genom isolat MDR-TB adalah missense mutation. 2. Perbedaan asam amino yang terjadi pada gen rpob daerah 990-1496 bp dari isolat M.tuberculosis MDRdibandingkan dengan database wildtype-nya adalah E418D (asam glutamat menjadi asam aspartat pada kodon 418) selain di daerah RRDR Saran Penelitian lanjutan mengenai penentuan daerah konservatif terjadinya mutasi penyebab resistensi pada M.tuberculosis dapat dilakukan menggunakan isolat yang lebih banyak untuk mendapatkan database yang lebih lengkap. DAFTAR PUSTAKA 1. Depkes RI. 2007. Pedoman Nasional Penanggulangan Tuberkulosis Edisi 2. Cetakan Pertama. Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 2. WHO. 2011a. WHO Report 2011: Global Tuberculosis Control. Geneva: WHO Press. 3. Depkes RI. 2012. Penanggulangan TB Alami Kemajuan. (Cited 2012 October,27). Available from: URL:http://www.bppsdmk.depkes.go.id. 4. WHO. 2011b. Tuberculosis Profile Indonesia. (Cited 2012 September,8).Available from: URL:http://www.who.int/tb/data. 5. WHO. 2010. Multidrug and Extensively Drug-Resistant TB (M/XDR-TB) 2010 6. Dipiro J.T., Robert L.T., Gary C.Y., Gary R.M., Barbara G.W., dan L. Michael P. 2008. Pharmacotherapy: A Pathophysiologic Approach. 7th Edition. United States of America: The McGraw Hill Companies Inc. 7. Lewis, K., Abigail A.S., Harry W.T., dan Richard G.W. 2002. Bacterial Resistance to Antimicrobials. New York: Marcel Dekker Inc. 8. Syaifudin, M., Rosilawati, M.L., Irawan, H., dan Bela, B. 2007. Identifikasi Mycobacterium tuberculosis dan Analisis Mutasi Gen RpoB dan KatG Penyebab Resistensi Ganda dengan Teknik Molekuler. Jakarta: Balitbang, BATAN. 9. Ali, A., Rumina H., Kauser J., Nusrat J., Ejaz Q., dan Zahra H. 2011. Characterization of Mutations Conferring Extensive Drug Resistance
to Mycobacterium tuberculosis Isolates in Pakistan. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 55(12): 5654-5659. 10. Lingala, M.A.L., Aparna S., Suman J., K.V.S.M. Rao, dan P.V. Ranganadha R. 2010. Clinical and Geographical Profiles of rpob Gene Mutations in Mycobacterium tuberculosis Isolates from Hyderabad and Koraput in India. Journal of Microbiology and Antimicrobials, 2(2): 13-18. 11. Boom, R., C.J.A. Sol, M.M.M. Salimans, C.L. Jansen, P.M.E.W. van Dillen, dan J. van der Noordaa. 1990. Rapid and simple method for purification of nucleic acid. Journal of Clinical Microbiology, 28(3): 495-503. 12. Yowani, S.C. 2012. Mutasi Gen rpob Isolat Mycobacterium tuberculosis Multi Drug Resistance 885 dan 836 serta Kloningnya pada Plasmid pet- 28A (Disertasi). Denpasar: Universitas Udayana. 13. Voytas, D. 2000. Resolution and Recovery of Large DNA Fragments. Supplement 51. USA: John Wiley & Sons. 14. Tamura, K., Dudley J., Nei M., dan Kumar S. 2007. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) Software Version 4.0. Molecular Biology and Evolution, 24: 1596-1599. 15. Valim, A.R.M., Maria L.R.R., Marta O.R., dan Arnaldo Z. 2000. Mutations in the rpob Gene of Multidrug-Resistant Mycobacterium tuberculosis Isolates from Brazil. Journal of Clinical Microbiology, 38(8): 3119-3122. 16. Ubyaan, R., Agnes E.M., dan Alvian S. 2012. Studi Pengaruh Mutasi Gen rpob pada Kodon 513: Analisis pada Isolat Papua. Prosiding InSINa 2012.Jayapura: Universitas Cendrawasih. 17. Agdamag, D.M.D., Kageyama S., Solante R., Espantaleon A.S., Sangco J.C.E.,dan Suzuki Y. 2003. Characterization of Clinical Isolates of Mycobacterium tuberculosis Resistant to Drugs and Detection of RpoB Mutation in Multidrug-resistant Tuberculosis in the Philippines. Int J Tuberc Dis, 7(11): 1104-1108. 18. Bostanabad, S.Z., Abolfazi F., Khaled S., Farid A., Ali K., Alireza H.T., et al. 2007. Frequency and Molecular Characterization of Rifampicin Resistance in rpob Region of Multiple Drug Resistance (MDR) Isolates from Tuberculosis Patients in Southern Endemic Region of Iran. Iranian Journal of Biotechnology, 5(4): 212-218. 19. Saeed, Z.B., Seyed A.N., Mohammad K.K., Parvaneh A., Zahra T., Mozhgan M.,dkk. 2009. Characterization of molecular evolution in multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis in patients with active pulmonary tuberculosis of different regions in Belarus. Biology and Medicine, 1(4): 39-49. 20. Yoon, J., Ji-Sun N., Kyung-Jin K., Yeonim C., Hyeyoung L., Sang-Nae C., dkk. 2011. Molecular Characterization of Drug-Resistant and SusceptibleMycobacterium tuberculosis Isolated from Patients with Tuberculosis in Korea. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 72(2012): 52-61.
21. Schilke, K., K. Weyer, G. Bretzel, B. Amthor, J. Brandt, V. Sticht-Groh, dkk.1999. Universal Pattern of rpob Gene Mutations among Multidrug-Resistant Isolates of Mycobacterium tuberculosis Complex from Africa, Int J Tuberc Dis. 3(7): 620-626. 22. Retnoningrum, D.S., dan Roga F.K. 2004. Mekanisme Tingkat Molekul Resistensi terhadap Beberapa Obat pada Mycobacterium tuberculosis. Acta Pharmaceutica Indonesia, 29(3): 92-95 Isolat MDR Perubahan Nukleotida Perubahan Asam Amino P10 GAA GAT E418D CAC CTC H526L P11 TCG TTG S531L P16 GAA GAT GAC TAC 134 GAA GAT CAG CGG 86 GAA GAT CAC CGC 151 GAA GTA TCG TTG E418D D516Y E418D Q510R E418D H526R E418V S531L Gambar 1. Elektroforegram amplikon dari outer primer sebesar 1,7 kb( ) M: Marker ; 134,P16,P10,P11,86,151 : Isolat MDR TB
Gambar 2. Elektroforegram amplikon dari outer primer sebesar 0,5 kb( ) M: Marker ; 134,P16,P10 : Isolat MDR TB Gambar 3. Elektroforegram amplikon dari outer primer sebesar 0,5 kb( ) M: Marker ; 86,151 : Isolat MDR TB