Jurnal Sains Kimia Vol.8, No.1, 2004: 26-28 PENGARUH AKTIVATOR SISTEIN DAN NATRIUM KLORIDA TERHADAP AKTIVITAS PAPAIN Daniel S Dongoran Jurusan Kimia FMIPA Universitas Sumatera Utara Jl. Bioteknologi No. 1 Kampus USU Medan 20155 Abstrak Papain adalah salah satu enzim proteolitik yang terdapat dalam getah pepaya dan dapat digunakan sebagai bahan pengempuk daging.papain termasuk golongan enzim protease sulfhidril yaitu enzim yang mempunyai residu sulfhidril pada lokasi aktifnya. Aktivitas papain dapat ditingkatkan dengan penambahan aktivator sistein maupun NaCl. Penentuan aktivitas proteolitik papain dilakukan secara spektrofotometri menurut AOAC 1984 dan dinyatakan berdasarkan banyaknya kadar tirosin yang dibebaskan dari hidrolisa substrat kasein. Satu unit aktivitas papain dinyatakan sebagai banyaknya 1 mg tirosin yang dibebaskan dari substrat kasein pada kondisi pengujian tertentu. Dari hasil penelitian menunjukkan aktivitas papain dalam substrat kasein dengan aktivator sistein 5.378 unit/ml sedangkan dengan aktivator Natrium Klorida 3.658 unit/ml dan tanpa aktivator 2.320 unit/ml. Sistein dan Natrium Klorida pada konsentrasi yang sama 0.7 % menaikkan aktivitas papain masing masing sebesar 131.8 % dan 57.7 %. Kata kunci : enzim proteolitik papain, aktivator sistein dan NaCl, tirosin. PENDAHULUAN Daun pepaya di Indonesia telah lama dikenal sebagai daun yang menghasilkan zat pelunak daging. Tradisi pemakaian daun pepaya ini diketahui dari nenek moyang tanpa mengetahui dengan jelas zat apa yang terdapat pada daun tersebut. Setelah diselidiki oleh beberapa ahli, ternyata zat yang terdapat pada getah daun pepaya adalah papain yang dapat menyebabkan pelunakan daging setelah dibungkus dengan daun tersebut beberapa jam sebelum dimasak ( Widjaja, 1977 ). Dengan adanya tehnik yang lebih maju,telah banyak diakukan pemurnian / isolasi papain dari sumbernya. Menurut hasil yang dilakukan oleh Balai Penyelidikan Pertanian dan Lembaga Penelitian Tanaman Hortikultura Jakarta, 30 papain dapat diperoleh dari getah seluruh bagian tanaman kecuali akar dan biji dari pohon pepaya. Papain telah banyak dipergunakan diberbagai bidang seperti bidang medis, industri daging, pabrik tekstil, pabrik kulit, dan pabrik bir. Secara umum yang dimaksud dengan papain adalah yang telah dimurnikan maupun yang masih kasar. Menurut British of Pharmaceutical Codex 1934, yang dimaksud papain adalah campuran enzim enzim proteolitik yang terdapat didalam getah pepaya dengan syarat harus mempunyai aktivitas proteolitik minimal 20 unit/gram preparat. Enzim proteolitik merupakan kelompok hidrolase yang berperan pada hidrolisa sekelompok protein menjadi
