PEMBAHASAN. 3, karena NO 3 digunakan

67 PEMBAHASAN Biakan pengkayaan memiliki kondisi anaerob dengan konsentrasi NO 3 dalam medium denitrifikasi cair sebesar 30 mm. Oleh karena itu isolatisolat yang didapatkan diduga merupakan bakteri pereduksi NO 3, karena NO 3 digunakan sebagai penerima elektron dengan tidak adanya O 2. Kemampuan mereduksi NO 3 dikonfirmasi dengan uji reduksi NO 3. Bakteri pereduksi NO 3 dapat dibedakan antara bakteri denitrifikasi dengan bakteri DNRA. Isolat oksidatif dianggap sebagai bakteri denitrifikasi sedangkan bakteri fermentatif dianggap sebagai bakteri pereduksi NO 3 fermentatif atau dikenal sebagai bakteri DNRA fermentatif. Garcia dan Tiedje (1981) menyatakan bahwa pada umumnya bakteri denitrifikasi bersifat aerob (oksidatif) dan tidak dapat tumbuh secara fermentatif pada keadaan anaerob. Bakteri denitrifikasi dipilih untuk penelitian selanjutnya berhubungan dengan aktivitasnya mereduksi N 2 O karena proses reduksi N 2 O merupakan salah satu tahap dalam denitrifikasi. Bakteri yang bersifat oksidatif didapatkan di empat lokasi dari enam lokasi pengambilan sampel sedangkan dari tiga lokasi didapatkan bakteri fermentatif. Adanya kecenderungan bahwa di suatu lokasi hanya terisolasi bakteri dengan satu sifat metabolisme yaitu oksidatif atau fermentatif diduga karena pengaruh faktor lingkungan asal bakteri. Menurut Burgin dan Hamilton (2007) serta Megonigal et al. (2004) bakteri DNRA fermentatif lebih banyak tumbuh di lingkungan yang kaya akan C labil dengan NO 3 terbatas atau rasio C : NO 3 tinggi sedangkan bakteri denitrifikasi tumbuh di lingkungan dengan C : NO 3 lebih rendah. Beberapa faktor lingkungan lain kemungkinan juga berpengaruh terhadap kelompok bakteri yang dominan meskipun secara tidak langsung. Davis et al. (2007) menyatakan faktorfaktor yang mempengaruhi kecepatan proses mikrobiologis seperti tekstur tanah, kemiringan, hidrologi, vegetasi, iklim dan pengelolaan lahan dapat mempengaruhi suhu tanah, status aerasi tanah, pemberi elektron dan status N tanah. Bakteri denitrifikasi dapat diisolasi dalam keadaan aerob maupun anaerob, sesuai dengan pernyataan Lalucat et al. (2006) bahwa denitrifikasi merupakan proses yang dapat terjadi secara fakultatif anaerob maupun mikroaerofil. Proses

68 denitrifikasi pada bakteri bersifat fakultatif. Sedangkan Madigan et al. (2009) menyatakan bahwa jika di lingkungan ada oksigen (O 2 ), bakteri melakukan respirasi aerob dan gengen yang menyandi proses anaerob mengalami represi. Sebaliknya jika O 2 berkurang di lingkungan, bakteri melakukan respirasi anaerob dan penerima elektron alternatif mengalami reduksi. Hasil penelitian El Hassan et al. (1985) menunjukkan bahwa pertumbuhan bakteri denitrifikasi Rhizobium menggunakan NO 3, NO 2 maupun N 2 O memiliki koefisien hasil sel sebesar 40 70% dari koefisien hasil sel dalam pertumbuhannya menggunakan O 2. Tanah sawah sebagai sumber isolat memiliki ph 5.06.0. Nilai ph tersebut bukan merupakan ph optimum untuk terjadinya denitrifikasi karena ph optimum untuk denitrifikasi adalah 7.08.0 (Knowles 1982). Meskipun demikian proses denitrifikasi dapat terjadi pada kisaran ph 3.99.0 (Włodarczyk 2004) bahkan di atas ph 11 (Knowles 1982). Variasi ph tanah antara 5.06.0 nampaknya tidak berpengaruh terhadap sifat oksidatiffermentatif maupun aerobanaerob dari isolatisolat yang didapatkan. Sepuluh bakteri yang diuji semuanya dapat mereduksi NO 3, sehingga dapat diduga