Lampiran 1. Pembuatan Media Bakteri (SWC dan TCBS).

39 Lampiran 1. Pembuatan Media Bakteri (SWC dan TCBS). 1. Sea Water Complete (SWC) Cair. Media SWC pada penelitian ini digunakan untuk kultivasi Vibrio harveyi yang akan digunakan untuk perlakuan infeksi. Media SWC cair sebanyak 1000 ml dibuat dari bahan-bahan bacto peptone 5 g, yeast extract 1 g, glycerol 3 ml, air laut 750 ml dan akuades 250 ml. Media SWC 1000 ml tersebut dilakukan dengan mencampurkan semua bahan sesuai takaran di atas. Pencampuran dilakukan di labu erlenmeyer yang juga langsung digunakan sebagai wadah kultivasi. Selanjutnya campuran bahanbahan dipanaskan di penangas air pada suhu 100 o C sampai larut sempurna. Setelah larut, media selanjutnya disterilkan menggunakan autoklaf pada suhu 121 o C dan tekanan 1 atm selama 15 menit. 2. Thiosulphate Citrate Bile Salt Sucrose (TCBS) Agar. Media agar TCBS digunakan untuk menumbuhkan bakteri Vibrio karena media ini bersifat spesifik untuk menumbuhkan bakteri Vibrio. Dalam penelitian ini, TCBS digunakan untuk pengukuran atau penghitungan Vibrio pasca perlakuan infeksi. Untuk pembuatan 1000 ml media ini dilakukan dengan melarutkan bubuk media agar TCBS sebanyak 98 gram dalam 1000 ml akuades steril. Larutan tersebut dipanaskan di penangas air pada suhu 100 o C hingga larut sempurna.

40 Lampiran 2. Prosedur Pembuatan Preparat Histologi Jaringan. Pada penelitian ini dilakukan pembuatan preparat histologi untuk jaringan otot dan organ limfoid udang uji. Dalam pembuatan preparat histologi jaringan dilakukan tahap sebagai berikut: 1. Preparasi Jaringan. Preparasi jaringan terdiri dari 5 tahap, yaitu: 1. Dehidrasi 2. Clearing 3. Impregnasi 4. Embedding 5. Blocking Proses jaringan ini bertujuan agar jaringan yang umumnya lunak nantinya dapat dipotong setebal 3-5 µm, diwarnai dan dilihat bentuk selnya di bawah mikroskop. Bila sayatan jaringan lebih tebal, maka bentuk sel dari jaringan tersebut tidak jelas karena terjadi penumpukan atau saling tindih menindih satu sel dengan yang lainnya. Untuk mendapatkan sayatan yang tipis, maka jaringan perlu diikat dalam parafin. Agar ikatan dalam parafin tidak mudah lepas, maka perlu dilakukan beberapa tahapan proses pembuatannya. a. Proses Dehidrasi Proses ini dimaksudkan agar cairan di dalam sel/jaringan sampel di tarik keluar, untuk akhirnya diganti dengan parafin. Penarikan air keluar dari sel dilakukan dengan cara merendam jaringan dalam bahan kimia yang fungsinya sebagai penarik air. Bahan kimia yang dipakai adalah alkohol, acetone, methanol, diazone, isopropanol dan butanol. Untuk dehidrasi secara manual bahan kimia yang banyak di pakai adalah alkohol dengan proses sebagai berikut: Jaringan sampel difiksasi terlebih dahulu selama 24 jam, kemudian direndam dalam alkohol 70% dan setelah 24 jam dilakukan fiksasi alkohol secara bertingkat: Alkohol 80% (2 jam) Alkohol 90% (2 jam) Alkohol 95% (2 jam)

41 Alkohol 95% (2 jam) Alkohol 100% (Semalam atau 24 jam) b. Proses Clearing Setelah 24 jam, selanjutnya dilakukan proses clearing. Jaringan dipindahkan ke alkohol 100% baru selama 1 jam. Setelah itu di pindahkan dalam: Alkohol xylol (1 : 1) selama (½ jam) Xylol I (½ jam) Xylol II (½ jam) Xylol III (½ jam) Proses ini dilakukan untuk memperkuat ikatan jaringan dengan parafin setelah pengeluaran air pada proses dehidrasi. Bagian sel yang kosong akibat proses dehidrasi dapat diisi parafin. Tetapi alkohol tidak melarutkan ataupun bersatu dengan parafin, oleh karena itu digunakan xylol yang dapat melarutkan parafin dan dapat bercampur dengan alkohol. Jadi proses clearing maksudnya mengganti tempat air yang sebelumnya sudah diisi dengan alkohol dengan xylol. Agar proses sempurna dilakukan 3 kali pemindahan. c. Proses Impregnasi Impregnasi adalah proses penggantian xylol dengan parafin. Setelah proses perendaman xylol III selama ½ jam, jaringan dipindahkan dalam xylol:parafin (1:1) selama ¾ jam (di dalam oven). Proses impregnasi dilakukan di dalam oven yang dipanaskan + 65-70 o C. Biasanya dipakai parafin dengan titik cair 56-58 o C atau 58-60 o C, dapat pula digunakan paraplast yang lebih baik dari parafin. Sebelum dilakukan clearing, parafin dicairkan lebih dahulu dalam oven 65-70 o C. d. Proses Embedding Selanjutnya dari xylol dilakukan proses embedding: Parafin (1:1) (3/4 jam) Parafin I (3/4 jam) Parafin II (3/4 jam) Parafin III (3/4 jam)

