LAPORAN PRAKTIKUM PENYAKIT INFEKSIUS IDENTIFIKASI DAN ISOLASI BAKTERI Escherichia coli TRINI PURNAMASARI S. O111 12 255 KELOMPOK 5 Nama Asisten : Meyby Eka Putri Rozana Pratiwi PROGAM STUDI KEDOKTERAN HEWAN FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS HASANUDDIN MAKASSAR 2014 1
DAFTAR ISI Halaman Judul 1 Daftar Isi 2 BAB I Pendahuluan 1.1 Latar Belakang 3 1.2 Tujuan Praktikum 3 BABII Tinjauan Pustaka 2.1 Penyakit infeksius pada hewan yang disebabkan Escherichia coli 4 2.2 Teknik isolasi bakteri E. coli: media (Broth, SMAC, EMBA) yang digunakan 4 2.3 Pewarnaan gram pada bakteri 5 2.4 Uji Biokimia untuk identifikasi E. coli: TSIA, SIM, MRVP, Citrat dan Urea 5 BAB III Materi dan Metode 3.1 Alat Dan Bahan 8 3.2 Prosedur Kerja 8 BAB IV Hasil dan Pembahasan 4.1 Hasil 10 4.2 Pembahasan 10 BAB V Penutup 5.1 Kesimpulan 13 5.2 Saran untuk praktikum selanjutnya 13 Lampiran Foto. 14 Daftar Pustaka 15 BAB I 2
PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Isolasi adalah mengambil mikroorganisme yang terdapat di alam dan menumbuhkannya dalam suatu medium buatan. Proses pemisahan atau pemurnian dari mikroorganisme lain perlu dilakukan karena semua pekerjaan mikrobiologis, misalnya telaah dan identifikasi mikroorganisme, memerlukan suatu populasi yang hanya terdiri dari satu macam mikroorganisme saja. Prinsip dari isolasi mikroba adalah memisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba lainnya yang berasal dari campuran bermacam-macam mikroba. Hal ini dapat dilakukan dengan menumbuhkannya dalam media padat sel-sel mikroba akan membentuk suatu koloni sel yang tetap pada tempatnya (Sutedjo, 1996). E. coli adalah bakteri yang berbentuk batang, gram negatif merupakan penghuni normal dalam saluran pencernaan manusia dan hewan, namun demikian serotipe tertentu dapat menyebabkan sakit pada manusia. Salah satu serotype itu adalah O157, : H7 yang dapat menginduksi sekresi cairan tubuh secara berlebihan dan terus menerus sehingga terjadi diare dan dapat menyebabkan meningitis, penularan dan penyebaran agen penyakit ini dapat melalui tinja dari lingkungan yang tercemar. E. coli juga pernah ditemukan pada bahan makanan asal hewan seperti daging sapi dan daging ayam segar (Ewings, 1986). 1.2 Tujuan Praktikum Mengetahui cara isolasi dan identifikasi bakteri Escherichia coli sebagai penyebab penyakit infeksius. 3
BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Penyakit infeksius pada hewan yang disebabkan Escherichia coli Strain pathogen E.coli dihubungkan dengan penyakit pada intestinum dan dengan septikemia pada hewan muda atau hewan yang baru lahir dan dengan penyakit respirasi pada unggas. Strain non patogen juga dapat menyebabkan infeksi tertentu pada ambing, uterus dan bagian tubuh lain. Ada 3 manifestasi enterik kolibasilosis pada babi yaitu: enteritis E.coli neonatal yaitu enteritis yang terjadi pada anak babi umur 1-4 hari, babi terlihat normal selama 12 jam pertama kehidupan dan kemudian mengalami dehidrasi selama 18 jam. Enteritis pada babi lepas sapih yaitu yang terjadi setelah penyapihan. Babi yang terinfeksi mengalami diare, depresi, anoreksia dan demam yang mungkin terjadi selama 2-3 hari. Meskipun seringkali terjadi kolaps dan kematian setelah periode singkat dari diare, mortalitas pada hewan lepas sapih lebih rendah daripada hewan neonatal. penyakit edema yaitu edema pada berbagai jaringan tubuh babi segera setelah disapih. 