BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis dan Desain Penelitian Jenis penelitian yang dilakukan peneliti merupakan penelitian eskperimental laboratorik dengan rancangan pre test and post test with control group design yang menggunakan hewan uji sebagai subjek penelitian. B. Populasi dan Sampel Subjek penelitian adalah tikus putih (Rattus novergicus) jantan galur Wistar yang diperoleh dari Laboratorium Pusat Studi Pangan dan Gizi Universitas Gadjah Mada. Sampel penelitian ini adalah tikus putih (Rattus novergicus) jantan galur Wistar yang memenuhi kriteria penelitian sebagai berikut: Kriteria inklusi: 1. Tikus putih (Rattus novergicus) jantan galur Wistar 2. Umur 2 bulan 3. Berat ± 200 gram 4. Sehat, dilihat dari aktivitas geraknya Kriteria eksklusi: 1. Terdapat abnormalitas anatomi yang nampak 2. Tikus tampak sakit, tidak bergerak secara aktif Besar sampel tiap kelompok dihitung dengan rumus Federer, dimana (t) merupakan jumlah ulangan untuk tiap perlakuan dan (n) adalah jumlah perlakuan. 23
24 Rumus yang digunakan adalah sebagai berikut : (n-1) (t-1) 15 (Federer) Sehingga dalam percobaan ini jumlah sampel minimal yang dibutuhkan perkelompok adalah sebagai berikut: (n-1) (5-1) 15 ; t=5 (n-1) (4) 15 4n 4 15 4n 19 n 4,75; (n = 5) Jumlah sampel yang digunakan peneliti minimal 5 ekor tikus putih per kelompok. Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebanyak 25 ekor tikus putih (Rattus novergicus) yang terbagi dalam 5 kelompok, yaitu: 1. Kelompok kontrol negatif (P1): diberi air dan makanan (pakan) biasa tanpa pemberian induksi asap rokok dan ekstrak kulit jeruk manis (Citrus sinensis). 2. Kelompok kontrol positif (P2): diinduksi asap rokok dan tetap mendapatkan air dan makanan biasa selama 14 hari. 3. Kelompok perlakuan 1 (P3): diinduksi asap rokok, diberi ekstrak kulit jeruk manis (Citrus sinensis) sekali sehari selama 14 hari dengan dosis 37,5 mg/kgbb dan tetap mendapatkan air dan makanan biasa selama 14 hari.
25 4. Kelompok perlakuan 2 (P4): diinduksi asap rokok, diberi ekstrak kulit jeruk manis (Citrus sinensis) sekali sehari selama 14 hari dengan dosis 75 mg/kgbb dan tetap mendapatkan air dan makanan biasa selama 14 hari. 5. Kelompok perlakuan 3 (P5): diinduksi asap rokok, diberi ekstrak kulit jeruk manis (Citrus sinensis) sekali sehari selama 14 hari dengan dosis 112,5 mg/kgbb dan tetap mendapatkan air dan makanan biasa selama 14 hari. C. Variabel dan Definisi Operasional 1. Variabel a. Variabel bebas: ekstrak kulit jeruk manis (Citrus sinensis) b. Variabel tergantung: kadar SGOT dan SGPT pada tikus putih (Rattus novergicus) jantan galur Wistar. c. Variabel terkendali: Ras tikus, jenis kelamin tikus, umur, berat badan tikus, makanan tikus, kandang tikus, induksi asap rokok 2. Definisi Operasional a. Ekstrak kulit jeruk manis (Citrus sinensis) Pembuatan ekstrak kulit jeruk manis (Citrus sinensis) dilakukan di Laboratorium Pusat Studi Pangan dan Gizi Universitas Gadjah Mada dengan metode maserasi dilanjutkan dengan metode rotary evaporator. Buah diperoleh dari supermarket Superindo.
