BAB III METODOLOGI PENELITIAN A. Metode dan Jenis Penelitian 1. Metode Penelitian Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode penelitian eksperimen (experiment research) (Notoatmodjo, 2002). 2. Jenis Penelitian Jenis penelitian yang digunakan adalah eksperimen semu (quasi experiment) (Notoatmodjo, 2002). B. Tempat dan waktu Penelitian Penelitian dilakukan di Laboratorium Kimia Analisis Universitas Muhammadiyah Purwokerto selama 4 bulan. Penelitian dilaksanakan dari bulan Maret hingga bulan Juni 2011. C. Alat dan Bahan 1. Alat Spektrofotometer (Shimadzu type UV-1800), alat-alat gelas (Iwaki pyrex), timbangan analitik (Shimadzu type AY220), penangas air, kertas wathman 40, pro pipet, silika gel 60 F 254, Bejana KLT. 2. Bahan Hidrokuinon baku (Merck), krim malam pemutih, floroglusinol (p.a) (Merck), NaOH(p.a) (Merck), etanol 95%(p.a) (Merck), metanol (p.a) (Merck), kloroform(p.a) (Merck), akuabidestilata (Otsuka). D. Batasan Variabel Operasional Batasan Variabel Operasional yang digunakan dalam penelitian ini adalah : 1. Variabel bebas : Sampel krim malam pemutih 2. Variabel kendali : Konsentrasi NaOH, lama pemanasan, suhu
pemanasan, jumlah pereaksi floroglusinol, dan operating time 3. Variabel tergantung : Kadar hidrokuinon dalam krim E. Metode Pengambilan Sampel Berdasarkan survei terdapat 24 produk krim malam pemutih yang beredar di salah satu swalayan di Purwokerto. Teknik pengambilan sampel dilakukan dengan menggunakan rumus n+1 dengan memberikan kode pada masing-masing sampel (Badan Pengawas Obat dan Makanan, 2001). Dari hasil perhitungan, sampel krim malam pemutih yang digunakan sejumlah 6 produk. F. Metode Kerja 1. Analisis Kualitatif Hidrokuinon Secara Kromatografi Lapis Tipis a. Pembuatan fase gerak Fase gerak dibuat dari campuran metanol dan kloroform dengan perbandingan 1:1. Diambil 10 ml metanol dan 10 ml kloroform, kemudian kedua larutan tersebut dicampurkan sehingga diperoleh fase gerak. Campuran larutan tersebut dimasukkan ke dalam bejana lalu bejana tersebut ditutup. Selanjutnya fase gerak tersebut didiamkan hingga bejana terjenuhi oleh fase gerak. b. Pembuatan baku hidrokuinon 1000 ppm Hidrokuinon baku ditimbang sebanyak 100 mg. Hidrokuinon baku yang telah ditimbang lalu dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml, kemudian ditambahkan etanol 95% hingga volumenya tepat 100 ml sehingga diperoleh larutan baku dengan konsentrasi 1000 ppm. c. Ekstraksi sampel Sampel sebanyak 2 gramdisuspensikan dalam 5 ml etanol 95 % kemudian disaring dengan kertas saring. Filtrat yang diperoleh ditampung dan dimasukkan ke dalam labu ukur 5 ml. Selanjutnya tambahkan etanol 95% ke dalam labu ukur hingga volumenya tepat 5 ml. d. Uji dengan Kromatografi Lapis Tipis
Larutan baku hidrokuinon dan larutan sampel diambil dengan menggunakan pipa kapiler kemudian masing-masing ditotolkan pada lempeng KLT yang telah diaktifkan. Selanjutnya lempeng KLT tersebut dikeringanginkan hingga pelarut menguap. Lempeng KLT yang telah kering dimasukkan ke dalam bejana yang telah dijenuhi oleh fase gerak. Fase gerak dibiarkan bergerak naik sampai batas elusi. Kemudian tinggi bercak yang muncul pada masing-masing totolan diamati. Tinggi bercak yang muncul digunakan untuk menghitung nilai Rf, kemudian nilai Rf sampel dibandingkan dengan Rf baku hidrokuinon. 