memiliki enzim NO 3 reduktase disimilatif yang berupa Nap atau Nar. Meskipun bakteri dapat memiliki sekaligus enzimenzim NO 3 reduktase asimilatif dan disimilatif seperti P. aeruginosa (Jeter et al. 1984) namun dalam percobaan ini kemungkinan NO 3 tidak mengalami reduksi secara asimilatif + karena proses ini dihambat oleh NH 4 (MorenoVivian 1999) dan reduksi NO 3 asimilatif terjadi jika NO 3 merupakan satusatunya sumber N (Goldflam dan Rowe 1983). Medium mengandung NH + 4 sebesar 7.48 mm yang dapat digunakan sebagai sumber N. Sepuluh isolat yang diuji dapat mereduksi NO 2 sehingga akumulasi NO 2 nilainya jauh lebih kecil dibandingkan dengan NO 3 yang tereduksi. Reduksi NO 2 dapat menghasilkan gas NO, N 2 O dan N 2. Dalam kondisi anaerob bakteri denitrifikasi dapat menggunakan NO 3 atau NO 2 sebagai penerima elektron untuk mengoksidasi substrat organik sehingga didapatkan energi. Menurut Dong et al. (2002) dan Thauer et al. (1977) jika diasumsikan H 2 sebagai pemberi elektron standar, besarnya energi bebas standar ( G 0 ' ) yang dihasilkan oleh setiap mol H 2 selama pembentukan N 2 menggunakan NO 2 sebesar 265 KJ mol H 1 2,

69 sedangkan energi bebas yang dihasilkan dari NO 3 sebesar 224.8 KJ mol H 1 2. Jika dilihat dari angka tersebut maka terjadinya produksi N 2 dari NO 2 lebih besar dibandingkan produksi N 2 dari NO 3. Meskipun demikian jika dihitung per mol penerima elektron maka energi bebas standar pembentukan N 2 sebesar 397.5 KJ per mol NO 2 dan 560.3 KJ per mol NO 3. Jika di lingkungan pemberi elektron berada dalam jumlah banyak sedangkan penerima elektron terbatas, adanya NO 3 lebih menguntungkan. Sepuluh isolat bakteri yang diuji mampu mereduksi N 2 O eksogen. Aktivitas reduksi N 2 O terukur sebagai N 2 O yang direduksi selama 5 hari setiap mililiter biakan. Snyder et al. (1987) memperkirakan bahwa kemampuan bakteri mengambil N 2 O dari lingkungannya dan aktivitas N 2 O reduktase berpengaruh terhadap kemampuan bakteri tumbuh menggunakan N 2 O eksogen. Tiga isolat yang dipilih di antara 10 isolat yang mampu mereduksi N 2 O yaitu BL1, BL2 dan BLN1 mampu tumbuh baik dengan menggunakan N 2 O sebagai satusatunya penerima elektron jika N 2 O tersedia cukup untuk pertumbuhannya. Tidak adanya pertumbuhan yang baik dalam biakan dengan konsentrasi N 2 O terlarut yang rendah (88 µm) menunjukkan bahwa N 2 O merupakan satusatunya penerima elektron sehingga jika N 2 O habis bakteri tidak tumbuh lagi. Zumft (1997) dan Chen et al. (2004) menjelaskan bahwa denitrifikasi merupakan bagian dari proses bioenergetik dalam sel bakteri dan berkaitan dengan sintesis ATP dalam proses respirasi. Selanjutnya menurut Zumft dan Körner (2007) respirasi N 2 O dapat menopang kebutuhan bioenergetik bakteri denitrifikasi dengan tidak adanya O 2 di lingkungan. Reduksi N 2 O menjadi N 2 bersifat eksergonik dan energi bebas standar yang dihasilkan menurut Dong et al. (2002) dan Thauer et al. (1977) sebesar 341.1 KJ mol H 1 2. Isolat BL2 memiliki µ max paling besar yang berarti isolat ini dapat mencapai kecepatan pertumbuhan paling tinggi menggunakan N 2 O. Mengacu pada pernyataan Liu et al. (2003b) µ max menggambarkan batas pertumbuhan mikroba. Dalam hubungannya dengan penggunaan N 2 O oleh bakteri sebagai penerima elektron terakhir dalam respirasi yang berkaitan erat dengan pertumbuhan, nilai µ max menunjukkan batas kecepatan pertumbuhan yang dapat dicapai bakteri menggunakan N 2 O. Penelitian El Hasan et al. (1985) memberikan

