20 METODE Waktu dan Tempat Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Kimia Pangan dan Laboratorium Pengolahan Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan Institut Pertanian Bogor, serta Laboratorium Ruminansia Besar Departemen Ilmu Produksi Ternak Institut Pertanian Bogor. Penelitian dilaksanakan mulai bulan Desember 2008 sampai dengan Desember 2009. Bahan dan Alat Bahan utama yang digunakan pada penelitian ini adalah bunga cengkeh kering, daging sapi, daging ayam serta antioksidan sintetis BHA dan BHT. Bahan kimia yang dibutuhkan untuk ekstraksi dan analisa adalah etanol, metanol, DPPH (2,2-diphenyl-1-pycrylhydrazyl), HCl, kloroform, asam asetat glasial, KI, Na 2 S 2 O 3, TBA, standar internal C17 (heptadecanoic acid), NaOH, Na 2 SO4, boron trifluorida, NaCl, NaOH, Na 2 SO4, CUSO 4. Sedangkan peralatan yang digunakan adalah timbangan analitik, ultra turax, sentrifuse, blender, spektrofotometer, waterbath, ph meter, penetrometer, alat penggiling daging, kertas saring, cawan porselen dan alat-alat gelas untuk analisa. Metode Penelitian Penelitian dilaksanakan dalam 2 tahap. Penelitian tahap pertama mencakup ekstraksi antioksidan dari bunga cengkeh kering dan analisa aktivitas antioksidannya dengan metode DPPH, sedangkan penelitian tahap kedua mencakup penentuan konsentrasi ekstrak etanol cengkeh yang akan ditambahkan pada sosis dengan uji organoleptik dan aplikasi konsentrasi terpilih. Sebelum penyimpanan dilakukan analisis proksimat, sedangkan selama penyimpanan dilakukan analisis bilangan peroksida, bilangan TBA, profil asam lemak dan total mikroba.
21 Persiapan Sampel Bunga cengkeh kering disortasi. Kemudian dihaluskan dengan blender dan diayak menggunakan saringan 32 mesh. Sampel yang sudah halus dimasukkan dalam plastik dan disimpan pada suhu ruang sebelum diekstrak antioksidannya. Ektraksi Antioksidan Cengkeh Ekstraksi komponen antioksidan cengkeh dilakukan menurut metode Gulcin et al. (2004). Sebanyak 20 gram bubuk cengkeh dicampurkan dengan 400 ml etanol dan dipanaskan pada suhu 70 o C selama 2 jam sambil diaduk. Campuran kemudian disaring dengan saringan vakum menggunakan kertas saring Whatman No.1. Etanol diuapkan dengan vakum evaporator pada suhu 50 o C, hingga dihasilkan ektrak pekat. Ekstrak dimasukkan dalam botol gelap dan disimpan dalam lemari pembeku (-10 o C). Diagram alir proses ekstraksi antioksidan cengkeh dapat dilihat pada (Gambar 4). Pengujian Aktivitas Antioksidan Pengujian aktivitas antioksidan dilakukan dengan metode DPPH menurut Gulcin et al. (2004). Aktivitas antioksidan dari ekstrak cengkeh ditentukan dengan mengukur konsentrasi radikal bebas DPPH sebagai berikut: sebanyak 1 ml ekstrak cengkeh ditambahkan 3.9 ml larutan DPPH (0.025g/l) dalam metanol, kemudian dikocok. Absorbansi diukur setelah 30 menit pada temperatur ruang pada panjang gelombang 517 nm. Sebagai blanko digunakan metanol dengan pengerjaan yang sama seperti tersebut di atas. BHA dan BHT digunakan sebagai kontrol positif. Aktivitas antioksidan ditentukan dengan menghitung persentase penghambatan dari ekstrak cengkeh pada tiap-tiap konsentrasi dan selanjutnya ditentukan nilai IC 50 nya. Aktivitas Penghambatan DPPH (%) = A 0 - A 1 x 100 Dimana: A 0 = Absorban tanpa esktrak A 1 = Absorban dengan esktrak A 0
