Penentuan Kadar Tablet Asetosal Menggunakan HPLC (High Performance Liquid Chromatography) Tiffany Sabilla Ramadhani 26111486 Jurusan Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Padjadjaran, Jatinangor, Sumedang ABSTRAK Telah dilakukan praktikum penentuan kadar tablet asetosal dengan menggunakan HPLC. Teknik HPLC merupakan suatu metode kromatografi cair-cair, yang dapat digunakan baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Asetosal yang merupakan asam salisilat yang gugus hidroksinya telah teresterkan mudah larut dalam natrium hidroksida dan terhidrolisa dalam basa yang berlebihan pada pemanasan dalam penangas air. Tujuan dari praktikum kali ini adalah memahami cara menetapkan kadar asetosal dengan HPLC dan mengetahui cara optimasi dan validasi dalam HPLC. Didapatkan kadar asetosal dalam tablet adalah 12,725%. Kadar ini tidak sesuai dengan kadar seharusnya, yaitu 33,33%. Kata kunci : HPLC, asetosal, kadar, optimasi. ABSTRACT Has conducted lab assay aspirin tablets using HPLC. HPLC technique is a method of liquid-liquid chromatography, which can be used both for purposes of separation and quantitative analysis. Asetosal which is a salicylic acid group has teresterkan hidroksinya soluble in sodium hydroxide and hydrolyzed in excessive base on heating in a water bath. The purpose of this lab is to understand how to set the levels of aspirin by HPLC and knowing how optimization and validation in HPLC. Asetosal levels obtained in the tablet is 12,725%. This level does not correspond to the level it should be are 33,33%. Keywords: HPLC, aspirin, levels, optimization.
PENDAHULUAN Kromatografi merupakan salah satu metode pemisahan komponen-komponen campuran dimana cuplikan berkesetimbangan diantara dua fasa, yaitu fasa gerak dan fasa diam. Fasa gerak yang membawa cuplikan dan fasa diam yang menahan cuplikan secara selektif. Fasa gerak bergerak melalui fasa diam. Sedangkan fasa diam adalah fasa yang secara tetap tidak bergerak. Prinsip kerja HPLC adalah pemisahan komponen analit berdasarkan kepolarannya, artinya komponen pada suatu analit (sampel) akan terpisah berdasarkan sifat kepolaran masing-masing komponen dalam sampel, apakah kepolarannya lebih mirip dengan fasa diam, maka dia akan tertinggal di fasa diam atau bergerak lebih lambat, ataukah kepolarannya lebih mirip dengan fasa gerak sehingga dia akan bergerak terdistribusi lebih jauh dan lebih cepat(hendayana, 26). Teknik HPLC merupakan satu teknik kromatografi cair- cair yang dapat digunakan baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis kuantitatif dengan teknik HPLC didasarkan kepada pengukuran luas atau area puncak analit dalam kromatogram, dibandingkan dengan luas atau area larutan standar. Pada prakteknya, perbandingan kurang menghasilkan data yang akurat bila hanya melibatkan satu standar, oleh karena itu maka perbandingan dilakukan dengan menggunakan teknik kurva kalibrasi (Veronica, 1999). Prinsip dasar dari HPLC, dan semua metode kromatografi adalah memisahkan setiap komponen dalam sample untuk selanjutnya diidentifikasi (kualitatif) dan dihitung berapa konsentrasi dari masing-masing komponen tersebut (kuantitatif). Analisa kualitatif bertujuan untuk mengetahui informasi tentang identitas kimia dari analat dalam suatu sample. Sedangkan analisa kuantitaif untuk mengetahui jumlah dan konsentrasi analat tersebut dalam sample (Tim kimia, 211). Tablet asetosal disebut juga tablet asam asetilsalisilat atau acidi