26 b. Kadar SGOT dan SGPT Penelitian ini mengukur kadar SGOT dan SGPT dengan satuan U/L pada darah tikus (Rattus novergicus)dengan menggunakan metode Optimized UV- Test according to IFCC (International Federation Of Clinical Chemistry). c. Paparan asap rokok Asap rokok berasal dari rokok kretek arus samping yang diinduksi dengan dosis 2 batang dalam sehari selama 14 hari. Setiap kelompok terdiri dari 5 tikus dalam kandang pengasapan yang sama. Tikus diberi paparan asap rokok dengan cara dimasukkan kedalam kandang pengasapan. Bagian bawah kandang diberi lubang untuk pengasapan dan bagian atas kandang ditutup namun juga diberi lubang atau ventilasi supaya asap dapat keluar. Pengasapan dilakukan hingga 2 batang rokok habis terbakar. d. Instrumen Penelitian 1) Alat penelitian Kandang hewan percobaan, kandang pengasapan, bekker glass, rotary evaporator, blender, timbangan digital, pipet sonde, micro hematokrit, eppendorf, sentrifuge, micro pipet, vortex, spektrofotometer, stopwatch. 2) Bahan penelitian Ekstrak kulit jeruk manis (Citrus sinensis), pakan tikus, akuades, etanol 70% dan larutan reagen KIT DIASYS yang berupa:
27 a) Pemeriksaan SGOT: Reagen I terdiri dari Tris 80mmol/L dengan ph7,8, L-aspartate 240mmol/L, MDH 600 U/L dan Reagen II terdiri dari 2 oxoglutarate 12 mmol/l dan NADH 0,18 mmol/l. b) Pemeriksaan SGPT: Reagen I terdiri dari Tris 100mmol/L dengan ph 7,5, L alanine 500 mmol/l, LDH 1200 U/L dan Reagen II terdiri dari 2 oxoglutarate 15 mmol/l, NADH 0,18 mmol/l. D. Cara pengumpulan data 1. Persiapan Kandang tikus individu disiapkan dengan tempat pakan dan minum. Tikus putih (Rattus novergicus) sebanyak 25 ekor dilakukan pengukuran awal kadar SGOT dan SGPT dengan cara mengambil darah tikus putih (Rattus novergicus) sebanyak 1 ml melalui sinus orbitalis. Sampel darah dimasukkan ke dalam eppendorf, kemudian sampel di sentrifuge dengan kecepatan 4000rpm selama 10 menit untuk mendapatkan plasma. Pemeriksaan kadar SGOT dan SGPT dilakukan dengan cara sebagai berikut: a. 200µL plasma dicampurkan dengan monoreagent 1000µL dari KIT DIASYS. b. Letakkan pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 334nm dan dilakukan pada suhu 30 o C.
28 c. Segera lakukan penghitungan waktu dengan menggunakan stopwatch. d. Pembacaan absorbansi dilakukan setelah 1 menit, 2 menit dan 3 menit. e. Pembacaan dilakukan dengan Multiply A/menit dengan koreksi suhu 971. f. Subjek penelitian dibagi menjadi menjadi lima kelompok dengan randomisasi. Masing masing kelompok terdiri dari lima ekor tikus putih (Rattus novergicus). Kelompok penelitian terdiri dari kelompok P1, kelompok P2 yang hanya diberi akuades serta pakan biasa dan kelompok P3, P4 dan P5 yang diberi ekstrak kulit jeruk (Citrus sinensis) dosis I,II, dan III. g. Pembuatan ekstrak kulit jeruk (Citrus sinensis) dilakukan di Gedung Laboratorium Pusat Studi Pangan dan Gizi Universitas Gadjah Mada. Pertama dilakukan pembuatan simplisia. Jeruk dicuci dengan menggunakan air. Setelah dicuci, jeruk dikupas dan diambil bagian kulit jeruknya, kemudian dikeringkan dengan suhu 40 o C hingga kering. Kulit jeruk yang sudah dikeringkan kemudian di blender sampai menjadi serbuk / simplisia. Simplisia sebanyak 100 gram dicampur dengan pelarut berupa etanol 70% sebanyak 800 ml dan dilakukan maserasi selama 48 jam sambil sesekali diaduk. Setelah itu di saring hingga di dapatkan 2 hasil yaitu berupa ampas serta maserat, hasil maserasi atau maserat tersebut dimasukkan ke rotary evaporator dan akan menjadi ekstrak kental.