2.2 Teknik isolasi bakteri E. coli: media (NB, SMAC, EMBA) yang digunakan Nutrien Broth Nutrient broth merupakan media untuk mikroorganisme yang berbentuk cair. Intinya sama dengan nutrient agar. Sampel feses yang telah diencerkan terlebih dahulu dengan buffered peptone water (BPW) 0,1%, sebelum ditumbuhkan pada medium agar atau cair (nutrient broth) sehingga setelah inkubasi akan diperoleh jumlah bakteri yang dapat dihitung (Suardana, dkk. 2014). SMAC Koloni positif E. coli dari media EMBA yang ditanam pada media nutrien agar miring, selanjutnya diinokulasikan pada media selektif sorbitol MacConkey agar (SMAC). Setelah diinkubasikan pada suhu 37 C selama 20-24 jam, serotipe E. coli O157 dideteksi dari terlihatnya koloni 4
jernih atau tidak berwarna dan dianggap bersifat sorbitol negative (Suardana, dkk. 2014). EMBA Sebanyak 15 ml media eosin methylene blue agar (EMBA) dimasukkan ke dalam setiap cawan petri untuk disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121 o C selama 15 menit. Setelah sterilisasi media diambil dari strerilisator untuk selanjutnya didiamkan pada suhu kamar agar media menjadi padat. Dari pengenceran sampel yang dikehendaki, sebanyak 0,1 ml larutan tersebut dimasukkan ke dalam cawan petri dengan metode sebar menggunakan gelas bengkok. Inkubasi dilakukan pada suhu 37 o C selama 18-24 jam. Setelah akhir inkubasi, koloni yang tumbuh dan berwarna hijau metalik dengan titik hitam pada bagian tengahnya dihitung sebagai koloni E. coli. Koloni yang tumbuh dikoleksi dengan cara diinokulasikan pada media nutrien agar miring untuk pemeriksaan selanjutnya (Suardana, dkk. 2014). 2.3 Pewarnaan gram pada bakteri Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu atau kristal ungu pada metode pewarnaan gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alcohol, sementara bakteri gram negative tidak. Pada uji pewarnaan gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metal ungu atau crystal violet, yang membuat semua bakteri gram negative menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian tersebut berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri tersebut berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka (Karmana, 2008). 2.4 Uji Biokimia untuk identifikasi E. coli: TSIA, SIM, MRVP, Citrat dan Urea TSIA (Three Sugar Iron Agar) Dengan menggunakan ose steril diambil biakan dari EMBA, lalu ditaman pada media TSIA dengan cara ditusukkan sampai ke dasar tabung, kemudian digores secara zig-zag pada permukaannya. Diinkubasikan pada suhu 37 o C selama 24 jam. Diamati perubahan pada media. Prinsip TSIA, 5
bakteri yang tergolong Enterobacteriaceae dapat memfermentasi karbohidrat (Glukosa, Laktosa, Sukrosa). Hasil : Berwarna kuning (bersifat asam ) pada bagian tegak dan miring sehingga bakteri dapat memfermentasi karbohidrat, berwarna hitam dapat memproduksi H 2 S (+), dan terbentuk gas didasar tabung (Murni. 