acetylosalicylici compressi. Tablet asam asetilsalisilat mengandung asam asetilsalisilat C 9 H 8 O 4 tidak kurang dari 9,% dan tidak lebih dari 11,% dari jumlah yang tertera pada etiket. (Depkes RI, 1995). Asetosal mempunyai pemerian berupa hablur putih,umumya seperti jarum atau lempengan tersusun, atau serbuk hablur putih; tidak berbau atau berbau lemah. Stabil diudara kering; didalam udara lembab secara bertahap terhidrolisa menjadi asam salisilat dan asam asetat (Depkes RI, 1995). Asetosal yang merupakan asam salisilat yang gugus hidroksinya telah teresterkan mudah larut dalam natrium hidroksida dan terhidrolisa dalam basa yang berlebihan pada pemanasan dalam penangas air (Sudjadi dan Rohman A., 24). METODE a. Alat Alat yang digunakan pada praktikum ini adalah batang pengaduk, spatel, gelas beaker, gelas ukur, HPLC, kaca arloji, dan pipet tetes. b. Bahan Bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah air, asam asetat, asam asetilsalisilat, dan metanol. c. Prosedur 1 Pembuatan Fasa Gerak Dibuat campuran larutan dari methanol air dengan perbandingan methanol : air : asam asetat glasial p hingga ph 2,98. 2 Pembuatan Larutan Pengencer Dibuat campuran larutan dari methanol dan air dengan perbandingan 3:7. 3 Pembuatan Larutan Baku Menimbang asam asetil salisilat baku sebanyak 5 mg kemudian dilarutkan dalam larutan pengencer konsentrasi 5 ppm yang dapat diencerkan lagi menjadi 1 ppm untuk laju alir 1ml/menit dan 2 ppm untuk laju alir,75 ml/menit.
4 Preparasi Sampel Tablet Asetosal Dihaluskan 2 tablet asetosal kemudian ditimbang setara dengan 1 mg asetosal yaitu (1/3 x rata-rata tablet), selanjutnya ditambahkan larutan pengencer 1ml (1 ppm), dikocok kuat selama 1 menit dan sentrifus. Diukur dengan seksama sejumlah volume larutan persediaan kemudian encerkan secara kuantitatif dalam pengencer (larutan uji) dibuat 4 ppm yaitu 1 ppm. x = 4 ppm. 5ml sehingga x=,2 ml selanjutnya diinjekan dalam HPLC. 5 Pembuatan Larutan Baku Diencerkan larutan baku 1 ppm kedalam 5 konsentrasi menjadi 1 ppm, 2 ppm, 3 pm, 4 ppm, dan 5 ppm, selanjutnya diinjekan kedalam HPLC dengan fase gerak methanol : air dengan perbandingan 38 : 62 ph 2,98 laju alir 1 ml/ menit. Dilakukan sebanyak 3 kali replikasi dan dibuat persamaan garis terhadap konsentrasi dan AUC. HASIL Peak AuC Rt H Wb 1.1,316 1,88,718 1.2,6196 1,443,764 1,621 2.1,5412 1,32,65 1,78 2.2,1 1,52,5,4 3.1,5295 1,36,577 1,835 3.2,1 1,513,3,667 Perhitungan Wb L= 1 2 Wb 1.1
,316= 1 2.,88.Wb Wb 1.2 =,718,619= 1 2.,764.Wb Wb 2.1 = 1,621,5412= 1 2.,65.Wb Wb 2.2 = 1,78,1= 1 2.,5.Wb Wb 3.1 =,4,5295= 1 2.,577.Wb Wb 3.2 = 1,835,1= 1 2.,3.W b Jumlah N N 1.1 =,667 N 1.1=16[ 1,718 ] 2 3163,6384
N 1.2 N 1.2=16[ 1,446 1,621 ] 2 N 2.1 663,745 N 2.1=16[ 1,326 1,78 ] 2 N 2.2 532,425 N 2.2=16[ 1,52,4 ] 2 N 3.1 116,74 N 3.1=16[ 1,36 1,815 ] 2 N 3.2 312,954 N 3.2=16[ 1,613,667 ] 2 397485,823 Tinggi Plat H 1.1 H 1.1= 1 3163,6384 =,32
