Jenis Penelitian ini adalah penelitian eksperimental dengan pendekatan Pretest Posttest with Control Group Design menggunakan hewan.

Transkripsi

1 BAB III. METODE PENELITIAN 3.1. Jenis dan Rancangan Penelitian Jenis Penelitian ini adalah penelitian eksperimental dengan pendekatan Pretest Posttest with Control Group Design menggunakan hewan Waktu dan Tempat Penelitian Waktu penelitian Penelitian ini dilakukan selama 41 hari, dengan rincian 7 hari aklimitasi, 5 hari induksi, 28 hari perlakuan dan satu hari digunakan untuk penghitungan terakhir kadar LDL dan HDL Tempat penelitian Penelitian dilakukan di laboratorium Pusat Studi Pangan dan Gizi (PAU) Universitas Gadjah Mada Populasi dan Subyek Penelitian Dalam penelitian ini terdapat empat kelompok tikus yaitu: a. K1 (kontrol normal) adalah tikus tanpa induksi DM yang diberi plasebo CMC 0,5% per oral. b. K2 (kontrol negatif) adalah tikus Dislipidemia DM yang diberi plasebo CMC 0,5% per oral. c. K3 adalah tikus Dislipidemia DM yang diberi glibenklamid 0,18mg/200g BB/ tikus per oral. d. K4 adalah tikus Dislipidemia DM yang diberi kombinasi jus Aloe vera 3,6 ml/200 g BB/tikus dan glibenklamid 0,18 mg/200 g BB/tikus per oral. Kriteria Inklusi 1. Tikus Putih galur wistar jantan 2. Berat badan tikus antara g 3. Usia tikus sekitar 2-3 bulan 30

2 4. Tikus sehat dan telah melewati aklitimasi selama tujuh hari 5. Dislipidemia kadar LDL > 27,7 mg/dl Herwiyarirasanta (2010) dan kadar HDL < 35 mg/dl (Schaerfer et al. dalam Hartoyo et al, 2008). 6. Diabetes Kadar GDP > 150 mg/dl Kriteria Eksklusi 1. Berat badan tikus kurang dari 180g atau lebih dari 250 g setelah aklitimasi 2. Tikus sakit atau mati saat aklitimasi Menurut WHO jumlah minimal sampel yang dibutuhkan setiap kelompok perlakuan adalah lima ekor, sehingga dibutuhkan 20 ekor tikus dalam penelitian ini. Hewan yang digunakan dalam penelitian ini adalah tikus putih jantan dewasa galur wistar (Rattus novergicus) dengan umur sekitar 2-3 bulan dan berat badan gram. Subyek diperoleh dari laboratorium Pusat Studi Pangan dan Gizi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta Variabel Penelitian Variabel Bebas Variabel bebas dari penelitian ini adalah jus Lidah buaya dan glibenklamid, dengan dosis yang diberikan adalah sebanyak 3,6 ml/200g BB tikus untuk jus lidah buaya dan 0,18 mg/200g BB tikus Glibenklamid setiap harinya, dosis tersebut didapatkan berdasarkan konversi Laurence Bacharach (Hapsari, 2014) Variabel Tergantung Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah kadar LDL dan HDL yang diukur pada pre-induksi, post-induksi, dan post-perlakuan Variabel Pengaruh Terkendali a. Variabel Subyek Tikus putih galur wistar dengan jenis kelamin jantan berusia dewasa 2-3 bulan dan berat badannya gram. 31

3 b. Variabel Perawatan Seluruh subyek diberikan pakan dengan jenis,jumlah, dan cara yang sama setiap harinya yaitu pakan dan minum secara ad libitum. c. Variabel Bahan coba Pemberian Jus lidah buaya dan Glibenklamid, diberikan dengan jumlah dosis dan cara yang sama pada setiap tikusnya yaitu dengan sonde oral Definisi operasional a. Jus Aloe vera adalah bagian gel Aloe vera yang telah dikupas dan dihilangkan eksudatnya setelah itu diblender sampai halus. b. Sonde oral adalah cara memasukan obat atau Aloe vera dengan menengadahkan kepala tikus dan membuka mulutnya kemudian memasukan jarum sampai esofagus dan cairan obat dimasukan. c. Glibenklamid adalah obat sintetis dalam bentuk farmagrid serbuk d. LDL adalah kadar profil plasma darah yang diukur secara spektrofotometri dan akan diperiksa pada pre-induksi, post-induksi, dan post-perlakuan. e. HDL adalah kadar profil plasma darah yang diukur secara spektrofotometri dan akan diperiksa pada pre-induksi, post-induksi, dan post-perlakuan. f. Diabetes Melitus adalah kenaikan kadar glukosa jika dilakukan pemeriksaan kadar kadar glukosa darah puasa (>150 mg/dl). g. Model tikus dislipidemia diabetes adalah tikus dalam keadaan diabetes melitus tipe 2 dengan karakteristik peningkatan kadar Lipid (kadar LDL < 7-27,7 mg/dl serta kadar HDL < mg/dl) dan peningkatan glukosa darah (> 150 mg/dl) dan yang diinduksi dengan streptozotosin dan nikotinamid. h. Pre-Induksi adalah adalah pengambilan dan pemeriksaan kadar HDL dan LDL setelah aklimatisasi selama 7 hari. 32

