10 III. BAHAN DAN METODE 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian dilaksanakan dari bulan Oktober 2011 sampai Oktober 2012. Sampel gubal dan daun gaharu diambil di Desa Pulo Aro, Kecamatan Tabir Ulu, Kabupaten Merangin, Provinsi Jambi. Analisis biologi dan kimia dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Tanah serta Laboratorium Kimia dan Kesuburan Tanah, Departemen Ilmu Tanah dan Sumberdaya Lahan, Institut Pertanian Bogor. Untuk uji lapang, dilaksanakan di Rantau Rasau, Kabupaten Tanjung Jabung Timur, Provinsi Jambi. 3.2 Alat dan Bahan Alat yang digunakan dalam penelitian di antaranya: autoclaf, laminar air flow, cawan petri, labu erlenmayer, pipet, tabung reaksi, jarum ose, bunsen, timbangan digital, tisu, alat tulis, AAS, dan Spectrofotometer UV-VIS. Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sampel daun dari A. malaccensis yang akan digunakan untuk menentukan status hara tanaman dan sampel gaharu yang diambil dari Pulo Aro, Kabupaten Merangin, Provinsi Jambi. Media yang digunakan untuk isolasi dan pemurnian fungi adalah PDA (Potato Dextrose Agar), dan TSA (Tryptic Soy Agar) untuk isolasi dan pemurnian bakteri. Untuk uji fisiologis mikrob menggunakan tiga jenis media, yaitu CMC (Carboxymethyl Cellulose) untuk uji pelarutan selulosa, media Citric Pectin 0.5% untuk uji pelarutan pektin oleh fungi, dan media Pectinolytic Bacteri untuk uji pelarutan pektin oleh bakteri. 3.3 Pelaksanaan Penelitian 1. Pengambilan Sampel 1.1 Pengambilan Sampel Gaharu Contoh Gaharu diambil dari pohon A. malaccensis yang sudah menghasilkan gaharu. Sampel diambil menggunakan pisau steril. Sampel disterilisasi dengan alkohol 70% untuk menghindari kontaminan yang berasal dari udara ataupun alat yang kurang steril saat pengambilan sampel. Setelah dibersihkan, sampel disimpan dalam plastik dan dimasukkan ke ice box sebelum
11 diisolasi. Hal ini dilakukan agar mikrob yang akan diteliti berada pada kondisi dorman sehingga tidak mendapat gangguan dengan perubahan lingkungan di sekitarnya. 1.2 Pengambilan Sampel Daun Pengambilan sampel daun dilakukan untuk mengetahui status hara pada tanaman. Contoh daun diambil dari tiga tingkat tajuk (tajuk bagian bawah, tengah, dan atas) yang menghadap barat dan timur. Pengambilan sampel daun dilakukan hanya pada tajuk yang menghadap barat dan timur dikarenakan area ini mendapatkan penyinaran yang intensif, sehingga bisa berfotosintesis dengan maksimal. Sampel daun yang diambil dari setiap lokasi dimasukkan ke dalam amplop kertas. Amplop kertas digunakan karena kertas ini bisa menyerap air, sehingga daun tidak busuk sebelum dianalisis. 2. Analisis Kimia Analisis kimia yang dilakukan berupa analisis hara tanaman melalui daun. Analisis hara dilakukan karena kandungan hara dalam tanaman dapat mempengaruhi kesehatan dan daya tahan tanaman terhadap infeksi mikrob. Adapun hara tanaman yang dianalisis adalah: N, P, K, Ca, Mg, Mn, Cu, Zn, dan Fe. Analisis kandungan Nitrogen pada jaringan daun dilakukan dengan menggunakan metode semi mikro Kjeldal, sedangkan delapan unsur hara yang lain dianalisis menggunakan metode pengabuan basah. Analisis nitrogen menggunakan bagian daun dengan bobot 0,5 gram ditambah 5 ml H 2 SO 4 dan H 2 O 2, kemudian didestruksi selama 1.5 jam. Sampel yang telah didestruksi selama 1.5 jam didinginkan sampai uapnya hilang dan ditambahkan H 2 O 2 1 ml kemudian didestruksi lagi selama 30 menit. Warna hasil ekstraksi yang semula berwarna kuning sampai hitam menjadi bening atau putih susu. Ekstrak tanaman hasil destruksi diambil 20 ml untuk didestilasi dengan 20 ml NaOH 50% dan 100 ml aquades. Uap (cairan) ditampung dengan 10 ml H 3 BO 3 4% dan indikator, destilat yang dihasilkan dititrasi dengan HCl 0,0995 N untuk menetapkan kandungan (%) nitrogen.