Pengaruh Aktivator Sistein dan Natrium Klorida (Daniel S Dongoran) protein protein tunggal. Aktivitas proteolitik suatu enzim sangat dipengaruhi oleh ph, suhu, kekuatan ionik, konsentrasi substrat, konsentrasi enzim, adanya reduktor ataupun oksidator dan bufer. Enzim papain termasuk golongan enzim protease sulfhidril yaitu enzim yang mempunyai residu sulfhidril pada lokasi aktifnya. Aktivitas enzim papain dapat ditingkatkan dengan penambahan aktivator. Aktivator aktivator yang paling umum digunakan adalah sistein sianida dan glutation ( Kimmel, 1957 ). Kualitas papain ditentukan oleh tinggi rendahnya aktivitas proteolitik yang dimilikinya, semakin tinggi aktivitas proteolitiknya semakin tinggi pula kualitasnya dan sebaliknya, semakin rendah aktivitas proteolitiknya semakin rendah kualitasnya ( Widjaja, 1977 ). Daya proteolitik dari papain sangat aktif pada suasana reduktif, karena dengan adanya ( penambahan ) bahan bahan pereduksi seperti : HCN, H 2 S. Sistem adalah senyawa pereduksi yang dapat meningkatkan aktivitas papain dengan jalan memutus ikatan disulfida ( S-S ) pada senyawa sistein yang terdapat dalam struktur enzim papain. Jika ikatan disulfida terputus akan diperoleh gugus disulfhidril bebas. Dengan terbentuknya gugus sulfhidril bebas sehingga aktivitas papain meningkat. Penambahan NaCl pada konsentrasi rendah ( kurang dari 2 % ) akan menambah aktivitas papain tetapi jika konsentrasi lebih dari 2 % akan merusak enzim papain ( Arief, 1975 ). Didalam larutan, NaCl akan terionisasi + menjadi Na ( ion logam ) dan Cl. Ion logam seperti proton adalah asam Lewis atau elektrofil yang dapat menerima pasangan elektron membentuk ikatan sigma. Lingkaran koordinasi logam dapat mempersatukan enzim dan substrat yang menghasilkan kelat pada enzim. Logam juga dapat menyelubungi nukleofil, sehingga mampu mencegah reaksi sampingan yang mungkin timbul. Satuan aktivitas suatu enzim dinyatakan dengan unit aktivitas sedangkan yang dimaksud dengan satu unit aktivitas papain adalah banyaknya 1mg tirosin yang dibebaskan dari substrat kasein pada kondisi pengujian tertentu ( A.O.A.C, 1984 ). Bertitik tolak dari uraian diatas penulis ingin mengetahui sejauh mana pengaruh aktivator sistein dan Natrium klorida terhadap aktivitas papain BAHAN DAN METODA Bahan : Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah : A. Pereaksi Lowry NaOH, Na nitrat, Na 2 CO 3, CuSO 4, H 2 O B. Pereaksi Folin Ciocalten : Na tungstat, Na molibdat, HCL, H 3 PO 4, Li 12 SO 4. C. Pereaksi uji aktivitas papain : Na 2 HPO 4, asam sitrat, HCL, asam trikloroasetat, kasein. D. Larutan penyangga fosfat sistem : Na EDTA, Na 2 HPO 4, Na EDTA, sistem HCL. E. Larutan standard tirosin F. Larutan sampel papain Metoda Penentuan Aktivitas Papain Menurut AOAC - 1984 Ke dalam masing masing 12 labu takar 100 ml dipipet sebanyak 25 ml larutan kasein dan diberi label S 1, S 2, S 3, U 1 sebagai sampel D 1, D 2, D 3, U 2 sebagai duplikat dan B 1, B 2, B 3, U 3 sebagai blanko. 31