42 Pemindahan 3 kali dalam parafin dengan maksud agar xylol benar-benar telah seluruhnya diganti dengan parafin. e. Proses Blocking Sesudah sampel dikeluarkan dari parafin III lalu jaringan dicetak dalam cetakan, proses ini dinamakan proces blocking. Dalam cetakan, jaringan disusun dengan posisi bagian sayatan yang diperlukan menghadap dasar cetakan. Hal ini perlu diperhatikan, karena jika salah meletakan sampel maka sayatan yang akan di dapat tidak sesuai dengan yang diinginkan. Biarkan jaringan terikat parafin selama satu malam (24 jam), tetapi perhatikan agar di dalam block atau disekitar jaringan tidak ada udara, sehingga ikatan jaringan dalam parafin kuat. Setelah block menjadi dingin, block sampel dikeluarkan dari cetakan untuk selanjutnya siap dipotong dengan mikrotom. 2. Pemotongan Jaringan. Setelah mikrotom disesuaikan untuk ketebalan tertentu, jaringan lalu dipotong. Biasanya untuk jaringan keras, dipotong lebih tebal (+7-8 µm). Sedangkan jaringan lunak 5-6 µm (daging, hati, ginjal dan sebagainya). Pada penelitian ini sampel merupakan jaringan lunak. Pemotongan diusahakan agar sambung menyambung membentuk pitaa. Selanjutnya potongan pita diapungkan di dalam air suam kuku, agar jaringan dalam parafin terengang. Jaringan diangkat dari permukaan air menggunakan gelas objek yang bersih (sudah direndam dahulu dalam methanol). Gelas objek yang terdapat jaringan ditaruh di atas hot-plate temperature 40 o C agar agak kering. Untuk selanjutnya jaringan diwarnai. 3. Pewarnaan Jaringan (Haematoxylin Eosin). Setelah disayat, jaringan masih mengandung parafin. Agar dapat diwarnai dengan za warna yang larut dalam air, maka dilakukan proses hidrasi. Gelas objek berisi jaringan dimasukan dalam : Xylol I (3 menit) Xylol II (3 menit) Alkohol 100% I (3 menit) Alkohol 100% II (3 menit) Alkohol 95% (3 menit)

43 Alkohol 90% (3 menit) Alkohol 80% (3 menit) Alkohol 70% (3 menit) Alkohol 50% (3 menit) Dari alkohol 50% selanjutnya dicuci 2 kali Selanjutnya diwarnai dengan : -. Haematoxylin 7 menit -. Cuci dengan air 3 detik -. Eosin 3 Detik -. Cuci dengan air Setelah dicuci, kembali lakukan dehidrasi agar selanjutnya dapat direkatkan dengan gelas penutup dan zat perekat (mounting medium) dengan cara dimasukkan ke: Alkohol 50% Alkohol 70 % Alkohol 85 % Alkohol 90 % Alkohol 100 % I Alkohol 100 % II Xylol I Xylol II Kemudian gelas objek ditetesi dengan Canada balsem atau Entellan dan langsung tutup dengan gelas tutup. Biarkan semalaman agar kering dan tidak ada udara antara gelas tutup dan gelas objek. Selanjutnya jaringan dapat di amati di bawah mikroskop.