70 hasil bahwa µ max Rhizobium galur A26 dan A28 di medium glutamatekstrak khamir dengan N 2 O sebagai penerima elektron masingmasing sebesar 0.43 dan 0.19 jam 1. µ max dari isolat BL1 dan BL2 nilainya berada di antara µ max dua galur bakteri tersebut. Sedangkan µ max dari isolat BLN1 hampir sama dengan µ max Rhizobium galur A28. Isolat BL1 memiliki K s lebih kecil dari K s dua isolat lainnya. Nilai K s berhubungan dengan kecepatan penggunaan substrat (Greer et al. 1992). K s sebanding dengan konsentrasi substrat yang diperlukan untuk pertumbuhan dengan kecepatan setengah dari µ max. Jika K s nilainya kecil berarti permease bakteri memiliki afinitas tinggi sehingga dapat beradaptasi untuk tumbuh pada lingkungan dengan konsentrasi substrat rendah (Stainer et al. 1976). Menurut Liu et al. (2003b) nilai K s dipengaruhi oleh sifat dari jenis mikroba dan substrat pembatas yang menurut Okpokwasili dan Nweke (2005) dapat berupa sumber C atau energi, penerima elektron atau sumber penyusun sel lainnya. Reduksi N 2 O berlangsung seiring dengan pertumbuhan (Gambar 8) sehingga data ini memperjelas adanya pemakaian N 2 O untuk pertumbuhan dalam proses respirasi. Isolat BL2 memiliki kecepatan pertumbuhan paling tinggi sedangkan isolat BLN1 memiliki kecepatan reduksi N 2 O paling tinggi. Meskipun N 2 O digunakan dalam proses respirasi yang mutlak dibutuhkan untuk pertumbuhan tetapi rasio antara kecepatan pertumbuhan dengan kecepatan reduksi N 2 O tidak sama di antara isolatisolat yang diuji. Rasio antara kecepatan pertumbuhan dengan kecepatan reduksi berhubungan dengan efisiensi penggunaan N 2 O sebagai penerima elektron. Bakteri yang lebih efisien menggunakan suatu jenis penerima elektron akan dapat bersaing dengan bakteri lain jika di lingkungan hanya terdapat penerima elektron tersebut dengan jumlah terbatas. Meskipun demikian untuk kepentingan tertentu misalnya untuk mereduksi N 2 O atau bahan pencemar lain dari lingkungan, bakteri yang menggunakan substrat secara efisien kurang menguntungkan. Nilai g atau waktu generasi isolat BL2 paling rendah dibandingkan dua isolat lain, menunjukkan bahwa isolat ini membutuhkan waktu paling cepat untuk membelah. Waktu generasi adalah waktu yang diperlukan oleh populasi bakteri untuk melipatduakan jumlahnya. Kecepatan pertumbuhan spesifik dan waktu

71 generasi dapat digunakan untuk mengetahui kondisi biakan optimum bagi organisme tertentu dan pengaruh beberapa perlakuan terhadap biakan (Madigan et al. 2009). Waktu generasi yang pendek menunjukkan pertumbuhan cepat, tetapi jika ditumbuhkan menggunakan N 2 O, waktu generasi yang pendek tidak menunjukkan tingginya kemampuan mereduksi N 2 O. Medium berpengaruh terhadap waktu generasi. Penelitian Okureke (1984) menunjukkan jika ditumbuhkan menggunakan N 2 O sebagai satusatunya penerima elektron, bakteri Pseudomonas perfectomarinus, P. stutzeri dan Alcaligenes faecalis memiliki waktu generasi masingmasing 2.0, 1.2 dan 1.0 jam 1 di medium tryptic soy broth (TSB), dan 4.0, 2.0 dan 1.4 jam 1 jika ditumbuhkan di medium nutrient broth (NB). Dilihat ketahanannya tumbuh dan melakukan aktivitas reduksi N 2 O, isolat BL1, BL2 dan BLN1 memiliki ketahanan relatif tinggi untuk tumbuh baik selama 15 jam dengan masih dapat melakukan aktivitas reduksi N 2 O. Dalam penelitian Snyder et al. (1987). Pseudomonas aeruginosa PAO1 dan P1 kehilangan kemampuannya tumbuh menggunakan N 2 O dalam