2014). SIM (Sulfide Indol Motility) Inokulasikan 1 ose dari Plate Count Agar (PCA) miring ke dalam tryptone Broth inkubasi selama 24 jam ± 2 jam pada suhu 35 o C +1 o C. Uji Indoldilakukan dengan menambahkan 0,2 ml 0,3 ml pereaksi Kovacs. Reaksi positif jika terbentuk cincin merah pada lapisan bagian atas media dan negatif bila terbentuk cincin warna kuning. Prinsip SIM adalah mengetahui motilitas organisme, adanya pembebasan H2S (sulfide) dan mengetahui adanya pembentukan indol. Hasil : Adanya H 3 S ditunjukkan dengan perubahan warna menjadi hitam pada bagian dasar. Motilitas diketahui dari keruhnya media dan adanya penyebaran ke atas ( mirip pohon cemara terbalik ). Adanya indol terlihat berupa cincin merah beberapa detik sampai 5 menit setelah penambahan 1 ml chloroform dan beberapa tetes reagen Kovac (Murni, 2014). MRVP (Metyl Red Voges Proskauer) Inokulasikan bakteri ujipada media MRVP dan inkubasikan pada pada suhu 37 C selama 24 jam. Setelah inkubasi media menjadi keruh lalu di tambahkan peubah atau reagen dengan urutan sebagai berikut : Uji MR dengan cara menambahkan 2 tetes reagen methyl red lalu kocok beberapa kali. Reaksi positif di tandai perubahan warna menjadi merah. Uji VP dengan media yang sama setelah uji MR di lanjutkan dengan uji VP dengan menambahkan 0,6 ml alpha naphtol soln dan 0,2 ml KOH 40% aq soln, kemudian kocok sedikit reaksi di tunggu mulai 20 sampai 30 menit, lihat perubahan warna, reaksi positif di tandai perubahan warna menjadi merah. Prinsip MR adalah mengetahui terbentuknya asam kuat. Hasil : Terbentuknya asam ditunjukkan dengan terjadi perubahan warna dari orange menjadi merah setelah ditetesi ragen MR. Prinsip VP adalah mengetahui terbentuknya asetil methil karbinol. Hasil : Terbentuknya 6
asetil methil karbinol terlihat dengan adanya perubahan dari orange menjadi merah setelah ditetesi KOH dan α-naftol (Murni, 2014). Citrat Goreskan 1 ose dari PCA miring ke permukaan Simmon Citrat Agar. Inkubasi selama 96 jam + 2 jam pada suhu 35 o C +1 o C. Reaksi positif jika terjadi pertumbuhan dan media berubah warna menjadi biru, reaksi negatif jika tidak ada pertumbuhan dan media tetap hijau. Prinsip : Mengetahui kemampuan organisme untuk menggunakan sitrat sebagai sumber karbon utama. Hasil : pertumbuhan bakteri dapat terlihat dengan adanya perubahan warna dari hijau menjadi biru (Murni. 2014). Urea Prinsip : Sebagian bakteri menghasilkan enzim urease yang dapat menguraikan urea sehingga bersifat alkalis atau basa (berwarna merah). Hasil : Terjadi perubahan warna dari merah mudah ke merah keunguan (Murni. 2014). 7
BAB III MATERI DAN METODE III.1 Alat dan Bahan Alat yang digunakan pada praktikum ini antara lain : Ose Bunsen Rak tabung Tabung Korek gas Object glass Cover glass Mikroskop Pipet tetes Bahan yang digunakan pada praktikum ini antara lain : NaCl suspensi Koloni bakteri E.coli Crystal Violet Lugol Alkohol 90% Safranin Minyak emersi III. 2 Prosedur Kerja o Isolasi Staphylococcus 1. Isolat bakteri diinokulasikan pada media SMAC secara streak. 2. Media yang berisi isolat bakteri diinkubasi selama 20-24 jam pada suhu 37 0 celcius. o Media Uji Biokimia a. Media Triple Sugar Iron (TSI) Agar 65 g serbuk media Triple Sugar Iron Agar dilarutkan dengan 1 liter air suling, lalu dipanaskan hingga mendidih, setelah itu dimasukkan ke 8
dalam tabung reaksi sebanyak 10 ml, kemudian disterilkan selama 15 menit pada 121 ⁰ C tekanan 15 lbs, dibiarkan membeku pada posisi miring. b. Medium Sulfit Indol Motility (SIM) 30 g serbuk media SIM dilarutkan dengan 1 liter air suling, dipanaskan hingga melarut, setelah itu dimasukkan ke tabung reaksi sebanyak 10 ml, disterilkan dengan autoklaf selama 15 menit pada suhu 121 ⁰ C tekanan 15 lbs. c. Media Metil Red-Voges Proskauer (MR-VP) 17 g serbuk media MR-VP dilarutkan dalam 1 liter air suling, lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 10 ml, kemudian disterilkan dengan autoklaf selama 15 menit pada suhu 121 ⁰ C tekanan 15 lbs. o Pewarnaan Gram 1. Fikasi ose dan objek glass dengan menggunakan bunsen 2. Homogenkan satu ose biak bakteri dengan NaCl fisiologis yang telah di teteskan pada gelas objek. Buat Apus setipis mungkin. 