44 Lampiran 3. Penghitungan Mortality Rate (MR) pada Percobaan 1. Mortalitas % Mortalitas Perlakuan 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 V. harveyi 6 Log cfu/ml 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 V. harveyi 7 Log cfu/ml 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 V. harveyi 8 Log cfu/ml 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 13 13 13 13 13 13 13 13 13 IMNV - 0 0 0 0 0 0 0 0 0.3 0.7 1.3 2.3 2.3 3 0 0 0 0 0 0 0 0 4.2 8.3 17 29 29 38 IMNV-V. harveyi 6 Log cfu/ml 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 2 2.7 3 3 0 0 0 0 0 0 0 0 13 13 25 33 38 38 IMNV-V. harveyi 7 Log cfu/ml 0 0 0 0 0 0 0.7 1.3 2.3 2.3 2.3 3.3 3.3 3.7 0 0 0 0 0 0 8.3 17 29 29 29 42 42 46 IMNV-V. harveyi 8 Log cfu/ml 0 0 0.3 1.3 1.3 1.3 1.3 2 2 3 3.3 4 4 4.3 0 0 4.2 17 17 17 17 25 25 38 42 50 50 54 Kontrol - 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

45 Lampiran 4. Penghitungan Bakteri Vibrio di Tubuh Udang. Infeksi tunggal V. harveyi 10 7 cfu/ml Ko-infeksi IMNV dan V. harveyi 10 7 cfu/ml Control Hari Pengukuran 0 2 4 6 8 10 0 0 0 0 0 0 0 0 2000 0 200000 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 100000 300000 3000 21000 ~ ~ ~ ~ ~ 5600000 Total Vibrio (TVC) 0 0 900000 300000 800000 560000 1300000 ~ ~ 6900000 5900000 4600000 KHB 0 0 0 0 2000 200000 TVC 12000 600000 680000 1300000 6900000 5366667 % KHB 0.00 0.00 0.00 0.00 0.03 3.73 0 0 20000 40000 0 0 0 8000000 0 0 50000 70000 1570000 1030000 ~ 2820000 ~ 10500000 11000000 13400000 3000 21000 310000 190000 ~ ~ ~ 13800000 Total Vibrio (TVC) 0 0 500000 380000 1870000 1030000 ~ ~ ~ 13300000 13500000 14600000 KHB 0 45000 1300000 2820000 10500000 10800000 TVC 12000 345000 1450000 >3000000 13300000 13966667 % KHB 0.00 13.04 89.66 94.00 78.95 77.33 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3000 21000 ~ ~ ~ ~ ~ ~ Total Vibrio (TVC) 0 0 70000 40000 100000 430000 ~ ~ ~ 2300000 ~ 1200000 KHB 0 0 0 0 0 0 TVC 12000 55000 265000 >3000000 2300000 1200000 % KHB 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00

46 Lampiran 5. Perhitungan Bakteri Vibrio di Air Pemeliharaan. Infeksi tunggal V. harveyi 10 7 cfu/ml Hari Pengukuran 0 2 4 6 8 10 Ko-infeksi IMNV dan V. harveyi 10 7 cfu/ml Control 0 0 ~ ~ ~ ~ ~ ~ 0 0 1240000 980000 ~ 2470000 100000 0 680000 250000 180000 360000 Total Vibrio 0 0 ~ ~ ~ ~ ~ ~ (TVC) 50000 110000 1650000 ~ ~ ~ ~ 5300000 ~ 3100000 ~ 6300000 KHB 0 1110000 2470000 100000 465000 270000 TVC 80000 1650000 >3000000 5300000 3100000 6300000 % KHB 0 67.27 82.33 1.89 15 4.29 0 0 ~ ~ ~ ~ ~ ~ 0 0 2840000 1820000 ~ ~ ~ 10100000 ~ 6500000 ~ 8700000 Total Vibrio ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ (TVC) 50000 110000 ~ ~ ~ 3300000 ~ 17000000 ~ 14500000 ~ 16700000 KHB 0 2330000 >3000000 10100000 6500000 8700000 TVC 80000 >3000000 3300000 17000000 14500000 16700000 % KHB 0 77.67 90.91 59.41 44.83 52.10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Total Vibrio 0 0 ~ ~ ~ ~ ~ ~ (TVC) 50000 110000 ~ ~ ~ 4200000 ~ 7300000 2300000 0 ~ 9800000 KHB 0 0 0 0 0 0 TVC 80000 >3000000 4200000 7300000 2300000 9800000 % KHB 0 0 0 0 0 0

47 Lampiran 6. Hasil Analisis Uji T (MINITAB 16) Jumlah Bakteri Vibrio Hijau Berpendar dan Total Vibrio pada Perlakuan Infeksi Tunggal V. harveyi 10 7 cfu/ml dan Ko-infeksi IMNV dengan V. harveyi 10 7 cfu/ml (pengambilan sampel di 10 dpi). 1. Analisis uji T (MINITAB 16) jumlah bakteri Vibrio hijau berpendar. Two-sample T for Ko-infeksi vs Infeksi Tunggal N Mean StDev SE Mean Ko-infeksi 3 10800000 2705550 1562050 Infeksi Tunggal 3 200000 100000 57735 Difference = mu (Ko-infeksi) - mu (Infeksi Tunggal) Estimate for difference: 10600000 95% CI for difference: (3874452, 17325548) T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = 6.78 P-Value = 0.021 DF = 2 2. Analisis uji T (MINITAB 16) jumlah total Vibrio. Two-sample T for Ko-infeksi vs Infeksi Tunggal N Mean StDev SE Mean Ko-infeksi 3 13966667 568624 328295 Infeksi Tunggal 3 5366667 680686 392994 Difference = mu (Ko-infeksi) - mu (Infeksi Tunggal) Estimate for difference: 8600000 99% CI for difference: (5609008, 11590992) T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = 16.79 P-Value = 0.000 DF = 3