22 IC 50 adalah konsentrasi ektrak cengkeh yang dapat menghambat 50% radikal DPPH. Nilai IC 50 ditentukan dengan menggunakan persamaan regresi antara konsentrasi ekstrak cengkeh dengan % penghambatan terhadap radikal DPPH (Dasgupta dan Bratati, 2004). Bubuk cengkeh (20 g) Ditambahkan etanol 96% (400 ml) Dipanaskan pada suhu 70 0 C, selama 2 jam sambil dikocok Disaring dengan kertas Whatman No. 1 Dievaporasi dengan vakum evaporator pada suhu 50 0 C Uji aktivitas antioksidan Ekstrak pekat cengkeh Aplikasi pada sosis Gambar 4 Diagram alir proses ekstraksi antioksidan cengkeh Pembuatan Sosis Sapi Daging sapi (daging ayam yang telah dibuang tulangnya) dipotong-potong dan dicuci. Curing dengan menambahkan nitrat dan garam selama lebih kurang 24 jam pada suhu 4 o C. Selanjutnya daging dicuci dan digiling dengan alat penggiling daging (grinder). Daging giling dicampur dengan bahan-bahan selain
23 daging seperti minyak sawit (5%), garam (1.5%) dan STPP (0.5%), tepung tapioka (10%), susu skim (3.5%), es dan air es (30%), bumbu-bumbu (2%) dan ektrak cengkeh (200, 500, 800 dan 1000 ppm). Sosis tanpa penambahan ekstrak cengkeh digunakan sebagai kontrol, sedangkan campuran antioksidan sintetis BHA+ BHT dengan perbandingan 1:1 sebanyak 200 ppm digunakan sebagai pembanding positif. Setelah bahan-bahan tercampur sempurna, lalu dimasukkan ke dalam selongsong sintetis. Sosis dimasak dalam air panas pada suhu sekitar 85-90 o C selama 45 menit. Setelah selesai pemasakan, sosis didinginkan secara cepat dan dikemas vakum. Selanjutnya dilakukan uji organoleptik. Proses pembuatan sosis dapat dilihat pada Gambar 5, sedangkan formulasi yang digunakan dalam pembuatan sosis terinci pada Tabel 6. Tabel 6 Formulasi dasar dalam pembuatan sosis. Komposisi Jumlah (%) Daging 100 Komponen selain daging (dari berat daging) Minyak Nabati 5 Es dan air es 30 Tepung Tapioka 10 Susu Skim 3.5 STPP 0.5 Garam 3 Bawang putih 1 Merica 0.5 Jahe 0.5 Uji Organoleptik Uji organoleptik dilakukan pada sosis sebelum penyimpanan dengan tujuan untuk menentukan konsentrasi ekstrak cengkeh yang dapat ditambahkan pada sosis. Uji organoleptik menggunakan uji hedonik terhadap atribut rasa dan aroma sosis menggunakan 30 orang panelis. Skala penilaian 1-5, dimana kriteria penilainnya adalah (1) sangat tidak suka, (2) tidak suka, (3) biasa, (4) suka, (5) sangat suka. Konsentrasi terpilih adalah yang memiliki skor rata-rata 3-5.
24 Daging sapi/ayam Pemotongan Pencucian Nitrat 0.2 μg/g, Garam 1.5% Curing (4 0 C, 24 jam) Pencucian Es dan Air es, Garam, Bumbu, Skim, Tapioka, Minyak Penggilingan Pencampuran Pengisian casing (p 10 cm, d 1.5 cm) Ekstrak cengkeh, BHA, BHT Pemasakan 85-90 0 C, 45 menit Sosis masak Pengemasan vakum Penyimpanan Gambar 5 Diagram alir aplikasi ekstrak cengkeh pada sosis.