H 1.2 H 1.2= 1 663,745 =,15 H 2.1 H 2.1= 1 532,425 =,188 H 2.2 H 2.2= 1 116,74 =,9 H 3.1 H 3.1= 1 312,954 = 6,194 H 3.2 1 H 3.2= 397485,823 SDRT 1 =,25 Rt 1 = 1,2267
SDRT 1 (1 1,2267 )2 +(1,32 1,2267) 2 +(1,36 1,2267) 2 (3 1) =,777 2 =,1971 % SDRT =,1971,2267 x 1 % = 1,927 % SDRT 2 Rt 1 = 1,4933 SDRT 1 (1,447 1,4933 )2 +(1,52 1,4933) 2 +(1,513 1,4933) 2 (3 1) =,16 =,4 % SDRT =,4 1,4933 x 1 % =,383 % AuC AuC 1 AuC 1 =,3674 SDAuC (,3674,3674 )2 +(,5412,3674) 2 +(,5295,3644) 2 (3 1) =,847 =,2911
% AuC =,2911,3674 x 1 % = 79,23% AuC 2 AuC 2 =,26 SDAuC (1,447 1,4933 )2 +(1,52 1,4933) 2 +(1,513 1,4933) 2 (3 1) =,127 =,3576 % AuC =,3576,26 x 1 % = 173,59% 1. R = Resolusi 2( 1,447 1) (,718+1,621) =,382 2. R = 3. R = 2( 1,52 1,32) (1,78+,4) =,219 2( 1,513 1,36) (1,835+,667) =,179 R P R K e a s T % % s n D
ja ol u si n g p la A u C Au I, 6 6 9 t, 8 5 4, 2 x 1-3,9 5 1 II, 7 8, 1 1,3 4 x 1 3, 7-3 III IV V, 7 8, 9 5 5, 8,, 6 5, 1 1 6, 1 9 4,, 4, 1 5, 25 76, 2,2 4,9 17 VI 11 2 34, 1 8 5 8
5 8, VI, 3 3 x 1 -, 9 35, 4 3 5, VI, 1 9 6 x 1 -, 8 75 41, 8 Keterangan : 3 Fase Kond Gerak Laju Alir isi Metan ol : Air ml/enit I 38 : 62,75 II 38 : 62 1 III 3 : 7,75 IV 3 : 7 1 V 25 : 75,75 VI 25 : 75 1 VII 33 : 67,75 VIII 33 : 67 1 Kondisi optimasi yang diambil adalah pada kondisi IV, yaitu pada perbandingan methanol air 3 : 7. Hal ini dikarenakan standar deviasi yang dihasilka lebih kevil dari yang lain sehingga hasil yang diperoleh akan dapat
diterima karena penyimpangan kecil. Dilihat dari resolusi juga lebih tinggi dari yang lain, waktu kondisi 1 x lebih tinggi dari yang lain. Kurva Baku Kons entra Retensi AuC si 5 ppm 11,13,2676 1 ppm 11,27,6213 2 ppm 11,47 1,2437 4 ppm 11,4 2,4119 6 ppm 11,33 3,1119 8 ppm 11,27 5,291 Persamaan garis y =,627 x,234 R 2 =,9993 Tablet Asetosal (4 ppm) Injek Retensi AuC
I 11,7,1779 II 11,67,1181 Kadar I y =,627 x,234,1779 =,627 x,234,672 x =,213 x =,213,67 2 = 2,99 ppm Kadar II y =,627 x,234,1181 =,627 x,234,672 x =,1415 x =,1415,67 2 = 2,1 ppm Pembuatan Larutan Stock Berat rata-rata 2 tablet = 259,7 mg Sampel yang ditimbang = 1 3 x259,7 mg = 86,57 mg Larutan stock 1 ppm = 1 mg 1 ml x 86,57 x = 86,57 ml Karena perbandingan massa : volume = 1 : 1
Pembuatan larutan stock dibuat dengan 1 mg tablet halus dan 1 ml larutan pengencer (5 : 5) Pembuatan Larutan 4 ppm 1 ppm x = 4 ppm. 2 ml = 8 1 =,8 ml Kadar tablet asetosal (%) 2,99+ 2,1 2 = 5,9 ppm % kadar = 5,9 ppm 4 ppm x 1 % = 12,725 % PEMBAHASAN Telah dilakukan praktikum penentuan kadar asetosal dalam tablet asetosal dengan menggunaka instrumen HPLC. Teknik HPLC merupakan satu teknik kromatografi cair- cair yang dapat digunakan baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis kuantitatif dengan teknik HPLC didasarkan kepada pengukuran luas atau area puncak analit dalam kromatogram, dibandingkan dengan luas atau area larutan standar. Prinsip kerja HPLC adalah pemisahan komponen analit berdasarkan kepolarannya, artinya komponen pada suatu analit (sampel) akan terpisah berdasarkan sifat kepolaran masing-masing komponen dalam sampel,
