RENI KASMITA A

ISOLASI, KARAKTERISASI, DAN IDENTIFIKASI MOLEKULER BAKTERI PELARUT FOSFAT (BPF) DARI BEBERAPA SAMPEL TANAH DI BOGOR, NUSA TENGGARA BARAT (NTB), DAN NUSA TENGGARA TIMUR (NTT) RENI KASMITA A14051794 DEPARTEMEN ILMU TANAH DAN SUMBERDAYA LAHAN FAKULTAS PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2010

2 RINGKASAN RENI KASMITA. Isolasi, Karakterisasi, dan Identifikasi Molekuler Bakteri Pelarut Fosfat (BPF) dari Beberapa Sampel Tanah di Bogor, Nusa Tenggara Barat (NTB), dan Nusa Tenggara Timur (NTT). Di bawah bimbingan FAHRIZAL HAZRA dan ETTY PRATIWI. Fosfor (P) merupakan salah satu unsur hara makro yang sangat penting bagi pertumbuhan tanaman, namun kandungannya di dalam tanaman lebih rendah dibanding nitrogen (N), kalium (K), dan kalsium (Ca). Pemupukan fosfat sering tidak efisien karena fosfat terikat dalam bentuk yang tidak tersedia bagi tanaman. Untuk meningkatkan efisiensi pemupukan fosfat, saat ini mulai dikembangkan pemanfaatan mikroba pelarut fosfat, salah satunya adalah bakteri pelarut fosfat (BPF). Pemanfaatan BPF dinilai dapat dijadikan sebagai suatu alternatif yang sangat potensial untuk dikembangkan dalam mencari pemecahan masalah efektivitas ketersediaan unsur P di dalam tanah. Oleh karena itu, dilakukan penelitian ini yang bertujuan untuk melakukan isolasi, karakterisasi, dan identifikasi BPF dari beberapa lokasi di Bogor, Nusa Tenggara Barat (NTB), dan Nusa Tenggara Timur (NTT) yang memiliki kemampuan melarutkan P tertinggi serta mengetahui jenis bakteri tersebut melalui identifikasi molekuler berdasarkan amplifikasi gen 16S rrna. Sampel tanah yang digunakan sebagai sumber isolat BPF diperoleh dari areal Kebun Percobaan IPB Cikabayan (Bogor, Jawa Barat), Citeureup (Bogor, Jawa Barat), Nusa Tenggara Barat (NTB), dan Nusa Tenggara Timur (NTT). Kegiatan penelitian dilakukan dalam beberapa tahap, yaitu isolasi BPF dalam medium Pikovskaya, karakterisasi dan pengujian BPF dalam melarutkan P, pengujian BPF dalam menghasilkan enzim fosfatase dan zat pemacu tumbuh indole acetic acid (IAA), serta pewarnaan Gram. Tiga isolat unggul terpilih, yaitu P 3.5 (NTT), P 6.2 (NTB), dan P 10.1 (Citeureup, Bogor). Selanjutnya terhadap ketiga isolat terpilih tersebut dilakukan beberapa pengukuran, yaitu pengukuran pertumbuhan populasi, perubahan ph pada medium Pikovskaya cair, pengujian BPF dalam menghasilkan enzim fosfatase, dan identifikasi molekuler. Berdasarkan hasil isolasi sampel tanah Kebun Percobaan IPB Cikabayan, Citeureup, NTB, dan NTT diperoleh 29 isolat BPF. Isolat P 10.1 memiliki kemampuan melarutkan P tertinggi dengan indeks pelarutan (IP) terbesar, yaitu 1.80, enzim fosfatase tertinggi (120.40 ppm), dan penurunan ph tertinggi pada setiap pengamatan. Isolat P 3.5 dan isolat P 10.1 merupakan bakteri Gram negatif berbentuk kokus atau bulat, sedangkan isolat P 6.2 merupakan bakteri Gram negatif berbentuk basilus atau batang. Hasil amplifikasi DNA BPF menggunakan primer F-63 (5 -CAGGCCTAACACATGCAAGTC) dan primer R-1387 (5 - GGGCGGCGTGTACAAGGC) menghasilkan satu amplikon atau produk PCR berukuran sekitar 1300 bp. Hasil analisis sekuen gen 16S rrna menunjukkan bahwa isolat P 3.5 dan isolat P 10.1 memiliki kemiripan sebesar 98% dengan Gluconacetobacter sp. strain Rh1-MS-CO sedangkan isolat P 6.2 memiliki kemiripan sebesar 97% dengan Enterobacter sp. strain pp9c. Kata kunci : isolasi, bakteri pelarut fosfat (BPF), enzim fosfatase, indole acetic acid (IAA), identifikasi 16S rrna