waktu 13 jam karena hilangnya kemampuan mengambil N 2 O dari lingkungan selnya. Sedangkan galur P2 mengalami penurunan kemampuan mengambil N 2 O dari lingkungannya secara lebih lambat (24 jam) dari pada galur PAO1 dan P1, dan tetap tumbuh meskipun pertumbuhannya lambat. Sintesis, kerusakan atau inaktivasi enzim diperkirakan merupakan mekanisme yang mengendalikan aktivitas N 2 O reduktase. N 2 O yang ada di lingkungan luar sel pada konsentrasi tertentu dapat menyebabkan inaktivasi N 2 O reduktase. Galurgalur bakteri yang memiliki kemampuan reaktivasi atau mensintesis kembali N 2 O reduktase akan bertahan hidup lebih lama menggunakan N 2 O. Karakterisasi secara morfologis, fisiologis maupun molekuler terhadap isolat BL1, BL2 dan BLN1 memberikan hasil bahwa tiga isolat tersebut berbeda, meskipun antara BL1 dan BLN1 lebih menunjukkan kemiripan dibanding antara dua isolat tersebut dengan BL2. Morfologi koloni isolat BLN1 paling mirip dengan O. anthropi yang pertama kali dideskripsikan oleh Holmes et al. (1988) yaitu bentuk koloni bundar, tepi licin dan permukaan mengkilap. Berdasarkan analisis 16S rrna, isolat BL1 dan BLN1 masingmasing memiliki 99 dan 98%

72 kemiripan dengan O. anthropi ATCC 49188. Berdasarkan uji fisiologis menggunakan API 20NE, isolat BLN1 memiliki kedekatan dengan O. anthropi sebesar 99.9%. Dari hasil identifikasi dapat dikatakan bahwa isolat BL1 dan BLN1 termasuk ke dalam spesies O. anthropi. Isolat BL2 dapat dianggap sebagai spesies baru dalam genus Ochrobactrum karena memiliki 95% kemiripan dengan O. anthropi ATCC 49188. Berdasarkan definisi dari Stackebrandt dan Goebel (1994) galurgalur dengan 97% kemiripan DNA atau lebih dari 16S rrna merupakan spesies yang sama. Sedangkan dalam Madigan et al. (2009) disebutkan bahwa perbedaan urutan basa dalam 16S rrna lebih dari 5% berarti merupakan genus baru, sehingga kemiripan 95% masih menunjukkan berada dalam satu genus. Tiga dari sepuluh isolat yang mampu mereduksi N 2 O eksogen merupakan bakteri dari genus Ochrobactrum, dua di antaranya adalah spesies O. anthropi. Genus Ochrobactrum pertama kali dideskripsikan oleh Holmes et al. (1988). Pada awalnya O. anthropi merupakan satusatunya spesies dalam genus Ochrobactrum, kemudian dalam perkembangannya dideskripsikan spesiesspesies baru seperti O. intermedium (Velasco et al 1998), O. tritici dan O. grigonense (Lebuhn et al. 2000), O. lupini (Trujillo et al. 2005) dan O. cytisi (ZurdoPiñero et al. 2007). Ochrobactrum dapat tumbuh di berbagai lingkungan seperti tanah (Lebuhn et al. 2000), dasar sungai (Lee dan Park 2009), lumpur aktif (Song et al. 2002), bagian tubuh manusia (Holmes et al. 1988), hewan (Shilton et al. 2008) maupun tanaman (Trujillo et al. 2005). Spesies O. anthropi jumlahnya cukup melimpah di tanah yaitu 10 4 10 6 g 1 tanah kering (Lebuhn et al. 2000). Reche dan Fiuza (2005) mendapatkan isolat O. anthropi dari air sawah di Brazil sebanyak 2% dari seluruh spesies yang dapat diisolasi dari air sawah tersebut. Genus Ochrobactrum merupakan anggota dari familia Brucellaceae, ordo Rhizobiales, kelas Alphaproteobacteria (Boone dan Castenholz 2001). Menurut Zumft (1997) denitrifikasi dilakukan oleh beraneka ragam bakteri yang secara taksonomis merupakan anggotaanggota dari Proteobacteria. Beberapa galur bakteri denitrifikasi dari genus Ochrobactrum telah diisolasi dan diidentifikasi seperti O. anthropi SY509 (Song et al. 2002), O. anthropi YD50.2 (Doi et al.