4 i. Post-Induksi adalah pengambilan dan pemeriksaan kadar HDL dan LDL setelah lima hari diinduksi streptozotosin dan nikotinamid sebelum diberikan perlakuan. j. Post-Perlakuan adalah pengambilan dan pemeriksaan HDL dan LDL pada akhir perlakuan. k. K1 adalah kelompok kontrol normal hanya menerima pakan dan minum adlibitum tanpa diinduksi streptozotosin dan nikotinamid. l. K2, K3, K4 dan adalah kelompok diabetes yang diinduksi Streptozotosin dan Nikotinamid Instrumen Penelitian Alat a. Timbangan elektrik dan mistar dengan merk shimizu buatan China. b. Sonde oral c. Kandang tikus yang didapat dari lab. PAU d. Blender dengan merk Linux buatan China. e. Spuit injeksi f. Alat pengukur glukosa, HDL dan LDL yaitu spektrofotometer. g. Lemari pengering h. Air akuades Bahan a. Jus Aloe vera sebesar 3,6 ml/200g bb/tikus b. Akuades c. Glibenklamid dalam bentuk farmagrid serbuk yang di dapatkan dari PT IFARS d. Tikus putih (Rattus novergicus) strain wistar yang didapatkan di laboratorium Pusat Studi Pangan dan Gizi UGM. e. Pakan standar (Br2) merk Comfeed AD II yang diproduksi oleh PT. Japfa Comfeed Indonesia, Tbk. Dengan No

5 3.7. Tahap Penelitian Penyiapan Bahan Uji a. Determinasi tanaman Determinasi tanaman Aloe vera dilakukan di Laboratorium Sistematika Tumbuhan Fakultas Biologi UGM. Berdasarkan hasil determinasi tersebut, jenis Aloe vera yang digunakan untuk penelitian ini adalah Familia Liliaceae, Genus Aloe, Spesies Aloe vera (L.) Webb. b. Pembuatan jus Aloe vera Bahan yang digunakan untuk pembuatan jus adalah bagian dari gel Aloe vera jenis Aloe vera (L.) Webb.. Aloe vera yang dipilih adalah memiliki berat 0,90-1,5 kg, kemiringannya o terhadap permukaan tanah, panjangnya 50 sampai 65 cm, lebar 7-10 cm dan tebal 18,5-25,0 mm. Daun yang diambil yaitu daun yang letaknya paling bawah (Tavip, 2010). Untuk pembuatan jus Aloe vera dimulai dari pencucian Aloe vera dengan air bersih kemudian kulitnya dikupas, setelah itu dicuci dengan air hangat kuku untuk menghilangkan eksudat karena terasa pahit dan langkah selanjutnya diblender sampai halus dan disaring. Jumlah jus lidah buaya yang diberikan pada manusia adalah 200ml/hari, kemudian berdasarkan konversi Laurence Bacharach yaitu setiap 200 gr BB tikus setara dengan 0,018 x dosis manusia maka dosis pada tikus adalah 0,018 x 200 = 3,6 ml/200grbb/hari (Hapsari, 2014). c. Pembuatan suspensi glibenklamid Dosis glibenklamid yang dapat diberikan untuk tikus agar efektif menurunkan kadar glukosa darah adalah 10 mg (Rambiritch et al., 2014), selain itu uji pendahuluan yang telah dilakukan bahwa dosis 10 mg tidak menyebabkan tikus menjadi hipoglikemik dan kadar kolesterolnya mendekati normal. Untuk itu di gunakan dosis 10 mg yang dikonversikan dengan konversi Laurence Bacharach, yaitu setiap 200g Bb tikus setara dengan 0,018 x Dosis 34