apakah kepolarannya lebih mirip dengan fasa diam, maka dia akan tertinggal di fasa diam atau bergerak lebih lambat, ataukah kepolarannya lebih mirip dengan fasa gerak sehingga dia akan bergerak terdistribusi lebih jauh dan lebih cepat. Asetosal merupakan zat yag memiliki kekhasan dalam gugusnya, yaitu gugus karboksilat. Sehingga dapat dikatakan bahwa asetosal merupakan senyawa yang cenderung polar. Dalam keadaan ini maka digunakan metode fasa balik dimana fasa gerak yang membawa senyawa polar dengan fasa diam non polar. Dalam penggunaan HPLC juga dikenal teknik isokratik dan teknik gradien. Elusi isoktatik adalah elusi yang perbandingannya konstan selama pengukuran berlangsung sedangkan elusi gradien adalah elusi yang komposisi fase geraknya berubah. Asetosal mempunyai pemerian berupa hablur putih,umumya seperti jarum atau lempengan tersusun, atau serbuk hablur putih; tidak berbau atau berbau lemah. Stabil diudara kering; didalam udara lembab secara bertahap terhidrolisa menjadi asam salisilat dan asam asetat. Dalam penentuan kadar zat aktif asetosal harus dilakukan optimasi fasa gerak karena untuk menentukan fasa gerak dan laju alir yang sesuai agar dihasilkan resolusi yang tinggi dan standar deviasi yang seminimal mungkin. Resolusi yang tinggi dan mendekati 1 aka memberikan hasil kadar yang akurat dan presisi. Juga standar deviasi yang minimal mengindikasikan bahwa kesalahan yang
dilakukan pada saat injeksi sampel dapat memiliki kesalahan yang seminimal mungkin. Optimasi fasa gerak adalah dengan menggunakan kombinas antara metanol dengan air. Metanol dan air digunakan dalam penentuan optimasi ini adalah karena sampel yang digunakan adalah sampel asetosal yang memiliki sifat cenderung polar karena memiliki gugus karboksilat. Gugus karboksilat akan melakuka ikatan intermolekul dengan air karena memiliki atom O dan H sehingga membentuk ikatan yang sangat kuat, yaitu ikatan hidrogen. Dalam 9 perbandingan fasa gerak dan laju alir, didapatkan perbandingan fasa gerak dan laju alir yaitu perbandingan metanol dan air 3:7 kemudian laju alir sebanyak 1ml/menit. Optimasi perbandingan ini dipilih karena standar deviasi yang dihasilkan lebih kecil dari yang lain sehingga hasil yang diperoleh akan dapat diterima karena penyimpangan kecil. Dilihat dari resolusi juga lebih tinggi dari yang lain, waktu kondisi 1x lebih tinggi dari yang lain. Selanjutnya adalah dilakukan penentuan kurva kalibrasi. Penentuan kurva kalibrasi adalah untuk menentukan kadar yang sesuai agar dijadikan sebagai acuan untuk penentua kadar seakurat mungkin dengan melakuka multiple injek pada HPLC dan dihasilkan persamaan kurva kalibrasi adalah y =,627 x,234. Hasil ini akan dipakai untuk penentuan kadar asetosal dalam tablet jika sampel asetosal sudah diinjekkan dan dihasilkan waktu retensi dan nilai AUCnya. Persamaan kurva ini merupakan kurva yang cukup ideal dan dapat dipakai karenan nilai regresinya sebesar,993