3 SUMMARY RENI KASMITA. Isolation, Characterization, and Molecular Identification of Phosphate Solubilizing Bacteria (PSB) from Some Soil Samples in Bogor, West Nusa Tenggara, and East Nusa Tenggara. Supervised by FAHRIZAL HAZRA and ETTY PRATIWI. Phosphorus (P) is one of the macro nutrients essential for plant growth, but its contents in the plants was lower than nitrogen (N), potassium (K), and calcium (Ca). Phosphate fertilization is often inefficient because the phosphate are fixed by soil so that is not available for plants. To transform the insoluble forms of phosphorus into soluble forms, phosphate solubilizing bacteria (PSB) would be essential. These soil bacteria are capable of solubilizing insoluble compounds and release phosphorus to soil solution. The objectives of this research are: (i) to isolate and characterize of PSB and (ii) to identify of these bacteria based on molecular amplification of 16S rrna gene. Soil samples were collected from rhizosphere in Bogor, West Nusa Tenggara, and East Nusa Tenggara. Several stages in this research are: (i) isolation PSB in Pikovskaya agar, (ii) morphological and biochemical characterization of PSB, (iii) measurement of phosphatase enzymes, and (iv) measurement of secreting indole acetic acid phytohormone. We have collected 29 isolates of PSB and three isolates of them, namely: P 3.5 (East Nusa Tenggara), P 6.2 (West Nusa Tenggara), and P 10.1 (Citeureup, West Java) were chosen for further study. There are many characteristics of isolate P 10.1: (i) it has capable to solubilize P with the value of highest solubilization index (1.80), (ii) it has the highest phosphatase enzyme (120.40 ppm), and (iii) it has the highest ph decrease at each observation for six days. Isolates P 3.5 and P 10.1 are the Gram-negative bacteria with coccus shapes and isolate P 6.2 is a Gram-negative bacteria with bacillus shape. DNA amplification of these bacteria employing 16S rrna primers generated the 1300bp-PCR product. The results of the analysis of 16S rrna gene sequences showed that isolates P 3.5 and P 10.1 has 98% similarity with Gluconacetobacter sp. strains Rg1-MS-CO and isolate P 6.2 has 97% similarity with Enterobacter sp. pp9c strains. Keywords : isolation, phosphate solubilizing bacteria (PSB), phosphatase enzymes, indole acetic acid, identification 16S rrna

4 ISOLASI, KARAKTERISASI, DAN IDENTIFIKASI MOLEKULER BAKTERI PELARUT FOSFAT (BPF) DARI BEBERAPA SAMPEL TANAH DI BOGOR, NUSA TENGGARA BARAT (NTB), DAN NUSA TENGGARA TIMUR (NTT) RENI KASMITA A14051794 Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Pertanian pada Fakultas Pertanian Institut Pertanian Bogor DEPARTEMEN ILMU TANAH DAN SUMBERDAYA LAHAN FAKULTAS PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2010

5 Judul Skripsi Nama NIM : Isolasi, Karakterisasi, dan Identifikasi Molekuler Bakteri Pelarut Fosfat (BPF) dari Beberapa Sampel Tanah di Bogor, Nusa Tenggara Barat (NTB), dan Nusa Tenggara Timur (NTT) : Reni Kasmita : A14051794 Menyetujui Pembimbing I, Pembimbing II, (Ir. Fahrizal Hazra, M.Sc) (Dr. Ir. Etty Pratiwi, M.Si) NIP. 19631120 198903 1 002 NIP. 19630419 199203 2 001 Mengetahui : Ketua Departemen (Dr. Ir. Syaiful Anwar, M.Sc) NIP. 19621113 198703 1 003 Tanggal Lulus :