25 Pengujian Mutu Sosis Pengujian mutu dilakukan pada sosis sapi dan sosis ayam setelah ditambahkan ekstrak cengkeh pada konsentrasi terpilih hasil uji organoleptik. Analisis meliputi pengukuran bilangan peroksida, bilangan TBA dan profil asam lemak selama penyimpanan yang bertujuan untuk melihat pengaruh penambahan ekstrak cengkeh terhadap penghambatan oksidasi lemak sosis. Analisis proksimat sebelum penyimpanan dan analisis total mikroba, bertujuan untuk mengetahui apakah sosis yang dihasilkan memenuhi syarat mutu sosis menurut SNI Tahun 1995. Pengamatan dilakukan pada hari ke-1, 4, 6, 8, 10, 12 dan 14 untuk sosis yang disimpan pada suhu dingin (4 o C), sedangkan untuk sosis yang disimpan pada suhu beku (-10 o C), pengamatan dilakukan pada hari ke-1, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49 dan 56. Prosedur Pengujian Mutu Bilangan Peroksida a. Ekstraksi Lemak Ekstraksi lemak dan penentuan bilangan peroksida dilakukan menurut metode dari Aguirrezabal et al. (2000). Sampel sebanyak 10 g dihomogenisasi dengan 100 ml kloroform menggunakan ultra turax 3x30 detik. Selanjutnya disaring dengan kertas Whatman No. 1. Tambahkan 20 ml air ke dalam filtrat, diamkan pada suhu ruang hingga terjadi pemisahan fase kloroform. Fase kloroform dikumpulkan dalam labu terpisah dan ditambahkan 1 g Na 2 SO 4, sentrifuse selama 5 menit pada 2100g. Ekstrak lemak selanjutnya dianalisis bilangan peroksidanya. b. Penentuan Bilangan Peroksida Sebanyak 15 ml asam asetat glasial dan 1 ml larutan KI jenuh ditambahkan ke dalam 10 ml ekstrak lipid. Campuran diagitasi dan didiamkan pada ruang gelap selama 5 menit. Selanjutnya dititrasi dengan 0.02 N larutan sodium tiosulfat, tambahkan indikator pati. Bilangan peroksida dinyatakan sebagai meg oksigen/kg sampel.
26 Bilangan TBA Pengujian TBA dilakukan menurut metode dari Tarladgis et al. (1960) (dalam Apriyantono et al. 1989). Prinsip pengukuran angka TBA adalah pengukuran terhadap produk sekunder dari oksidasi lipid yaitu malonaldehida, dimana reaksi TBA dengan malonaldehida menghasilkan senyawa berwarna yang menyerap pada panjang gelombang 528 nm, sehingga bisa diukur secara spektrofotometri. Sebanyak 10 gram sampel ditimbang dengan teliti dan dimasukkan ke dalam waring blender, ditambahkan 50 ml aquadest dan dihancurkan selama 2 menit. Dipindahkan secara kuantitatif ke dalam labu distilasi sambil dicuci dengan 47,5 ml aquadest. Ditambahkan + 2,5 ml HCl 4 M sampai ph menjadi 1.5. Tambahkan batu didih dan pencegah buih (anti foaming egent) secukupnya dan pasanglah labu distilasi pada alat distilasi. Distilasi dijalankan dengan pemanasan tinggi sehingga diperoleh 50 ml destilat selama 10 menit pemanasan. Aduk merata distilat yang diperoleh, pipet 5 ml distilat ke dalam tabung reaksi bertutup. Tambahkan 5 ml pereaksi TBA (0,02 M), tutup dan campur merata lalu panaskan selama 35 menit dalam air mendidih. Buat blanko dengan menggunakan 5 ml aquadest dan 5 ml pereaksi, lakukan seperti penetapan sampel. Dinginkan tabung reaksi dengan air pendingin selama + 10 menit kemudian diukur absorbansinya (D) pada panjang gelombang 528 nm dengan larutan blanko sebagai titik nol. Bilangan TBA dinyatakan dalam mg malonaldehid per kg sampel. Bilangan TBA = 7.8 x D Profil Asam Lemak a. Ekstraksi Lemak Sebelum ditentukan profil asam lemaknya, lemak diekstrak terlebih dahulu dari sampel sosis. Sampel sebanyak 5 g dihancurkan dan ditambahkan 6-20 mg Standar Internal C17 serta 30 ml pelarut, yang merupakan campuran kloroformmetanol (2:1). Macerasi selama 1-1.5 jam, kemudian disaring. Ekstrak kembali filtratnya dengan 20 ml pelarut kloroform-metanol selama 1 jam. Supernatan dipisahkan dan ditambahkan dengan 4 ml NaCl 0.88%. Diamkan hingga
