BAB III METODOLOGI PENELITIAN A. Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilakukan di Laboratorium Kimia Analisis Universitas Muhammadiyah Purwokerto selama 4 bulan. Penelitian dilaksanakan dari bulan Maret hingga bulan Juni 2011. B. Alat dan Bahan 1. Alat Spektrofotometer (Shimadzu type UV-1800), alat-alat gelas (Iwaki pyrex), timbangan analitik (Shimadzu type AY220), kertas wathman 40, pro pipet, Silika gel 60 F 254, Chamber KLT. 2. Bahan Hidrokuinon baku (Merck), krim malam pemutih, metanol p.a (Merck), kloroform p.a (Merck), etanol 95% p.a (Merck), floroglusin p.a (Merck), NaOH p.a (Merck), akuadestilata. C. Batasan Variabel Operasional 1. Variable bebas : Sampel Krim malam pemutih 2. Variable kontrol :Baku hidrokuinon, waktu pemanasan, suhu pemanasan, konsentrasi NaOH, Jumlah pereaksi floroglusin, Operating time. 3. Variable tergantung : Kadar hidrokuinon dalam krim malam pemutih di klinik kecantikan Purwokerto. D. Metode sampling Dari hasil survei yang dilakukan penulis ada 11 klinik kecantikan yang menjual krim malam pemutih di kota Purwokerto, sampel yang diambil dengan metode simple random sampling yaitu pengambilan sampel krim malam pemutih secara acak tanpa memperhatikan tempat penjualannya. Setiap sampel krim malam pemutih dari tiap-tiap klinik kecantikan memiliki peluang yang sama untuk digunakan dalam penelitian
( Sugiyono, 2004). Rumus penentuan jumlah sampel : n = 1 + N n = jumlah sampel yang diambil N =jumlah sampel yang ada (11) (Badan Pengawas Obat dan Makanan, 2001) Dari hasil perhitungan menggunakan rumus penentuan jumlah sampel diatas dengan jumlah sampel yang ada yaitu 11 maka diperoleh jumlah sampel yang diambil sebanyak 4 sampel. E. Metode Kerja 1. Uji Kualitatif Dengan KLT a. Pembuatan fase gerak Fase gerak dibuat dari campuran metanol dan kloroform dengan perbandingan 1:1. Mengambil sebanyak 10 ml metanol dan 10 ml kloroform, kemudian kedua larutan tersebut dicampur sehingga diperoleh fase gerak. Campuran larutan tersebut dimasukkan ke dalam chamber, lalu chamber tersebut ditutup. Selanjutnya fase gerak tersebut didiamkan dalam chamber hingga chamber terjenuhi oleh fase gerak. b. Pembuatan larutan baku hidrokuinon 1000 ppm Menimbang secara seksama sebanyak 100 mg hidrokuinon baku kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml. Selanjutnya dilarutkan dengan etanol 95% sampai dengan tanda batas. Sehingga didapat larutan baku hidrokuinon dengan konsentrasi 1000 ppm. c. Penyiapan sampel Sampel sebanyak 1 gram krim dilarutkan dengan 5 ml etanol 95% kemudian disaring dan filtrate yang diperoleh dimasukan kedalam labu takar 10 ml dan ditambahkan dengan etanol 95% hingga volume tepat 10 ml. d. Uji dengan KLT Mengambil larutan baku hidrokuinon dan larutan sampel menggunakan pipa kapiler, kemudian masing-masing ditotolkan pada lempeng KLT yang telah diaktifkan. Selanjutnya lempeng KLT dikeringanginkan hingga pelarut menguap.