Jurnal Sains Kimia Vol.8, No.1, 2004: 29-34 32 Kemudian ditambahkan 5 ml larutan penyangga fosfat sistem Na-EDTA ke dalam labu S 1, D 1, B 1 dan 2,5 ml untuk labu S 2, D 2, B 2, U 1, U 2, dan U 3. Semua labu diatas dipanaskan dalam pemanas air pada suhu 40 C selama 10 menit. Selanjutnya ditambahkan 5 ml larutan standar tirosin ke dalam labu S 1 dan D 1, 7,5 ml untuk Labu S 2 dan D 2, 10 ml untuk labu S 3 dan D 3. Sedangkan untuk labu U 1 dan U 2 diberi masing masing 7,5 ml larutan sampel. Semua labu ditempatkan dalam pemanas air. Setelah 60 menit, ditambahkan 15 ml larutan asam trikloroasetat 30 % masing masing ke dalam labu diatas lalu dikocok kuat kuat. Ke dalam labu B 1, B 2, dan B 3 ditambahkan larutan standar tirosin masing masing 5 ml, 7,5 ml dan 10 ml. Sedangkan untuk labu U 3 ditambahkan 7,5 ml larutan sampel. Semua labu di atas dipanaskan pada suhu 40 C selama 40 menit. Kemudian disentrifugasi pada 3400 rpm selama 20 menit dan supernatan dari masing masing labu disaring dua kali. Filtrat dari setiap labu diukur pada panjang gelombang 280 nm. Hal yang sama dilakukan juga dengan memakai aktivator sistein dan natrium klorida masing masing 0,7 %. Hasil percobaan dapat dilihat pada tabel IV.7 dan IV.8. Pembuatan Larutan Bovin Serum Albumin 10 μg/ml Ditimbang denga teliti 1 mg bovin serum albumin dan dilarutkan dengan air suling dalam labu takar 100 ml hingga batas tanda. Penetapan Resapan Maksimum larutan Bovin Serum Albumin Ke dalam tabung reaksi sipipet sebanyak 1 ml larutan bovin serum albumin 10 μg/ml. Di tambahkan 5 ml pereaksi C, dikocok dengan segera dan dibiarkan pada suhu kamar selama 10 menit. Kemudian ditambahkan 0,5 ml pereaksi Folin-Ciocalteu, dikocok dengan segera dan dibiarkan pada suhu kamar selama 30 menit. Selanjutnya dibaca resapannya pada panjang gelombang 740 sampai 760 nm hingga diperoleh resapan maksimum. Penentuan Kurva Baku Larutan Bovin Serum Albumin Dipipet 1, 3, 5, 7, dan 8 ml larutan bovin serum Albumin 10 μg/ml ke dalam masing masing labu takar 10 ml. Kemudian diencerkan dengan air suling hingga batas tanda. Dari masing masing labu di atas dipipet sebanyak 1 ml. Ditambahkan ke dalam masing masing labu 5 ml pereaksi C, dikocok dengan segera dan dibiarkan pada suhu kamar selama 10 menit. Kemudian ditambahkan pereaksi Folin-Ciocalteu masing masing 0,5 ml, dikocok dengan segera dan dibiarkan pada suhu kamar selama 30 menit. Selanjutnya dibaca resapannya pada panjang gelombang 750 nm. V. Pembuatan Larutan Tirosin 100 μg/ml Ditimbang dengan teliti 10 mg tirosin dan dilarutkan dengan air suling dalam labu takar 100 ml hingga batas tanda. Penetapan Resapan Maksimum larutan Tirosin Ke dalam tabung reaksi dipipet sebanyak 8 ml larutan tirosin 100 μg/ml. Ditambahkan 1 ml larutan penyangga fosfat sistein Na-EDTA dan dibiarkan selama 60 menit. Kemudian ditambahkan 1 ml asam trikloroasetat 30 % dan disentrifugasi pada 3400 rpm selama 20 menit.