27 terbentuk 2 lapisan. Lapisan bawah dipisahkan dan disaring sambil dilewatkan melalui Na 2 SO 4 anhidrous. Pekatkan ekstrak lemak dengan gas N 2. Ekstrak lemak selanjutnya dimetilasi (Folch et al. 1957 dalam Horng et al. 2002). b. Derivatisasi Asam Lemak Derivatisasi asam lemak didasarkan dengan metode dari Appelquist (1968) dalam Sampels et al. (2004) dengan sedikit modifikasi. Ekstrak lemak disaponifikasi dengan 1.5 ml 0.5 N larutan NaOH dalam dry methanol pada suhu 80 o C selama 5 menit. Tambahkan 2 ml boron trifluorida (BF3)-metanol dan panaskan pada suhu 80 o C selama 25 menit. Setelah dingin tambahkan 3 ml NaCl jenuh dan diekstrak dengan 1.5 ml heksan. Lapisan atas yang terbentuk dikumpulkan dalam tabung terpisah dan dihembus dengan gas N 2. Asam lemak methyl ester (FAME) siap diinjek ke GC. c. Analisis Profil Asam lemak Kandungan dan komposisi FAME dianalisa dengan GC dengan kondisi sebagai berikut (Horna et al. 2002): Kolom : Fused sillica (panjang 30 m dan diameter 0.25 mm). Suhu kolom : Temperatur awal 180 o C selama 1 menit, kemudian dinaikkan menjadi 190 o C dengan kecepatan 1 o C/menit. Suhu 190 o C dipertahankan selama 2 menit, kemudian dinaikkan kembali menjadi 210 o C dengan kecepatan 1 o C/menit dan dipertahankan selama 9 menit. Suhu detektor : 250 o C. Suhu injektor : 250 o C. Gas pembawa : Nitrogen dengan kecepatan aliran 0.6 ml/detik. Untuk identifikasi asam lemak dalam sampel dilakukan dengan mencocokkan waktu retensi peak asam lemak sampel dengan waktu retensi peak standar. Untuk menghitung jumlah asam lemak jenuh maupun tidak jenuh dilakukan perhitungan sebagai berikut:
28 Menghitung Retension Factor (RF) dari masing-masing asam lemak dengan rumus: RF AL A = Area SI dalam SE x Konsentrasi ALA dalam SE Area ALA dalam SE Konsentrasi SI dalam SE membandingkan waktu retensi (rt) asam lemak yang terdapat dalam sampel dengan waktu retensi asam lemak dalam standar eksternal. menghitung asam lemak yang teridentifikasi dalam sampel (mg asam lemak A per gram sampel), dengan rumus sebagai berikut: mg AL A/g sampel = Area AL A x RF AL A x mg SI Area SI g sampel Dimana: RF AL A = Retension Faktor asam lemak A SI = Standar Internal SE = Standar Eksternal Total Mikroba (Total Plate Count) Analisis total mikroba dilakukan menurut prosedur dari Fardiaz (1992). Sebanyak 1 g sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi bertutup yang telah disterilisasi dan ditambahkan 9 ml larutan pengencer steril secara aseptik, sehingga dihasilkan sampel dengan pengenceran 10-1. Sampel tersebut kemudian divorteks. Pipet sampel sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang telah berisi 9 ml larutan pengencer steril, sehingga dihasilkan pengenceran 10-2. Pengenceran 10-3, 10-4 dan seterusnya dilakukan dengan cara yang sama. Dari tiap-tiap pengenceran dipipet 1 ml dan dimasukkan secara aseptis ke dalam cawan petri. Selanjutnya ditambahkan media agar PCA (Plate Count Agar) steril sebanyak 5-10 ml. Setelah media agar membeku, cawan perti diinkubasi dengan posisi terbalik pada suhu 37 o C selama 2 hari. Perhitungan total mikroba dilakukan dengan menggunakan Standar Plate Count (SPC).