73 2009) dan Ochrobactrum sp.g31 (Lee dan Park 2009), tetapi belum diukur kemampuannya mereduksi N 2 O. Analisis gen nosz pada penelitian ini belum mendapatkan hasil yang memuaskan karena potongan DNA yang didapatkan menggunakan primer nosz661f dan nosz1773r memiliki kemiripan lebih besar dengan gengen bukan nosz dibandingkan kemiripannya dengan nosz. Primer nosz661f dan nosz1773r pada awalnya dipilih karena primer ini telah digunakan dalam beberapa penelitian antara lain oleh Scala dan Kerkhof (1998), Stres et al. (2004) dan Horn et al. (2006). Primer ini ternyata tidak menempel secara spesifik hanya pada nosz, melainkan dapat menempel pada gen lain yang ujungnya memiliki urutan basa yang sama dengan sebagian urutan basa pada primer misalnya pada gen asetolaktat sintase (Lampiran 12). Gen nosz pada O. anthropi yang telah berhasil diamplifikasi menggunakan primer nosz dan disekuensing adalah pada O. anthropi LMG 2136 (Nogales et al. 2002), O. anthropi LMG 3331 (Rosch et al. 2002) dan O. anthropi YD50.2 (Doi et al. 2009). Gen nosz O. anthropi LMG 2136 diamplifikasi menggunakan primer nosz661b (CGG YTG GGG SMW KAC CAA) dan nosz1773b (ATR TCG ATC ARY TGN TCR TT) menghasilkan pita dengan panjang 1100 bp. Amplifikasi nosz pada O. anthropi LMG 3331 menggunakan primer noszf (CGY TGT TCM TCG ACA GCC AG) dan noszr (CAT GTG CAG NGC RTG GCA GAA) menghasilkan pita dengan panjang 700 bp. Sedangkan nosz pada O. anthropi YD50.2 diamplifikasi menggunakan nosz F (CAGAAACTCGATGTGCATTATCAG) dan nosz R (CCACGAGCAGTAAT ACCACCAC) dengan panjang pita 1911 bp. Gen nosz pada O. anthropi ATCC 49188 didapatkan dari pembuatan peta genomnya dengan panjang 1911 bp (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/cp000759.1). Doi et al. (2009) membandingkan sekuen asam amino N 2 O reduktase yang disandi oleh nosz O. anthropi YD50.2 dengan sekuen dari beberapa bakteri lain dan kemiripannya sebesar 89% dengan Brucella melitensis 16M, 99% dengan O. anthropi ATCC 49188, 62% dengan P. aeruginosa PAO1, 62% dengan Paracoccus denitrificans PD1222 dan 49% dengan Ralstonia eutropha H16.