29 Tikus putih (Rattus novergicus) sebanyak 25 ekor kemudian diaklimatisasi selama 3 hari dan diberi makan pelet serta air secara ad libitum dan pada hari ke-3 dilakukan pre test kadar SGOT dan SGPT. Hari ke-4 dilakukan induksi asap rokok selama 14 hari kepada 20 ekor tikus putih (Rattus novergicus) serta diberikan ekstrak kulit jeruk (Citrus sinensis) pada kelompok P3, P4 dan P5 sesuai dosis masing masing kelompok. Sedangkan 5 ekor tikus putih (Rattus novergicus) dalam kelompok P1 dibiarkan tanpa pemberian induksi asap rokok dan 5 ekor tikus putih (Rattus novergicus) pada kelompok P2 hanya diberikan induksi asap rokok tanpa pemberian ekstrak kulit jeruk (Citrus sinensis). Pemberian perlakuan yang berbeda bagi masing-masing kelompok: 1) Kelompok 1: kelompok P1 Hari ke-4 sampai hari ke-17 diberi pakan pelet dan air secara ad libitum. 2) Kelompok 2: kelompok P2 Hari ke-4 sampai hari ke-17 diberi pakan pelet dan akuades secara ad libitum kemudian diinduksi asap rokok tanpa pemberian ekstrak kulit jeruk (Citrus sinensis). 3) Kelompok 3: kelompok P3 Hari ke-4 sampai hari ke-17 diberi pakan pelet dan akuades secara ad libitum kemudian diinduksi asap rokok. Setelah diinduksi asap
30 rokok kemudian diberi ekstrak kulit jeruk (Citrus sinensis) dosis I sebanyak 1 ml diberikan dengan sonde lambung. 4) Kelompok 4: kelompok P4 Hari ke-4 sampai hari ke-17 diberi pakan pelet dan akuades secara ad libitum kemudian diinduksi asap rokok. Setelah diinduksi asap rokok kemudian diberi ekstrak kulit jeruk (Citrus sinensis) dosis II sebanyak 1 ml diberikan dengan sonde lambung. 5) Kelompok 5: kelompok P5 Hari ke-4 sampai hari ke-18 diberi pakan pelet dan akuades secara ad libitum kemudian diinduksi asap rokok. Setelah diinduksi asap rokok kemudian diberi ekstrak kulit jeruk (Citrus sinensis) dosis III sebanyak 1 ml diberikan dengan sonde lambung. 6) Sesudah perlakuan Sesudah perlakuan, pada hari ke-15 semua tikus putih (Rattus novergicus) di setiap kelompok di uji kembali kadar SGOT dan SGPT dengan cara diambil darahnya sebanyak 1 ml melalui sinus orbitalis.
31 E. Bagan Penelitian 25 ekor tikus putih (Rattus novergicus) Aklimatisasi pakan standar selama 3 hari Randomisasi kemudian dilakukan pre test 5 ekor kelompok P1 5 ekor kelompok P2 5 ekor kelompok P3 5 ekor kelompok P4 5 ekor kelompok P5 Pakan pelet ad libitum + akuades Pakan pelet ad libitum+akua des + paparan asap rokok Pakan pelet ad libitum + 37,5 mg/kgbb ekstrak kulit jeruk (Citrus sinensis)+ paparan asap rokok Pakan pelet ad libitum + 75 mg/kgbb ekstrak kulit jeruk (Citrus sinensis) + paparan asap rokok 14 hari Pakan pelet ad libitum + 112,5 mg/kgbb ekstrak kulit jeruk (Citrus sinensis) + paparan asap rokok Hari ke-15 dilakukan pemeriksaan kadar SGOT dan SGPT post test Analisis data Gambar 8. Bagan Penelitian
32 F. Analisis Data Pengolahan statistik dari data hasil penelitian kadar SGOT dan SGPT plasma dimulai dengan uji normalitas dan uji homogenitas data. Dilakukan uji statistik dengan paired t test (untuk data yang berdistribusi normal) atau dengan uji Wilcoxon test (jika data tidak berdistribusi normal), untuk mengetahui perbedaan kadar SGOT dan SGPT plasma pada kelompok sebelum dan sesudah perlakuan pada tikus putih. Dilakukan uji one way anova (jika data berdistribusi normal) atau Kruskal-Wallis (jika data tidak berdistribusi normal). Sampel yang digunakan dalam penelitian ini berjumlah 25 sehingga uji normalitas yang digunakan adalah uji Shapiro-Wilk. Uji homogenitas digunakan untuk mengetahui apakah varian populasi homogen atau tidak. Jika hasil uji ANOVA menunjukkan nilai yang signifikan maka dilanjutkan dengan uji Post Hoc Test. Uji ANOVA adalah uji untuk membandingkan perbedaan rerata lebih dari dua kelompok, sedangkan Post Hoc Test membandingkan antar kelompok. G. Kesulitan Penelitian Peneliti menjumpai kesulitan dalam penelitian kali ini. Mencari tempat penelitian yang menyediakan alat yang lengkap untuk melakukan penelitian adalah salah satu kesulitan yang dijumpai, karena penelitian ini membutuhkan alat untuk membuat ekstrak kulit jeruk manis serta kandang yang tepat untuk melakukan pemeliharaan terhadap hewan uji.