yang mendekati 1. Nilai tersebut HPLC dapat regresi yang sempurna mendeteksi dalam bentuk adalah 1. kurva dan hasil waktu retensi dan AUC. Teknik Selanjutnya adalah dilakukan preparasi sampel untuk tablet asetosal dengan menimbang tablet asetosal sebanya 2 tablet dan diambil rata-ratanya dan dikalikan terhadap 1 mg/3 mg massa karena kandungan asetosalnya adalah 1 mg dalam 3 mg per tablet. Dan dihasilkan massa yang akan dibuat larutan stok adalah sebanyak 86,57 mg. Kemudian dibuat larutan stok 1 ppm denga dilarutka dalam larutan pengencer metanol:air 5:5. Dikarenakan hasilnya 1:1 maka 1 mg tablet dilarutkan dalam 1 ml larutan pengencer. Kemudian setelah dibuat larutan stok, maka dibuat larutan dengan konsentrasi 4 ppm untuk diinjekkan ke HPLC. Pada konsentrasi HPLC yang digunakan adalah teknik isokratik karena fasa gerak yang tetap dan memiliki kepekaan terhadap temperatur, tekanan, fasa gerak dan fasa diam. Mengingat bahwa asetosal memiliki kepekaan terhadap temperatur jika terlalu tinggi maka akan terjadi hidrolisis. Dilakukan dengan 2x injek pada HPLC dan dihasilkan 2 kurva dan kurva yang kedua yang dibuat parameter pengukuran kadar karena kurvanya memiliki resolusi dan effisiensi yang baik. Dalam injek sampel ini dihasilkan 2 kurva mungkin dikarenakan oleh terjadinya hidrolisis dari asetosal itu sendiri dan terdapat pengotor didalamnya. Dihasilkan waktu retensinya adalah 11,7 dan 11,67
serta AUCnya adalah,1179 dan,1181. Selanjutnya dilakukan pengolahan data dan dihasilkan kadarnya adalah sebanyak 12,725%. Kadar ini merupakan kadar yang tidak sesuai dengan seharusnya, yaitu, 33,33%. Dalam 3 mg tablet terkandung 1 mg asetosal. Ini dapat dikarenakan oleh terhidrolisisnya asetosal. Kesalahan saat produksi juga dapat dijadikan sebagai parameter misalnya adalah pada saat penimbangan terjadi ketidak akuratan data penimbangan, atau mungkin alat penimbangan harus divalidasi karena umurnya sudah lama. Kemudian saat mixing juga jika tidak dilakukan secara hati-hati maka kadar zat aktif bisa berkurang atau bertambah karena adanya pengotor. SIMPULAN 1. Penetapan kadar asetosal dapat dilakukan dengan melakukan penentuan optimasi fasa gerak dengan laju alir yang dioptimasi juga agar mendapatkan resolusi yang tinggi dan standar deviasi yang seminimal mungkin. Kadar asetosal didapatka setelah optimasi fasa gerak setepat mungkin dan dilakukan pembuatan larutan stok tablet asetosal dalam larutan pengencer kemudian dibuat dalam konsentrasi tertentu dan diinjek ke tempat injek di HPLC. Didapatkan kadar dari zat aktif asetosal adalah sebanyak 12,725 dengan menggunakan metode eksternal standar karena standar dan sampel diinjek secara terpisah. Nilai kadar ini tidak sesuai dengan seharusnya, yaitu 33,33%. 2. Cara optimasi fasa gerak adalah dengan cara menetapakan beberapa perbandingan fasa gerak dan
beberapa perbandingan laju alir. Kemudian dilihat masingmasing resolusi dan standar deviasinya. Dipilih resolusi yang tinggi dan standar deviasi yang seminimal mungkin. Kemudian validasi HPLC adalah dengan cara melihat ketepatan data penelitian dan data standar dalam beberapa kali injek DAFTAR PUSTAKA Depkes RI. 1995. Farmakope Indonesia Edisi 4. Jakarta : Departemen Kesehatan RI. Analisa Obat dan Makanan. Yogyakarta : Pustaka Pelajar Hendayana, Sumar. (26). KIMIA PEMISAHAN Metode Kromatografi dan Elektroforensis Modern. Bandung : PT. Remaja Rosdakarya. Tim Kimia Analitik Instrumen. (211). Penuntun Praktikum Kimia Ananlitik Instrumen (KI 431). Bandung : Jurusan Pendidikan Kimia FPMIPA UPI Sudjadi dan Rohman, A. 24.