74 Percobaan untuk melihat kemampuan bakteri menurunkan emisi N 2 O dibuat dengan sistem tertutup sehingga N 2 O yang terukur merupakan akumulasi N 2 O yang dihasilkan oleh aktivitas mikroba dalam tanah atau air. Nitrat dalam bentuk NaNO 3 ditambahkan sebagai sumber N 2 O untuk mengetahui kemampuan isolat BLN1 mereduksi N 2 O dalam sedimen tanah sawah. NaNO 3 bersifat larut dalam air dan sangat mudah mengalami disosiasi menjadi Na + dan NO 3 (Makogon 1997; Moore et al. 2010). Dalam tanah terutama yang bersifat anaerob, NO 3 dapat segera mengalami denitrifikasi. Penelitian Steven dan Laughlin (2002) menggunakan NO 3 yang dilabel ( 15 NO 3 ) menunjukkan bahwa fluks N 2 O paling tinggi dapat terbentuk dari NO 3 yang ditambahkan ke dalam tanah setelah sekitar 8 jam. Penelitian Betlach dan Tiedje (1981) memberikan penjelasan bahwa bakteri denitrifikasi Flavobacterium sp. mereduksi NO 3 sampai hampir habis dalam waktu 40 menit dengan konsentrasi NO 3 awal dalam medium sebesar 0.5 mm tanpa mengakumulasi NO 2 sedangkan Pseudomonas fluorescens mereduksi NO 3 dalam waktu yang hampir sama tetapi mengakumulasi NO 2 dengan konsentrasi tertinggi pada sekitar menit ke30 dan NO 2 selanjutnya mengalami reduksi sehingga hampir habis menjelang menit ke60. Peningkatan banyaknya N 2 O di air permukaan selama 6 jam setelah penambahan 0.6 mmol NO 3 menunjukkan hasil aktivitas bakteri denitrifikasi dalam tanah mereduksi NO 3. Pada jam ke9 konsentrasi N 2 O di air permukaan menurun karena N 2 O mengalami reduksi lebih lanjut menjadi N 2. Meskipun terdapat peningkatan konsentrasi pada jam ke6 di tanah tanpa isolat, N 2 O yang dilepaskan ke udara tidak mengalami peningkatan yang signifikan pada waktu tersebut. Dengan demikian dapat dikatakan, N 2 O yang dihasilkan dan dilepaskan ke air tidak banyak lepas ke udara. Menurut Heincke dan Kaupenjohann (1999) kecepatan lepasnya N 2 O yang terlarut dalam air ke atmosfer tergantung antara lain kepada turbulensi dan kecepatan aliran air. Bila terdapat aliran dengan aerasi yang cukup maka N 2 O terlarut akan keluar ke atmosfer dalam beberapa menit. Namun sebaliknya, dapat terjadi tidak tercapainya kesetimbangan antara N 2 O terlarut dengan N 2 O di atmosfer. Jika N 2 O cukup lama tinggal dalam air tanah maka akan cukup waktu untuk terjadinya reduksi N 2 O menjadi N 2.

75 Akumulasi N 2 O berhubungan dengan rasio kecepatan produksi dan kecepatan reduksi N 2 O. Perubahan struktur komunitas dengan adanya penambahan isolat BLN1 diperkirakan menurunkan rasio antara kecepatan produksi dengan kecepatan reduksi N 2 O. Penurunan produksi N 2 O oleh isolat BLN1 mengindikasikan bahwa N 2 O dapat bersaing dengan penerima elektron lain. Menurut Cho et al. (1997), preferensi elektron terhadap penerima elektron selama proses denitrifikasi ditentukan oleh konsentrasi penerima elektron dan afinitas elektron terhadap penerima elektron. Penelitian Dendooven et al. (1996) memberikan hasil rasio afinitas elektron terhadap NO 3, NO 2 dan N 2 O di tanah adalah 1 : (120160) : (1.22.6). Kecenderungan mikroba tanah mengkonsumsi NO 3 atau N 2 O pernah diteliti oleh Wlodarczyk et al. (2006) dengan menambahkan 300 NO 3 N kg ha 1 (dengan perkiraan NO 3 mencapai kedalaman 20 cm dari permukaan tanah) ke dalam tanah kemudian diamati NO 3 yang tereduksi serta N 2 O yang terbentuk dan tereduksi. Pada dua dari tiga belas sampel yang diamati, N 2 O dikonsumsi lebih cepat dari pada NO 3 sedangkan dari sebelas sampel lainnya, NO 3 dan N 2 O dikonsumsi secara seimbang. Adanya kompetisi terhadap elektron menyebabkan reduksi N 2 O dalam tanah dapat mengalami penghambatan. Blackmer dan Bremmer (1978) melaporkan bahwa kemampuan tanah mereduksi N 2 O dapat dipengaruhi oleh konsentrasi NO 3 dalam tanah. Semakin besar konsentrasi NO 3 dalam tanah semakin besar