2. Analisis Kuantitatif Secara Spektrofotometri UV-Vis a. Pembuatan larutan baku hidrokuinon 1000 ppm Hidrokuinon baku ditimbang sebanyak 100 mg. Hidrokuinon baku yang telah ditimbang lalu dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml, kemudian ditambahkan dengan etanol 95% hingga volumenya tepat 100 ml sehingga diperoleh larutan baku dengan konsentrasi 1000 ppm. b. Pembuatan seri konsentrasi Larutan baku hidrokuinon dengan konsentrasi 1000 ppm diambil sebanyak 10 ml kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml, lalu ditambah etanol 95% hingga volumenya tepat 100 ml sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 100 ppm. Dari larutan dengan konsentrasi 100 ppm, diambil sebanyak 0,2; 0,4; 06; 0,8; 1 dan 1,2 ml lalu dimasukkan ke dalam labu takar 10 ml dan ditambahkan etanol 95% hingga volumenya tepat 10 ml. Seri konsentrasi yang diperoleh yaitu 2, 4, 6, 8, 10 dan 12 ppm. c. Pembuatan larutan Floroglusinol 1% Floroglusinolditimbang secara seksama sebanyak 1 gram. Floroglusin yang telah ditimbang kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml. Selanjutnya ditambahkan etanol 90% hingga volumenya tepat 100 ml ( Departemen Kesehatan RI, 1979). d. Pembuatan larutan NaOH 0,5 N
NaOH ditimbang secara seksama sebanyak 20 gram kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 1000 ml. Selanjutnya ditambahkan akuabidestilata hingga volumenya tepat 1000 ml (Departeman Kesehatan RI, 1979). e. Penentuan panjang gelombang maksimum Larutan hidrokuinon dengan konsentrasi 10 ppm sebanyak 5 ml ditambahkan dengan 1 ml pereaksi floroglusinol 1% dan 1 ml NaOH 0,5 N, kemudian dipanaskan dalam penangas air pada suhu 70 o C selama 50 menit. Tabung reaksi kemudian didinginkan dalam air bersuhu 25 o C, kemudian campuran larutan ditambahkan etanol 95% hingga volumenya 10 ml. Larutan dikocok hingga tercampur sempurna. Selanjutnya absorbansi larutan tersebut dibaca pada panjang gelombang 400-800 nm sehingga diperoleh panjang gelombang maksimum. f. Penetuan Operating time Larutan hidrokuinon dengan konsentrasi 10 ppm dimasukkan kedalam sepuluh tabung reaksi masing-masing sebanyak 5 ml. Masing-masing tabung ditambahkan dengan 1 ml pereaksi floroglusinol 1% dan 1 ml larutan NaOH 0,5 N, lalu dipanaskan dalam penangas air pada suhu 70 o C selama 50 menit. Tabung reaksi kemudian didinginkan dalam air bersuhu 25 o C, selanjutnya campuran larutan ditambahkan etanol 95% hingga volumenya 10 ml. Selanjutnya baca absorbansinya pada menit ke 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 dan 18 pada panjang gelombang maksimum sehingga didapatkan operating time. g. Pembuatan kurva baku hidrokuinon Larutan hidrokuinon dengan konsentrasi 2, 4, 6, 8, 10 dan 12 ppm masingmasing sebanyak 5 ml lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan dengan 1 ml pereaksi floroglusinol 1% dan 1 ml larutan NaOH 0,5 N, lalu dipanaskan dalam penangas air pada suhu 70 o C selama 50 menit. Tabung reaksi kemudian didinginkan dalam air bersuhu 25 o C, selanjutnya campuran larutan ditambahkan etanol 95% hingga volumenya 10 ml lalu didiamkan pada operating time. Selanjutnya masing-masing larutan dibaca absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang maksimum. Hasil absorbansi yang diperoleh pada masing-masing konsentrasi diplotkan ke dalam