6 obat sehingga di dapatkan jumlah dosis 0,018 x 10 = 0,18 mg/ 200 g Bb tikus (Triwidyana,2011). Glibenklamid dilarutkan dengan menggunakan agen pensuspensi Carboxyl Methyl Celulose (CMC) 0,5% (Pasaribu, 2012). d. Pembuatan larutan streptozotosin dan nikotinamid Berdasarkan penelitian dosis nikotinamid dan streptozotosin untuk menginduksi tikus diabetes tipe 2 adalah nikotinamid 230 mg/kg yang dilarutkan dengan larutan PBS (Phosphat Buffeerd Saline) dan streptozotosin dengan dosis 65 mg/kg dilarutkan dengan buffer sitrat dengan ph 4,5 secara intraperitoneal (i.p.) (Szkudelski, 2012). b. Penyiapan hewan uji Pada penelitian ini dibutuhkan tikus putih jantan (Rattus novergicus) strain wistar sebanyak 20 tikus, dengan berat badan antara gram. Sebelum dilakukan penelitian, tikus di aklimatisasi atau diadaptasi terlebih dahulu selama 7 hari agar menyesuaikan diri dengan lingkungan yang baru. Selama aklimatisasi tikus diberikan pakan standar (Br2) dan minum secara ad libitum serta diamati keadaan umum dan berat badannya (Wulandah, 2011). c. Pembagian hewan uji Semua tikus dibagi menjadi dua kelompok secara acak, kelompok satu merupakan kelompok kontrol normal (K1) yang terdiri dari lima ekor tikus, sedangkan kelompok lainnya sebagai kelompok dislipidemia diabetes yang terdiri dari 15 ekor tikus, yang kemudian dibagi menjadi tiga kelompok secara acak yaitu, kelompok kontrol negatif (K2), kelompok glibenklamid (K3), kelompok kombinasi glibenklamid dan Aloe vera (K4). Tabel 9. Kelompok kontrol dan Kelompok Dislipidemia Diabetes Kode Kelompok Jumlah Tikus Kelompok Kontrol K1 Lima tikus/kelompok Kelompok Dislipidemia Diabetes K2, K3, dan K4 Lima tikus/ kelompok 35

7 d. Induksi diabetes pada tikus Sebelum diinduksi, tikus diperiksa kadar glukosa pre-induksi pada semua kelompok. Induksi tikus hanya dilakukan pada kelompok II, III dan IV menggunakan nikotinamid, 15 menit kemudian dilanjutkan dengan streptozotosin secara ip pada semua tikus. Setelah diinduksi tetap diberikan pakan dan minum ad libitum pada semua kelompok tikus. Selanjutnya, tikus diperiksa kadar glukosa darah, HDL dan LDL post-induksi pada semua kelompok. Parameter keberhasilan induksi adalah kadar glukosa darah puasa tikus melebihi 150 mg/dl (Dewi, 2014). e. Pembagian hewan uji Setelah 15 tikus kelompok diabetes memenuhi kriteri Dislipidemia DM maka dibagi secara acak menjadi 3 kelompok Dislipidemia DM. Pembagian kelompok sebagai berikut: Tabel 10. Perlakuan Pada Masing-masing Kelompok Kelompok Perlakuan Jumlah Tikus K1 Tikus tanpa induksi yang diberikan plasebo 5 yaitu CMC 0,5 % per oral. K2 Tikus Dislipidemia DM yang diberikan 5 plasebo yaitu CMC 0,5 % per oral. K3 Tikus Dislipidemia DM yang diberikan 5 glibenklamid sebesar 0,18 mg/200g BB/tikus/hari per oral. K4 Tikus Dislipidemia DM yang diberikan kombinasi jus Aloe vera sebesar 3,6 ml/200 g BB/hari dan glibenklamid 0,18 mg/200g BB/tikus/hari per oral. 5 Perlakuan plasebo, glibenklamid serta kombinasi jus dan glibenklamid diberikan satu kali sehari pada pagi hari (waktu dan jam yang sama) dengan cara sonde oral, selanjutnya diberikan pakan standar (Br2) dan minum ad libitum pada semua kelompok. Sebelum diberi perlakuan tikus ditimbang terlebih dahulu untuk menentukan dosis obat glibenklamid dan jus Aloe vera. Perlakuan diberikan selama 28 hari. 36