Lempeng KLT yang telah kering tersebut dimasukan ke dalam chamber yang telah dijenuhi oleh fase gerak. Fase gerak dibiarkan bergerak naik sampai batas elusi. Kemudian tinggi bercak yang muncul pada masing-masing totolan diamati. Tinggi bercak yang muncul digunakan untuk menghitung nilai Rf, dan kemudian nilai Rf sampel dibandingkan dengan nilai Rf baku hidrokuinon. 2. Uji Kuantitatif Dengan Spektrofotometri UV-Vis a. Pembuatan larutan baku hidrokuinon 1000 ppm Sebanyak 100 mg Hidrokuinon baku dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml dan dilarutkan dalam etanol 95% sampai volumenya tepat 100 ml sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 1.000 ppm. Larutan tersebut digunakan untuk membuat seri konsentrasi. b. Pembuatan seri konsentrasi Mengambil larutan baku dengan konsentrasi 1000 ppm sebanyak 10 ml kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml, lalu ditambahkan dengan etanol 95% hingga volumenya tepat 100 ml sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 100 ppm. Dari larutan dengan konsentrasi 100 ppm, diambil sebanyak 0,8, 1, 1,2, 1,4, 1,6, 1,8 dan 2 ml lalu dimasukkan ke dalam labu takar 10 ml dan ditambahkan dengan etanol 95% hingga volumenya tepat 10 ml. Seri konsentrasi yang diperoleh yaitu 8, 10, 12, 14, 16, 18, dan 20 ppm. c. Pembuatan Larutan Floroglusin 1% Menimbang secara seksama floroglusin sebanyak 1 gram. floroglusin yang telah ditimbang lalu dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml, kemudian ditambahkan dengan etanol 90% hingga volumenya tepat 100 ml sehingga didapat larutan floroglusin 1% (Departemen Kesehatan RI, 1979). d. Pembuatan NaOH 0,5 N Menimbang secara seksama 20 gram NaOH kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 1000 ml. Selanjutnya ditambahkan dengan akuadestilata hingga volumenya tepat 1000 ml (Departemen Kesehatan RI, 1979). e. Penentuan panjang gelombang maksimum
Larutan hidrokuinon dengan konsentrasi 10 ppm sebanyak 5 ml dalam tabung reaksi ditambahkan dengan 1 ml pereaksi floroglusin 1% dan 1 ml NaOH 0,5 N, kemudian dipanaskan dalam penangas air pada suhu 70 o C selama 50 menit. Larutan tersebut didinginkan dalam air bersuhu 25 o C, kemudian ditambahkan dengan etanol 95% hingga volumenya 10 ml dalam labu takar. Larutan dikocok hingga tercampur sempurna. Selanjutnya dibaca absorbansi larutan tersebut pada panjang gelombang 400-800 nm sehingga diperoleh panjang gelombang maksimum. f. Penentuan Operating Time Larutan hidrokuinon dengan konsentrasi 10 ppm sebanyak 5 ml dimasukan ke dalam lima tabung reaksi kemudian ditambahkan dengan 1 ml pereaksi floroglusin 1% dan 1 ml NaOH 0,5 N, kemudian dipanaskan dalam penangas air pada suhu 70 o C selama 50 menit. Larutan tersebut kemudian didinginkan dalam air bersuhu 25 o C, kemudian campuran larutan ditambahkan dengan etanol 95% hingga volumenya 10 ml dalam labu takar. Selanjutnya dibaca absorbansinya pada menit ke 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 dan 18 pada panjang gelombang maksimum sehingga didapat operating time. g. Penentuan kurva baku Mengambil larutan hidrokuinon dengan konsentrasi 8, 10, 12, 14, 16, 18, dan 20 ppm masing-masing sebanyak 5 ml lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan dengan 1 ml pereaksi floroglusin 1% dan 1 ml larutan NaOH 0,5 N lalu dipanaskan dalam penangas air pada suhu 70 o C selama 50 menit. Larutan tersebut kemudian didinginkan dalam air bersuhu 25 o C, selanjutnya campuran larutan ditambahkan dengan etanol 95% hingga volumenya 10 ml dalam labu takar. Selanjutnya didiamkan selama operating time dan masing-masing larutan dibaca absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang maksimum. Hasil absorbansi yang diperoleh pada masing-masing konsentrasi diplotkan ke dalam regresi linier sehingga diperoleh persamaan kurva baku yaitu Y= bx + a. Persamaan kurva baku yang diperoleh akan menjadi dasar dalam perhitungan kadar.