3. Keringkan dan fiksasi diatas bunsen 4. Preparat apus diteteskan pewarna : (a) Crystal violet selama kurang lebih 2 menit kemudian dibilas dengan menggunakan air mengalir. (b) Teteskan lugol selama kurang lebih 20-30 detik kemudian dilunturkan dengan menggunakan alkohol 90% selama 1 menit. (c) Setelah itu alkohol dibuang dan dicuci dengan air mengalir. (d) Teteskan safranin kurang lebih 2 menit kemudian dibersihkan dengan air mengalir dan dikeringkan. Lihat dibawah mikroskop BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN IV.1 Hasil o Isolasi Escherichia coli 9
Pertumbuhan pada media SMAC diamati. Koloni bakteri Escherichia coli O157 menunjukan tidak adanya perubahan warna pada media. o Uji Biokimia TSIA (Triple Sugar Iron Agar) MR-VP (methyl red-voges proskauer) - Glukosa : kuning (+) - MR : merah (+) - Laktosa : kuning (+) - VP : negatif (-) - Sukrosa : kuning (+) SIM (Sulfide Indol Motility) - H2S : negatif (-) - Indol : positif (+) - Motil : positif (+) o Pewarnaan Gram Pada uji pewarnaan gram yang terlihat dibawah mikroskop yaitu bakteri Escherichia coli berwarna merah. IV.2 Pembahasan o Isolasi Escherichia coli Isolasi adalah mengambil mikroorganisme yang terdapat di alam dan menumbuhkannya dalam suatu medium buatan. Prinsip dari isolasi mikroba adalah memisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba lainnya yang berasal dari campuran bermacam-macam mikroba. Hal ini dapat dilakukan dengan menumbuhkannya dalam media padat sel-sel mikroba akan membentuk suatu koloni sel yang tetap pada tempatnya (Sutedjo, 1996). SMAC merupakan media selektif untuk mengetehui apakah Escherichia coli yang di kultur itu pathogen atau tidah. Pertumbuhan Escherichia coli pada media SMAC yang patpgen akana memiliki koloni bakteri Escherichia coli O157 menunjukan tidak adanya perubahan warna pada media, karena Escherichia coli O157 tidak memfermantasikan sorbitol sehingga tidak mengubah warna media. o Uji Biokimia 10
- Triple Sugar iron Agar (TSIA) Media Triple Sugar Iron Agar (TSIA) merupakan salah satu metode yang digunakan untuk melihat kemampuan bakteri dalam memfermentasikan gulagula,selain itu melihat pula kemampuan bakteri dalam menghasilkan gas dan H 2 S dari proses fermentasi tersebut. Pada prinsipnya bakteri yang tergolong Enterobacteriaceae dapat memfermentasi karbohidrat (Glukosa, Laktosa, Sukrosa). Pada uji fermantasi gula-gula kali ini dengan menggunakan media TSIA, E coli memberikan hasil positif asam pada bagian lereng dan dasar (media berwarna kuning) pada bagian tegak dan miring sehingga bakteri dapat memfermentasi karbohidrat,. Hal tersebut bisa terjadi karena bakteri E. coli memiliki enzim betagalaktosidase dan sukrase yang dapat memecah laktosa menjadi glukosa dan galaktosa serta memecah sukrosa menjadi glukosa dan fruktosa. Selain itu juga terbentuk gas namun negative H 2 S karena tidak mampu mendesulfurasi asam amino dan methion yang akan menghasilkan H 2 S. - Sulfide, Indol, Motility (SIM) Pada uji SIM, terlihat bahwa bakteri E. coli H 3 S karena tidak adanya perubahan warna menjadi hitam pada bagian