8 f. Pengambilan sampel darah Darah yang diambil berasal dari sinus orbital. Pengukuran kadar LDL dan HDL pada pre-induksi, post-induksi, post-perlakuan menggunakan alat spektrofotometer. Metode pemeriksaan LDL dan HDL dengan menggunakan GOD-PAP dan CHOD-PAP dengan prinsip spektrofotometer (Rifai dan warnick, 2006 ). Sebelum dilakukan pengambilan darah, tikus di anestesi terlebih dahulu secara intramuskular dengan ketamin hidroklorida 20 mg/kg bb tikus. Pengukuran kadar glukosa darah dilakukan pada pre-induksi dan post-induksi yang menggunakan alat spektrofotometer dengan metode GOD-PAP. Metode ini diawali dengan pengambilan darah pada tikus dengan spuit sebanyak 0,5 ml kemudian disentrifus 4000 rpm selama 15 menit. Setelah itu ambil plasma sebanyak 10 mikrolab dan dicampur dengan reagen GOD PAP 1000 mikrolab dengan menggunakan alat vortex, kemudian di inkubasi selama 20 menit dengan suhu C. Tahap terakhir kadar glukosa dibaca dengan gelombang 500 nm. Teknik pengukuran LDL dilakukan pada pre-induksi, post-induksi dan postperlakuan menggunakan alat spektrofotometer dengan metode CHOD-PAP. Metode ini diawali dengan pengambilan darah pada tikus dengan spuit sebanyak 0,5 ml kemudian disentrifus 4000 rpm selama 15 menit. Setelah itu ambil plasma sebanyak 100 µl sebagai sampel dan ditambah reagent LDL presipitans sebanyak 1000 µl kemudian dicampur dengan menggunakan alat vortex, kemudian di inkubasi selama 15 menit dengan suhu C. Tahap terakhir kadar LDL dibaca dengan gelombang 546 nm. Teknik pengukuran HDL dilakukan pada pre-induksi, post-induksi dan postperlakuan menggunakan alat spektrofotometer dengan metode CHOD-PAP. Metode ini diawali dengan pengambilan darah pada tikus dengan spuit sebanyak 0,5 ml kemudian disentrifus 4000 rpm selama 15 menit. Setelah itu ambil plasma sebanyak 200 µl sebagai sampel dan ditambah reagent HDL presipitans sebanyak 500 µl kemudian dicampur dengan menggunakan alat vortex, 37

9 kemudian di inkubasi selama 15 menit dengan suhu C. Tahap terakhir kadar HDL dibaca dengan gelombang 546 nm. 38

10 Uraian diatas dapat digambarkan sebagai berikut : 20 ekor tikus putih jantan (Rattus novergicus) strain wistar Aklimatisasi selama 7 hari Pembagian Kelompok 5 ekor tikus 15 ekor tikus Kelompok 1 (kontrol normal) Kelompok II (kontrol negatif) Kelompok III Kelompok IV Pemeriksaan kadar GDP, LDL, HDL Pre-induksi Induksi dengan STZ dan nikotinamid Setelah 5 hari diperiksa GDP, LDL dan HDL Post-Induksi dan dibagi secara acak menjadi 4 kelompok K1 K2 K3 K4 Tikus tanpa induksi dan diberikan placebo CMC 0,5% Tikus Dislipidem ia DM yang diberikan plasebo yaitu CMC 0,5 % Tikus Dislipidemia DM yang diberikan glibenklamid sebesar 0,18 mg/200g BB/tikus/hari Tikus Dislipidemia DM yang diberikan kombinasi glibenklamid sebanyak 0,18 mg/ 200g BB/ tikus/ hari. dan jus Aloe vera sebanyak 3,6 Post-Perlakuan, diberikan selama 28 hari pada pagi hari (waktu dan jam yang sama). Pemeriksaan LDL dan HDL. Analisis Data Gambar 7. Tahapan Penelitian 39

11 3.8. Rencana Analisis Data Analisis hasil LDL dan HDL darah post-induksi menggunakan T-Test berpasangan. Analisis data selama perlakuan pada semua kelompok tikus dapat dilakukan dengan uji One Way Anova. Semua data sebelumnya dihitung ratarata dan standar deviasinya, karena subyek kurang dari 50 untuk menganalisis sebaran data kelompok, dilakukan uji Shapiro-Wilk. Apabila varian data dan sebarannya tidak terdistribusi normal maka dilakukan uji Kruskal Willis. Analisis statistik menggunakan aplikasi IBM SPSS statistik 21 (nomor lisensi QA3AM8U62Z4ZWTSPV44VXI65P590LE547WHIQVZYWLARL9JEYQE GDUBLH8Z3ZCJAL3FLXM398V95TSDYI7POEXUPRR) 3.9. Etika Penelitian Penelitian ini dilakukan di PAU UGM selama 41 hari, dengan metode dan cara yang benar serta jujur dalam pengolahan data, proses pengambilan sampel darah dilakukan dengan cara yang benar dan hati-hati agar tikus tidak menderita. Agar tikus tidak merasa sakit maka dilakukan anastesi dengan ketamin, pemberian pakan dan minum serta pembersihan kandang dilakukan secara teratur dan diperhatikan setiap hari. Persetujuan etika penelitian telah diajukan ke Komite Etik Fakultas Kedokteran Universitas Islam Indonesia Jadwal Penelitian Karena penelitian ini merupakan penelitian payung bersama beberapa rekan mahasiswa dan dosen pembimbing maka, jadwal penelitian sudah terlebih dahulu dilaksanakan sebelumnya. Tabel 11. Jadwal pelaksanaan penelitian No Kegiatan Bulan 1 Penyusunan Propostal Januari Mei Penelitian Januari Februari Seminar Propostal Mei Penyusunan Hasil Juli-Desember Seminar Hasil Januari