6 RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 21 September 1987. Penulis merupakan anak keempat dari lima bersaudara pasangan Bapak Zubir Siak dan Ibu Yusmarni. Penulis mengawali pendidikan di SD Negeri Cakung Barat 013 Pagi, Jakarta Timur pada tahun 1993. Pada tahun 2000, penulis melanjutkan pendidikan di SMP Negeri 144 Jakarta Timur. Pendidikan sekolah menengah atas ditempuh penulis di SMA Negeri 89 Jakarta Timur pada tahun 2002. Pada tahun 2005, penulis diterima sebagai mahasiswa Institut Pertanian Bogor melalui jalur Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru (SPMB). Pada tahun 2006, melalui program Mayor-Minor penulis diterima di Mayor Manajemen Sumberdaya Lahan, Departemen Ilmu Tanah dan Sumberdaya Lahan, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Selama menjadi mahasiswa di Institut Pertanian Bogor, penulis aktif dalam organisasi, yaitu Himpunan Mahasiswa Ilmu Tanah (HMIT) pada tahun 2007 sampai 2008. Penulis juga aktif mengikuti seminar dan menjadi panitia berbagai kegiatan diantaranya, yaitu Seminar Nasional Evaluasi Sewindu Reformasi, Pelatihan Program Kreativitas Mahasiswa (PPKM), Workshop Penulisan Karya Tulis Ilmiah, panitia Masa Perkenalan Departemen (MPD) Ilmu Tanah dan Sumberdaya Lahan pada tahun 2007, panitia Masa Perkenalan Fakultas (MPF) Pertanian pada tahun 2007, panitia Seminar Nasional Soil and Mining pada tahun 2008, dan panitia kegiatan bakti lingkungan Water Concervation Campaign dalam rangka memperingati Hari Air Sedunia. Selama menjadi mahasiswa penulis mendapatkan beasiswa Bantuan Belajar Mahasiswa (BBM). Penulis juga menjadi asisten praktikum mata kuliah Bioteknologi Tanah pada tahun 2008.

i KATA PENGANTAR Puji syukur penulis ucapkan kepada Allah SWT atas rahmat dan hidayahnya sehingga penulisan skripsi dengan judul Isolasi, Karakterisasi, dan Identifikasi Molekuler Bakteri Pelarut Fosfat (BPF) dari Beberapa Sampel Tanah di Bogor, Nusa Tenggara Barat (NTB), dan Nusa Tenggara Timur (NTT) ini bisa diselesaikan dengan baik. Skripsi ini disusun sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Pertanian di Departemen Ilmu Tanah dan Sumberdaya Lahan, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Selesainya penelitian ini tentunya tidak terlepas dari bantuan dan dukungan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis ingin mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya pada : 1. Ir. Fahrizal Hazra, M.Sc dan Dr. Ir. Etty Pratiwi, M.Si selaku dosen pembimbing skripsi yang telah membimbing dengan penuh kesabaran dan ketulusan, sehingga penulis berhasil menyelesaikan penelitian dan skripsi ini dengan baik. 2. Dr. Ir. Dwi Andreas Santosa, M.Sc selaku dosen penguji yang telah bersedia meluangkan waktu dan memberi banyak masukkan bagi penulis. 3. Papa dan Mama tercinta, Bang Indra dan Mba Diyah, Bang Andre dan Mba Fany, Kak Ita, adikku Ibnu, dan keponakanku Queenza serta seluruh keluarga besar yang telah memberikan kasih sayang, perhatian, dukungan, semangat, dan telah mengajarkan arti hidup yang sebenarnya sehingga penulis bisa menjalani hidup dengan lebih baik. A Eko untuk perhatian, dukungan, semangat, serta kesabarannya hingga penelitian dan skripsi ini selesai. 4. Dr. Ir. Komaruddin Idris, MS selaku dosen pembimbing akademik yang telah memberikan bimbingan kepada penulis selama masa perkuliahan. 5. Seluruh staf Laboratorium Mikrobiologi, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian (BB.Biogen) : Ibu Susi, Ibu Selly, Ibu Titi, Ibu Aminah, Pak Jajang, Pak Eep, Ibu Yuli, dan Mas Alam yang telah memberikan bantuan dalam pelaksanaan penelitian ini. 6. Seluruh staf Laboratorium Bioteknologi Tanah dan staf Departemen Ilmu Tanah dan Sumberdaya Lahan : Ibu Asih, Ibu Julaeha, Pak Sarjito, Mba