dasar Pada uji indol memberikan hasil positif dimana terlihat berupa cincin merah, bakteri E.coli menghasilkan enzim triptopanase sehingga mampu mengubah asam amino triptopan menjadi senyawa indol. Pada uji motility, bakteri E. coli menghasilkan motilitas yang positif, motilitas diketahui dari keruhnya media adanya penyebaran ke atas ( mirip pohon cemara terbalik ). - Methyl red- voges proskauer ( MR-VP) a. Uji MR Hasilnya positif, terjadi perubahan warna menjadi merah setelah ditambahkan methyl red. Artinya, bakteri ini mengahasilkan asam campuran (metilen glikon) dari proses fermentasi glukosa yang terkandung dalam medium MR-VP. Terbentuknya asam campuran pada media akan menurunkan ph sampai 5,0 atau kurang, oleh karena itu bila indikator metil ditambahkan pada biakan 11
tersebut dengan ph seredndah itu maka indikator tersebut menjkadi merah. Hal ini menandakan bahwa bakteri ini peragi asam campuran. b. Uji VP Hasilnya negatif, karena tidak terbentuk warna merah pada medium setelah ditambahkan α-napthol dan KOH, artinya hasil akhir fermentasi bakteri ini bukan asetil metil karbinol (asetolin) o Pewarnaan Gram Pada pengecatan ini digunakan bakteri Escerhia coli, pengecatan ini juga menggunakan 4 (empat) jenis larutan yaitu Kristal violet, sebagai cat utama, larutan iodium sebagai pengintensifan, alcohol asam untuk pencucian dan safranin sebagai cat penutup. Berdasarkan percobaan diperoleh Escerchia coli bersifat gram negatif karena tidak dapat mengikat kuat cat utama dan dapat diwarnai oleh cat lawan yakni merah dari pewarna safranin. Hal ini sesuai dengan pendapat Pelczar (2006) menyatakan bahwa bakteri gram negatif akan kehilangan zat pewarna kristal violet setelah dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi zat pewarna tandingannya yaitu dengan zat pewarna air fuchsin atau safranin akan tampak berwarna merah. Dengan demikian hasil pengamatan dengan literatur sama hasil warnanya yaitu berwarna merah. Escherichia coli termasuk dalam famili Enterobacteraceae yang termasuk gram negatif dan berbentuk batang yang fermentatif. BAB V PENUTUP 5.1 Kesimpulan Escherichia coli dapat diisolasi dan diidentifikasi dengan berbagai metode seperti pengisolasian Escherichia coli pada media-media seperti Nutrien Broth, SMAC, EMBA, pewarnaan gram, serta uji TSIA, SIM, 12
MRVP, citrat dan urea untuk dapat meningkatkan presentasi penemuaan Escherichia coli, bukan bakteri jenis lainnya. 5.2 Saran Untuk Praktikum Selanjutnya Pengadaan penuntun praktikum untuk praktikum selanjutnya baik berupa hardcopy maupun softcopy untuk memudahkan praktikan dalam menjalankan praktikum. LAMPIRAN FOTO Media Isolasi 13
Uji Biokimia Pewarnaan Gram 14
DAFTAR PUSTAKA Ewings, W.H, 1986. Edward and Ewing. Identification of enterobacteriacea 4' h Ed.Elsevier, New York Karmana, O, 2008. Biologi. Grafindo Media Pratama : Bandung Murni, D. 2014. Isolasi dan Identifikasi Escherichia Coli pada Hewan Coba. Pelczar, M. J. And E. C. S. Chan. 1986. Elements of Mycrobiology. New York : Mc grow-hill Book Company. Suardana. IW., dkk. 2014. Identifikasi Escherichia coli O157:H7 dari Feses Ayam dan Uji Profil Hemolisisnya pada Media Agar Darah. Jurnal Keokteran Hewan. UGM Sutedjo, M. 1996. Mikrobiologi Tanah. Rineka Cipta, Jakarta. http://elisa.ugm.ac.id/user/archive/download/37952/555eb1eb6dcac9eeb0e9f7155 3107a33. Diakses pada tanggal 11 November 2014, pukul 20:30 WITA. 15