regresi linier sehingga diperoleh persamaan kurva baku yaitu Y= bx + a. Persamaan kurva baku yang diperoleh akan menjadi dasar dalam perhitungan kadar. h. Validasi metode 1. Ketelitian ( precision ) Larutan baku hidrokuinon dengan konsentrasi 8 ppm sebanyak 5 mldimasukkan ke dalam tabung reaksi. Disiapkan dengan cara yang sama untuk 6 tabung reaksi.kemudian masing-masing tabung ditambahkan dengan 1 ml pereaksi floroglusinol 1% dan 1 ml larutan NaOH 0,5 N, lalu dipanaskan dalam penangas air pada suhu 70 o C selama 50 menit. Tabung reaksi kemudian didinginkan dalam air bersuhu 25 o C, selanjutnya campuran larutan ditambahkan etanol 95% hingga volumenya 10 ml lalu didiamkan pada operating time. Selanjutnya masing-masing larutan dibaca absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang maksimum. 2. Linieritas ( Linearity ) Hasil absorbansi masing-masing konsentrasi pada kurva baku diplotkan ke dalam regresi linier sehingga diperoleh persamaan kurva baku dan nilai koefisien korelasinya (r). Nilai r yang diperoleh menunjukkan linieritas. 3. LOD dan LOQ(Limit of Detection dan Limit of Quantitation) Batas deteksi dan batas kuantitasi dapat dihitung secara statistik melalui persamaan garis linear dari kurva baku. Dengan menggunakan kurva kalibrasi Y=bx+a, dan persamaan untuk nilai Y pada batas deteksi : y= Y B + 3 S B, maka LOD dapat dihitung. Untuk menentukan batas kuantitasi maka dihitung nilai Y pada batas kuantitasi dengan persamaan y= Y B + 10 S B, maka LOQ dapat dihitung. 4. Ketepatan (Accuracy) Sampel krim ditimbang secara duplo sebanyak 0,5 gram. Pada penimbangan yang pertama ditambahkan hidrokuinon baku sebanyak 1 ml dengan konsentrasi 50 ppm, sedangkan pada penimbangan kedua tidak ditambahkan baku hidrokuinon. Masing-masing krim yang telah ditimbang disuspensikan dalam 5 ml etanol 95 % lalu disaring dengan kertas saring ke dalam labu takar 5 ml dan ditambahkan etanol sampai tanda.selanjutnya larutan
tersebut dipindahkan ke dalam tabung reaksi lalu ditambahkan dengan 1 ml pereaksi floroglusinol 1% dan 1mL NaOH 0,5 N, panaskan diatas tangas air pada suhu 70 C selama 50 menit lalu dinginkan pada air dengan suhu 25 C. Selanjutnya campuran larutan tersebut ditambahkan etanol 95% hingga volumenya 10 ml lalu didiamkan pada operating time.baca absorbansinya menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjanggelombang maksimum. i. Penetapan kadar hidrokuinon dalam sampel krim Sebanyak 2 gram sampel krimditimbang kemudiandilarutkan dengan 5 ml etanol 95%. Selanjutnya disaring dengan kertas saring ke dalam labu takar 5 ml dan ditambahkan etanol sampai tanda. Dari larutan ini dipipet 1 ml lalu dimasukan dalam labu takar 10 ml dan ditambahkan etanol 95% hingga garis tanda. Selanjutnya mengambil larutan tersebut sebanyak 5 ml lalu ditambahkan dengan pereaksi floroglusinol 1% sebanyak 1mL dan 1mL NaOH 0,5 N, panaskan diatas penangas air pada suhu 70 C selama 50 menit, dinginkan pada air dengan suhu 25 C. Selanjutnya campuran larutan tersebut ditambahkan dengan etanol hingga volumenya 10 ml lalu didiamkan pada operating time. Baca absorbansinya menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang maksimum.