ii Hesti, Mba Iko, Ibu Tini atas dukungan dan bantuannya. Semua temanteman Laboratorium Bioteknologi Tanah dan teman-teman MSL khususnya MSL 42 : Dena, Ali, dan lainnya terima kasih atas dukungan dan kebersamaannya selama ini. 7. Sahabat-sahabatku : Shanty, Linda, Rizma, dan Nana. Kalian semua telah menorehkan warna indah dalam hidupku. Teman seperjuangan penelitian dan satu pembimbing : Xenia, Andri, dan Adi. Semoga kebersamaan ini tidak hanya sampai disini dan bisa berlanjut sampai kapan pun. Temanteman kostan Mega : Mba Ririn, Mba Mona, Mba Tuti, Mba Vivin, Eno, Mpit, Mila, Esti, dan Della yang telah memberikan bantuan, dukungan, semangat, dan perhatiannya selama ini. Serta semua pihak yang tidak bisa disebutkan satu persatu yang telah membantu dalam pelaksanaan penelitian ini. Akhir kata, penulis sangat menyadari bahwa tulisan ini sangat jauh dari sempurna. Namun demikian, penulis berharap tulisan ini akan bermanfaat dan dapat dijadikan sebagai salah satu kajian awal yang dapat menginspirasi penelitian-penelitian berikutnya yang lebih baik. Terima kasih. Bogor, Februari 2010 Penulis

iii DAFTAR ISI Halaman KATA PENGANTAR... i DAFTAR TABEL... v DAFTAR GAMBAR... vi DAFTAR LAMPIRAN... vii I. PENDAHULUAN... 1 1. 1. Latar Belakang... 1 1. 2. Tujuan... 2 II. TINJAUAN PUSTAKA... 3 2. 1. Senyawa P di Dalam Tanah... 3 2. 1. 1. P-Organik... 4 2. 1. 2. P-Anorganik... 4 2. 2. Peranan P Dalam Tanaman... 5 2. 3. Bakteri Pelarut Fosfat (BPF)... 6 2. 4. Deoxyribonucleic Acid (DNA)... 8 2. 5. Identifikasi Molekuler melalui Amplifikasi Gen 16S rrna... 8 2. 6. Elektroforesis Gel Agarosa... 9 2. 7. Polymerase Chain Reaction (PCR)... 10 III. BAHAN DAN METODE... 13 3. 1. Tempat dan Waktu Penelitian... 13 3. 2. Bahan dan Alat... 13 3. 3. Metode Penelitian... 14 3. 3. 1. Isolasi Bakteri Pelarut Fosfat dari Tanah di sekitar Perakaran (Rizosfer)... 14 3. 3. 2. Karakterisasi dan Pengujian Kemampuan Bakteri Pelarut Fosfat dalam Melarutkan P... 14 3. 3. 3. Pengujian Bakteri Pelarut Fosfat dalam Menghasilkan Enzim Fosfatase... 15 3. 3. 4 Pengujian Bakteri Pelarut Fosfat dalam Menghasilkan Zat Pemacu Tumbuh Indole Acetic Acid (IAA).... 16 3. 3. 5 Pengujian Pewarnaan Gram Bakteri Pelarut Fosfat... 17 3. 3. 6. Pengukuran Pertumbuhan Populasi, ph, dan Kandungan Enzim Fosfatase Bakteri Pelarut Fosfat... 17 3. 3. 7. Identifikasi Molekuler... 18 IV. HASIL DAN PEMBAHASAN... 21 4. 1. Isolasi Bakteri Pelarut Fosfat... 21 4. 2. Karakteristik dan Kemampuan Bakteri Pelarut Fosfat dalam Melarutkan P... 22

iv 4. 3. Kemampuan Bakteri Pelarut Fosfat dalam Menghasilkan Enzim Fosfatase dan Zat Pengatur Tumbuh Indole Acetic Acid (IAA) serta Karakterisasi Pewarnaan Gram... 25 4. 4. Pertumbuhan Populasi, ph, dan Kandungan Enzim Fosfatase Bakteri Pelarut Fosfat Terpilih... 30 4. 5. Identifikasi Molekuler Bakteri Pelarut Fosfat... 34 4. 5. 1. Isolasi DNA... 34 4. 5. 2. Elektroforesis Gel Agarosa... 36 4. 5. 3. Amplifikasi Gen 16S rrna... 36 4. 5. 4. Sekuensing DNA Bakteri Pelarut Fosfat... 37 V. KESIMPULAN DAN SARAN... 41 5. 1. Kesimpulan... 41 5. 2. Saran... 41 VI. DAFTAR PUSTAKA... 42 LAMPIRAN... 45