29 Proksimat Kadar Air (AOAC 1995) Sampel sebanyak 2-5 g ditimbang dan diletakkan dalam cawan aluminium/porselen yang telah diketahui bobot keringnya. Selanjutnya dikeringkan dalam oven pada suhu 100-105 o C selama 3-5 jam. Setelah itu sampel dan cawan diangkat dan didinginkan dalam desikator higga suhu ruang. Timbang bobot akhirnya dengan menggunakan neraca analitik dan lakukan hingga diperoleh bobot cawan dan sampel akhir konstan. Kadar Air (%) = bobot awal sampel (g) bobot akhir sampel (g) x 100% bobot awal sampel (g) Kadar Abu (AOAC 1995) Sampel sebanyak 2-5 g ditimbang dan diletakkan dalam cawan porselen yang telah diketahui bobot keringnya. Sebelum diabukan, sampel terlebih dahulu dipanaskan diatas pemanas dekstrusi hingga terbentuk arang dan tidak berasap lagi. Selanjutnya sampel diabukan dalam tanur listrik pada suhu 550 o C hingga terbentuk warna abu-abu. Setelah itu sampel didinginkan dalam desikator. Timbang bobot akhirnya dengan menggunakan neraca analitik dan lakukan hingga diperoleh bobot cawan dan sampel akhir konstan. Kadar Abu (%)= berat abu (g) x 100% berat sampel (g) Kadar Protein (AOAC 1995) Sampel sebanyak 0.1 g ditimbang dan dimasukkan ke dalam labu Kjeldahl, kemudian ditambahkan 50 mg HgO, 2 mg K 2 SO 4, 2 ml H 2 SO 4, batu didih dan didihkan selama 1,5 jam sampai cairan menjadi jernih. Setelah larutan didinginkan dan diencerkan dengan aquadest, sampel didestilasi dengan penambahan 8-10 ml larutan NaOH-Na 2 S 2 O 3. Hasil destilasi (+ 15 ml) ditampung dengan Erlenmeyer yang telah berisi 5 ml H 3 BO 3 dan 2-4 tetes indikator (campuran 2 bagian metal merah 0,2% dalam alkohol dan 1 bagian metal biru 0.2% dalam alkohol). Destilat yang diperoleh dititrasi dengan larutan HCl 0.02 N
30 sampai terjadi perubahan warna dari hijau menjadi abu-abu. Hal yang sama juga dilakukan terhadap blanko. Hasil yang diperoleh adalah dalam total N, yang kemudian dinyatakan dalam faktor konversi 6,25. Kadar protein dihitung berdasarkan rumus: Kadar Protein (%) = (ml HCl x ml blanko) N HCl x 14,007 x 100 x 6,25 mg sampel Total Lemak (AOAC 1995) Sampel sebanyak 2-5 g ditimbang dengan seksama, kemudian dimasukkan dalam selongsong kertas yang telah dikeringkan dan dialasi dengan kapas. Kemudian sumbat selongsong kertas yang berisi contoh dengan kapas. Setelah itu keringkan selongsong kertas berisi contoh dalam oven + 80 o C selama + 1 jam. Sesudah kering dimasukkan ke dalam alat ekstraksi soxhlet yang telah dihubungkan dengan labu lemak yang telah dikeringkan dan sudah diketahui beratnya kemudian ditambahkan pelarut heksan secukupnya. Proses dilanjutkan dengan refluks selama 6 jam sampai pelarut yang rutun kembali ke labu berwarna jernih. Selanjutnya pelarut disulingkan dan ekstrak lemak dikeringkan dalam oven pada suhu 105 o C selama 60 menit, dinginkan dan timbang. Ulangi hingga bobotnya tetap. Kadar Lemak (%) = a - b x 100% c Dimana: a = berat labu setelah ekstraksi (g) b = berat labu sebelum ekstraksi (g) c = berat sampel (g) Analisis Data Rancangan percobaan yang digunakan untuk analisis data uji penghambatan oksidasi lemak dan uji sensori adalah Rancangan Acak Lengkap dua faktori dengan perlakuan konsentrasi ekstrak cengkeh dan lama penyimpanan. Model Linier Aditif dari rancangan percobaan ini adalah sebagai berikut (Steel and Torrie, 1993):
31 Y ijk = µ + α 1 + β j + (µβ) ij + ε ijk i = 1, 2, 3, 4, 5 j = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 k = 1, 2 Dimana: Y ijk nilai pengamatan pada faktor perbandingan konsentrasi ekstrak cengkeh taraf ke-i, faktor lama penyimpanan taraf ke j dan ulangan ke-k. (µ, α 1, β j ) merupakan komponen aditif dari rataan, pengaruh utama faktor konsentrasi ekstrak etanol cengkeh dan pengaruh utama faktor lama penyimpanan, (µβ) ij merupakan komponen interaksi dari faktor konsnentrasi ekstrak cengkeh dan lama penyimpanan, sedangkan ε ijk merupakan pengaruh acak yang menyebar normal. Apabila hasil analisis data berbeda nyata, maka akan dilanjutkan dengan uji BNT.