h. Validasi Metode 1. Ketelitian ( precision) Larutan baku hidrokuinon dengan konsentrasi 10 ppm sebanyak 5 ml dimasukan kedalam enam tabung reaksi. Kemudian larutan tersebut masingmasing ditambahkan dengan 1 ml larutan floroglusin 1% dan 1 ml NaOH 0,5 N, lalu dipanaskan pada suhu 70 o C selama 50 menit. Tabung reaksi kemudian didinginkan dalam air bersuhu 25 o C, selanjutnya campuran larutan ditambahkan dengan etanol 95% hingga volumenya 10 ml dalam labu takar. Selanjutnya didiamkan pada operating time dan masing-masing larutan dibaca absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang maksimum. 2. Linearitas ( Linearity ) Hasil absorbansi yang diperoleh dari kurva baku diplotkan kedalam regresi linier sehingga diperoleh persamaan kurva baku dan koefisien korelasinya (r). Nilai r yang diperoleh menunjukan linieritas. 3. LOD &LOQ (Limit of Detection and Limit of Quantitation) Batas deteksi dan batas kuantitasi dapat dihitung secara statistik melalui persamaan garis linear dari kurva baku. Dengan menggunakan kurva kalibrasi Y= bx+a, dan persamaan untuk nilai Y pada batas deteksi : y = Y B + 3 S B, maka LOD dapat dihitung. Untuk menentukan batas kuantitasi maka dihitung nilai Y pada batas kuantitasi dengan persamaan y = Y B + 10 S B, maka LOQ dapat dihitung. 4. Ketepatan ( Accuracy ) Dilakukan penimbangan sampel krim secara duplo. Menimbang sebanyak 0,5 gram krim. Pada penimbangan yang pertama ditambahkan hidrokuinon baku sebanyak 2 ml dengan konsentrasi 1000 ppm, pada penimbangan kedua tidak ditambahkan baku hidrokuinon. Selanjutnya kedua sampel tersebut masingmasing dilarutkan dengan 5 ml etanol 95% kemudian disaring ke dalam labu takar 10 ml dan ditambahkan dengan etanol 95% hingga mencapai tanda
batas. Dari larutan tersebut dipipet 1 ml dan dimasukan kedalam labu takar 10 ml dan ditambahkan etanol 95% sampai tanda batas. Dari larutan ini dipipet lagi 1 ml dimasukan dalam labu takar 10 ml, ditambahkan etanol 95% hingga garis tanda. Kemudian larutan tersebut diambil sebanyak 5 ml dan dimasukan ke dalam tabung reaksi lalu ditambahkan dengan 1 ml larutan floroglusin 1% dan 1 ml NaOH 0,5 N, lalu dipanaskan pada suhu 70 o C selama 50 menit. Tabung reaksi kemudian didinginkan dalam air bersuhu 25 o C, selanjutnya campuran larutan ditambahkan dengan etanol 95% hingga volumenya 10 ml dalam labu takar. Kemudian didiamkan pada operating time dan dibaca absorbansinya menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang maksimum. Masing-masing penimbangan direplikasi tiga kali. Hasil absorbansi digunakan untuk menghitung harga perolehan kembali ( recovery ). i. Penetapan Kadar Hidrokuinon dalam Krim Menimbang 0,5 gram sampel krim. Kemudian dilarutkan dalam 5 ml etanol 95%, disaring dengan kertas saring kedalam labu takar 10 ml dan ditambahkan etanol 95% sampai tanda batas.larutan tersebut dipipet sebanyak 1 ml dan dimasukan kedalam labu takar 10 ml, ditambahkan dengan etanol 95% sampai garis tanda. Dari larutan tersebut dipipet lagi sebanyak 1 ml dan dimasukan dalam labu takar 10 ml lalu ditambahkan dengan etanol 95% hingga mencapai garis tanda. Larutan tersebut diambil sebanyak 5 ml dan dimasukan ke dalam tabung reaksi lalu ditambahkan dengan 1 ml larutan floroglusin 1% dan 1 ml NaOH 0,5 N, lalu dipanaskan pada suhu 70 o C selama 50 menit. Tabung reaksi kemudian didinginkan dalam air bersuhu 25 o C, selanjutnya campuran larutan ditambahkan dengan etanol 95% hingga volumenya 10 ml dalam labu takar. Kemudian didiamkan pada operating time dan dibaca absorbansinya menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang maksimum. Masing-masing sampel direplikasi tiga kali.