Pengaruh Aktivator Sistein dan Natrium Klorida (Daniel S Dongoran) Supernatan disaring dan diukur pada panjang gelombang 270 sampai 290 nm hingga diperoleh resapan maksimum. HASIL DAN PEMBAHASAN Untuk mengetahui kadar protein yang terkandung dalam enzim papain dilakukan analisa menurut metoda Lowry. Dalam hal ini dipakai standar protein dari bovin serum albumin ( 10 μg/ml ) dengan hasil resapan seperti ditunjukkan dalam tabel I. Tabel I. Data Resapan Larutan Bovin Serum Albumin ( 10 μg/ml ) Menurut Metoda Lowry dengan Spektrofotometer 1201 MR. No. ( nm ) Resapan 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 740 742 744 746 748 750 752 754 756 758 760 0.488 0.489 0.490 0.491 0.493 0.495 0.494 0.492 0.490 0.488 0.487 Perhitungan Kadar Tirosin Hasil Hidrolisa Substrat Kasein Oleh Enzim Papain Untuk mengetahui aktivitas enzim papain dalam substrat kasein terlebih dahulu harus diketahui kadar tirosin yang dibebaskan dari hasil hidrolisa substrat tersebut. Dalam hal ini pertama sekali ditentukan resapan maksimum larutan tirosin pada daerah UV dengan hasil resapan seperti ditunjukkan dalam tabel II. Tabel II. Data Resapan LarutanTirosin ( 100 mg/ml ) Pada Daerah Ultra Violet Dengan Spektrofotometer 1201 MR. No. λ ( nm ) Resapan 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11 270 272 274 276 278 280 282 284 286 288 290 0.098 0.149 0.235 0.312 0.406 0.449 0.397 0.294 0.210 0.125 0.065 Dengan diperolehnya resapan maksimum larutan tirosin yaitu pada λ 280 nm. Kemudian dibuat kurva baku dari larutan tirosin pada panjang gelombang 280 nm. Kadar tirosin yang dihasilkan dari hidrolisa substrat kasein oleh enzim papain dengan aktivator sistein, natrium klorida dan tanpa aktivator dapat dilihat dalam tabel III. Tabel III. Skema Pnentuan Aktivitas Papain Dalam Substrat Kasein Dengan Aktivator Sistein Dan Tanpa Aktivator Menggunakan Spektrofotometer 1201 MR. Enzim Aktif Enzim Aktif S 1 (ml) S 2 (ml) S 3 (ml) U 1 (ml) S 1 (ml) S 2 (ml) S 3 (ml) U 1 (ml) 1. Kasein 25 25 25 25 1. Kasein 25 25 25 25 2. Buffer & 5 2,5-2,5 2. Buffer 5 2,5-2,5 Sistein Prainkubasi pada suhu 40 o C, Prainkubasi pada suhu 40 o C, 10 menit 10 menit 33
Jurnal Sains Kimia Vol.8, No.1, 2004: 29-34 3. Tirosin@ 5 7,5 10 - Tirosin 3. @ 5 7,5 10-4. Sampel - - - 7,5 4. Sampel - - - 7,5 Inkubasi pada suhu 40 o C, Inkubasi pada suhu 40 o C, 60 menit 60 menit 5. T C A 30% 15 15 15 15 5. T C A 30% 15 15 15 15 Panaskan pada suhu 40 o C, Panaskan pada suhu 40 o C, 40 menit 40 menit 20 menit 20 menit 6. Filtrat Diukur resapan pada 280 nm 6. Filtrat Diukur resapan pada 280 nm Resapan Resapa (A1) 0,630 0,699 0,747 0,820 n (A1) 0,612 0,638 0,694 Enzim Non Aktif Enzim Non Aktif B 1 (ml) B 2 (ml) B 3 (ml) U 3 (ml) B 1 (ml) B 2 (ml) B 3 (ml) 1. Kasein 25 25 25 25 1. Kasein 25 25 25 25 2. Buffer & 5 2,5-2,5 2. Buffer 5 2,5-2,5 Sistein Prainkubasi pada suhu 40 o C, Prainkubasi pada suhu 40 o C, 10 menit 10 menit 