efek penghambatannya terhadap reduksi N 2 O. Efek penghambatan NO 3 terhadap reduksi N 2 O semakin besar pada ph rendah. Reduksi N 2 O dapat juga dihambat oleh NO seperti pada penelitian Frunzke dan Zumft (1986), reduksi N 2 O oleh P. perfectomarina dihambat oleh NO karena NO bereaksi dengan N 2 O reduktase sehingga enzim ini kehilangan sebagian besar aktivitas katalitiknya. NO merupakan hasil antara denitrifikasi sebelum terbentuk N 2 O dan N 2. Beberapa penelitian juga menunjukkan bahwa reduksi N 2 O dipengaruhi oleh O 2. Menurut Vieten (2008) hanya 1% mikroba dalam tanah memiliki kemampuan menghasilkan N 2 O reduktase. Produksi enzim dipengaruhi oleh lingkungan seperti O 2 dan hasilhasil antara denitrifikasi. Isolat BLN1 yang diinokulasikan ternyata mampu hidup bertahan dan melakukan aktivitas mereduksi N 2 O di antara komunitas bakteri dalam tanah. Hal

76 ini diperkirakan karena isolat yang digunakan berasal dari tanah sawah dan juga digunakan dalam penelitian menggunakan tanah sawah. Selain itu, menurut Martin et al. (1988) populasi bakteri denitrifikasi bersifat persisten dan stabil. Isolat BLN1 selain dapat menggunakan N 2 O juga dapat menggunakan NO 3, NO 2 dan O 2 sebagai penerima elektron terakhir sehingga mendukung ketahanan hidupnya di alam. Meskipun isolat BLN1 merupakan bakteri denitrifikasi, dalam aplikasinya ke tanah sawah, isolat ini diharapkan tidak mengurangi ketersediaan N bagi tanaman. Denitrifikasi merupakan salah satu mekanisme lepasnya N dari tanah selain leaching NO 3 dan volatilisasi amonia (NH 3 ). Pupuk N yang umum digunakan untuk tanaman padi dalam bentuk urea ((NH 2 ) 2 CO). Urea dihidrolisis oleh enzim urease menyebabkan terbentuknya CO 2 dan NH 3, selanjutnya NH 3 dapat berubah menjadi NH + 4. Dalam larutan tanah, NH + 4 berada dalam keadaan + kesetimbangan dengan NH 3 yang mudah mengalami volatilisasi. Sedangkan NH 4 dapat mengalami pengikatan oleh partikel tanah yang bermuatan negatif berupa bahan organik tanah maupun liat. NH 3 atau NH4 + dapat mengalami nitrifikasi menghasilkan NO 3 (Stark dan Richards 2008). NO 3 merupakan anion yang tidak mengalami pengikatan oleh tanah (Kramer et al. 2006) sehingga mudah mengalami leaching. Meskipun denitrifikasi merupakan salah satu mekanisme hilangnya N dari lahan sawah, berdasarkan model perhitungan yang dilakukan oleh Kirk dan Kronzucker (2005), N yang hilang melalui denitrifikasi nilainya seperlima dibandingkan N di rizosfer yang dapat diserap oleh tanaman. Menurut Garcia dan Tiedje (1981) tanaman dapat bersaing dengan mikroba denitrifikasi dalam keadaan NO 3 terbatas, terutama tanaman pada awal pertumbuhan. Konsentrasi enzimenzim denitrifikasi meningkat seiring dengan jarak terhadap perakaran tanaman. Penambahan jumlah sel bakteri denitrifikasi dalam bentuk isolat BLN1 diharapkan tidak berpengaruh terhadap denitrifikasi dalam tanah. Isolat ini memiliki aktivitas mereduksi NO 3 relatif kecil dibandingkan isolatisolat denitrifikasi lain yang diuji. Selain itu, menurut Garcia dan Tiedje (1981), selain O 2 dan bahan organik, NO 3 merupakan faktor penentu proses denitrifikasi. Di sawah pada umumnya NO 3 tidak tersedia dalam konsentrasi tinggi. Dengan

77 demikian, dalam keadaan ketersediaan NO 3 terbatas, aktivitas denitrifikasi tidak akan meningkat sejalan dengan peningkatan jumlah bakteri denitrifikasi. Isolat BLN1 berpotensi untuk menurunkan emisi N 2 O di lahan sawah karena memiliki kemampuan mereduksi N 2 O dalam biakan denitrifikasi dengan penambahan N 2 O sebagai satusatunya penerima elektron terakhir dan juga menurunkan konsentrasi N 2 O di air permukaan dalam percobaan dengan tanah sawah. Diharapkan isolat BLN1 atau dua isolat lain yaitu BL1 dan BL2, setelah melalui penelitian lanjutan dapat diterapkan untuk mengurangi emisi N 2 O dari lahan sawah.