48 Lampiran 7. Bobot Udang Uji (gram) pada Percobaan 1. 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2.2 3.2 2.4 2.4 2.7 2.6 2.9 3.1 2 2.4 2.7 2 2.3 2.8 3.1 3.3 2.3 3 2.9 3 3.3 2.4 2.5 2.9 2.6 2.8 4 3 2.1 2.8 2.3 3.1 3.2 2.4 2.3 5 2.7 2.4 3.4 2.3 3.2 3.4 2.7 2.4 6 3 3.2 2.9 2.1 2.3 2.7 2.4 2.6 7 2.1 2.1 2.8 2.5 2.3 2.6 2.1 2.9 8 2.5 2.6 2.6 2.9 3.3 2.6 3.1 3.3 9 2.9 2.4 2.8 2.2 3.5 3.5 2.6 3.2 10 3.1 2.5 2.3 2.9 2.3 2.1 2.5 3.2 11 3.6 2.5 2.3 2.8 2.4 2.1 3.6 2.6 12 2.7 2.1 2.9 2.8 2.8 3.6 3.2 2.5 13 2.4 2.3 2.2 3.4 2.5 3 3.4 2.8 14 2.7 2.7 2.9 2.1 2.9 2.3 2.6 2.9 15 2.4 2.9 2.5 2.8 3.1 2.3 2.3 2.8 16 2.1 2.8 2.3 2.5 2.9 2.9 3.1 2.1 17 2.3 2.2 3.4 2.8 2.5 2.6 3.6 2.9 18 2.3 3.5 3.5 3 3.2 2.5 2.9 3.2 19 2.2 2.8 2.3 3.3 2.4 2.4 2.9 2.6 20 2.4 3.3 2.8 2.4 3.1 2.4 2.7 2.9 21 2.3 2.6 2.5 2.8 2.3 3.4 3.1 2.5 22 2.6 2.3 2.6 3.2 2.4 3 2.5 2.4 23 3.3 2.4 2.6 2.1 2.9 2.2 2.4 2.3 24 3.1 2.8 2.6 2.9 2.6 2.4 2.8 3.3 W total = 519.9 gram Jumlah = 192 udang = 2.708 gram/udang STDEV = 0.395 gram

49 Lampiran 8. Bobot Udang Uji (gram) pada Percobaan 2. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 3.4 2.9 2.6 2.9 2.5 2.5 3.2 2.9 3 3.4 2.7 3.4 2 2.8 3.1 3.4 2.8 3 2.4 3.5 2.9 2.9 2.5 3.2 3.2 3 3 2.7 3.4 2.6 3 2.9 2.6 2.6 2.7 2.6 3.2 2.9 4 3.5 2.6 3.2 3.4 3.1 3 3.2 2.8 2.7 2.8 2.9 2.6 5 2.5 2.5 2.7 3.2 3.2 2.9 2.8 3.5 3.2 2.9 2.8 3 6 2.8 2.8 3.5 2.6 2.5 2.8 2.5 3.3 3.2 3 3 2.8 7 2.6 2.9 2.8 2.5 2.3 3.4 3.2 2.8 3 2.6 2.6 2.8 8 2.7 2.5 2.4 3.1 2.9 2.5 2.6 2.6 2.6 2.6 2.7 3.5 9 3.4 2.9 2.6 2.5 3 3.4 3.2 2.9 2.6 2.8 2.8 3 10 3.3 2.7 2.4 3.1 2.5 3.3 3 2.7 2.5 3.4 2.9 3.5 11 3.4 2.6 2.4 2.9 2.5 3.3 2.5 3.6 3.1 2.9 2.8 2.8 12 2.4 3 2.8 3.1 3.2 2.9 3.2 2.6 3 3.1 2.5 3.3 13 3.2 2.5 3.2 2.9 2.8 3 2.7 2.9 2.6 3.2 3.3 3.4 14 3 3.5 3.1 2.6 2.4 2.8 3.2 3.1 2.8 2.9 2.6 2.7 15 2.8 3 2.7 2.9 2.6 3.4 2.8 2.6 3.3 3.4 3.4 2.9 W total = 523.8 gram Jumlah = 180 udang = 2.91 gram/udang STDEV = 0.312 gram