12 Hasil destruksi daun akan digunakan untuk menentukan status hara tanaman. kandungan fosfor (P) diukur dengan Spectrofotometer UV-VIS pada panjang gelombang 660 nm, kandungan Ca, Mg, Mn, Cu, Zn, dan Fe diukur dengan AAS, sedangkan kandungan kalium (K) diukur dengan Flamefotometer. 3. Analisis Biologi Analisis biologi dilakukan untuk mengetahui ada tidaknya peran mikrob dan efektivitasnya terhadap pembentukan gaharu pada A. malaccensis. Tahapan dari analisis biologi adalah: 3.1 Isolasi Mikrob Mikrob yang diisolasi dari pohon A. malaccensis adalah fungi dan bakteri. Isolasi dilakukan di laboratorium Bioteknologi Tanah Institut Pertanian Bogor. Isolasi dilakukan dengan menggunakan media PDA untuk isolasi fungi dan TSA 5% untuk isolasi bakteri. Isolasi fungi dan bakteri dilakukan dengan metode agar tuang. Langkah awal metode dilakukan dengan menimbang 10 gram sampel, memasukkan sampel ke dalam erlenmeyer berisi 90 ml larutan fisiologis. Sampel yang sudah direndam kemudian dikocok dengan kecepatan 150 rpm. Suspensi yang telah dikocok diambil 1 ml menggunakan pipet dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 9 ml larutan fisiologis, sehingga didapat suspensi dengan seri pengenceran 10-2. Langkah yang sama dilakukan untuk membuat seri pengenceran 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, dan 10-9. Dari setiap seri pengenceran diambil 1 ml suspensi dan ditumbuhkan pada medium. Isolasi fungi dilakukan pada pengenceran 10-2 sampai 10-5, sedangkan bakteri di isolasi dari pengenceran 10-7 sampai 10-9. 3.2 Pemurnian Pemurnian dilakukan untuk mendapatkan biakan murni yang diinginkan tanpa ada kontaminan dari mikrob lain. Pemurnian dilakukan dengan memindahkan mikrob hasil isolasi dari media tumbuh awal ke media biakan yang baru. Koloni fungi dan bakteri dengan penampakan berbeda dipindahkan ke petri terpisah. Pemindahan mikrob dilakukan dengan menggunakan jarum ose yang sebelumnya dipanaskan pada api bunsen. Pada bakteri, pemurnian dilakukan
13 dengan metode gores, sedangkan pada fungi dilakukan dengan metode titik. Hal ini dilakukan karena miselium fungi akan hancur jika sama-sama menggunakan metode gores. 3.3 Uji Fisiologis Mikrob yang sudah murni dilakukan pengujian fisiologis berupa uji pelarutan selulosa dan pektin. Hal ini dilakukan untuk mengetahui efektivitas mikrob dalam melarutkan selulosa dan pektin. Untuk uji selulosa digunakan media CMC, sementara pengujian pektin menggunakan media Citric pectin 0.5% untuk fungi dan Pectinolytic Bacteri untuk bakteri. Pada dasarnya uji pelarutan selulosa dan pektin sama, hanya medianya saja yang membedakan. Uji pelarutan selulosa dan pektin dilakukan dengan menumbuhkan mikrob pada media selektif dan diinkubasi selama 3 hari pada suhu ruangan. Mikrob yang telah diinkubasi dilakukan pewarnaan dengan menggunakan Congo red untuk uji pelarutan selulosa dan Kalium iodine untuk pelarutan pektin. Pembentukan zona bening di sekitar biakan merupakan indikasi bahwa mikrob tersebut bisa melarutkan selulosa dan pektin. Indeks selulolitik dan pektinolitik dihitung dengan rumus: 3.4 Seleksi Isolat Seleksi isolat dilakukan untuk mendapatkan isolat terbaik dan efektif untuk merangsang pembentukan gaharu. Isolat diseleksi berdasarkan indeks pelarutan selulosa dan pektin. Isolat yang dipilih adalah isolat yang mempunyai indeks pelarutan tinggi.
14 4. Pengujian Lapang Pengujian lapang dilakukan untuk mengetahui efektivitas mikrob yang telah diisolasi dalam menghasilkan gaharu pada A. malaccensis. Pengujian lapang dilakukan dengan tiga tahapan, yaitu: 1. Pembuatan inokulan Isolat yang terseleksi dibuat inokulan cair dengan cara menumbuhkan isolat tersebut pada media Nutrient Broth. 2. Inokulasi Inokulan yang telah dibuat diinokulasikan pada pohon A. malaccensis di Rantau Rasau, Kabupaten Tanjung Jabung Timur, Provinsi Jambi. Inokulasi dilakukan dengan cara menginjeksikan inokulan pada pohon yang telah dibor. Pengeboran dilakukan dengan posisi miring ke bawah dengan pola berbentuk spiral mengelilingi batang. Gambar 1. Pola Spiral Inokulasi Pohon Gaharu* Dalam satu pohon terdapat lima lubang injeksi. Setiap isolat diberikan ulangan sebanyak tiga pohon, jadi total setiap isolat terdapat 15 titik pengamatan. Setiap lubang di injeksi inokulan sebanyak 1 2 ml, kemudian ditutup dengan kapas. *sumber: http://kayugaru.files.wordpress.com/2009/06/3.jpg
15 3. Pengamatan hasil inokulasi Pengamatan dilakukan dengan cara melihat ada tidaknya perubahan warna kayu di sekitar lubang inokulasi. Inokulasi dinyatakan berhasil apabila pada titik lubang bor terdapat tanda terjadinya perubahan warna kayu menjadi coklat hingga hitam dan tergambar dengan tanda laju infeksi patogen serta pengerasan kayu yang telah berisikan resin gaharu.
16 Pengambilan sampel gaharu dan daun Analisis kimia: analisis kandungan hara tanaman Analisis Biologi: Isolasi bakteri dan fungi Uji pelarutan Selulosa dan Pektin Seleksi mikrob berdasarkan indeks pelarutan Pembuatan inokulan cair dari isolat terpilih Inokulasi isolat terpilih Pengamatan hasil inokulasi Gambar 2. Bagan Alir Metodologi Penelitian