3. T C A 30% 15 15 15 15 3. T C A 30% 15 15 15 15 Tirosin 4. Tirosin@ 5 7,5 10-4. @ 5 7,5 10-5. Sampel - - - 7,5 5. Sampel - - - 7,5 Inkubasi pada suhu 40 o C, Inkubasi pada suhu 40 o C, 60 menit 60 menit Panaskan pada suhu 40 o C, Panaskan pada suhu 40 o C, 40 menit 40 menit 20 menit 20 menit 6. Filtrat Diukur resapan pada 280 nm 6. Filtrat Diukur resapan pada 280 nm Resapan Resapa (A2) 0,539 0,581 0,609 0,397 n (A2) 0,523 0,531 0,564 ta = A1 - ta = A2 0,091 0,118 0,138 0,423 A1 - A2 0,089 0,107 0,130 Tirosin* 11,18 16,47 20,39 76,28 Tirosin* 10,78 14,31 18,82 Keterangan : - Tirosin@ = penambahan larutan tirosin - Tirosin* = tirosin yang dihasilkan 0,7 08 U 3 (ml) 0,4 22 0,2 84 49, 02 Aktivitas dan spesifik enzim papain dapat dilihat pada table IV. Tabel IV. Aktivitas Dan Spesifik Enzim Papain. Aktivator Tanpa Pengukuran Sistein NaCl Aktivator 34 Aktivitas ( unit / ml ) Aktivitas Spesifik(unit/ μg protein ) 5,378 3,658 2,320 0,647 0,440 0,279
Pengaruh Aktivator Sistein dan Natrium Klorida (Daniel S Dongoran) KESIMPULAN Dari hasil percobaan yang telah dilakukan, maka dapat diambil kesimpulan sebagai berikut : 1. Kadar protein enzim papain adalah 8,31 μg/ml. 2. Aktivitas enzim papain dalam substrat kasein dengan aktivator sistein, natrium klorida dan tanpa aktivator berturut-turut adalah 5,378 unit / ml, 3,658 unit / ml dan 2,320 unit / ml. 3. Sistein dan natrium klorida pada konsentrasi 0,7 % dapat menaikkan aktivitas papain sebesar 131,8 % pada sistein dan 57,7 % pada natrium klorida. DAFTAR PUSTAKA A O A C. 1984. Official Methods of Analysis. 397-398. Arief, P.H. 1975. Papain, Bull. Biokimia Institut Pertanian Bogor. Vol. I, No.I. 39-48. Bell, J.E. and Bell, E.T. 1988. Proteins and Enzymes, Prentice Hall, Inc., Engle-Wood Cliff, New Jersey. 2 6. Daryono, M., Sabari. 1980. Produksi dan Aktivitas Proteolitik Papain Bull. Penelitian Hortikultura Vol. III, No. 1. 11-18. Davis, N. C., Smith, E. L. 1965. Assay of Proteolytic Enzymes in Glick, D., Methods of Biochmical Analysis, Vol. II, Interscience. 248. Fifiyanti, Z. 1992. Pengaruh ph, Suhu Terhadap Nilai KM Enzim Papain Dalam Substrat Kasein, Skripsi Jurusan Kimia, FMIPA USU, Medan Kimmel, J. R., Smith, E. L. 1957. The Properties of Papain Nord, F.F., Advanced in Enzymology and Related Subject of Biochemistry, Vol. XIX, Interscience. 282 290, 325, 376. Lehninger, A. L. 1975. Biochemistry, The Molecular Basis of Cell Structure and Function,Second Edition Worth Publishers, Inc., New York. 184 195. Page, D. S. 1989. Prinsip-prinsip Biokimia, Edisi Kelima, Terjemahan Soendoro, R., Erlangga Jakarta. 111 137. Walpole, R. E. 1988. Pengantar Statistika, Gramedia. 288, 373. Widjaja, E. A. 1977. Papain Zat Pelunak Daging, Bull. Kebun Raya., Vol. III, No. 1. 13 16. Winarno, F. G. 1983. Enzim Pangan, Gramedia, Jakarta. 12 23, 73 75, 91. Wirahadikusumah, M. 1981. Biokimia Protein, Enzim dan Asam Nukleat, ITB. 6 9, 40 56. 35