MODUL 5 Teknik Identifikasi Bakteri POKOK BAHASAN : 1. Teknik Pewarnaan GRAM (Pewarnaan Differensial) 2. Uji Katalase 3. Pembuatan stok agar miring TUJUAN PRAKTIKUM : 1. Mempelajari cara menyiapkan apusan bakteri dengan baik sebagai prasyarat untuk mempelajari teknik pewarnaan; 2. Mempelajari prosedur Pewarnaan Gram, memahami tahapan prosedur dan reaksi kimiawi yang terlibat dalam prosedur. 3. Mempelajari salah satu uji biokimia katalase untuk identifikasi awal bakteri TINJAUAN PUSTAKA : Bakteri isolat tunggal dapat disimpan dalam waktu lama (4-6 bulan) dengan menggunakan agar miring pada suhu dingin. Media padat dibuat menjadi agar miring di dalam Penyimpanan lebih lama dapat dilakukan dengan menggunakan teknik kriopreservasi yaitu bakteri disimpan dalam media-gliserol 50% pada suhu -80 0 C. Agar miring juga dapat digunakan untuk melihat motilitas bakteri. Pergerakan bakteri agar miring dapat dilihat dari bentuk goresan. Bentuk irregular ataupun menyebar dari goresan menunjukkan bakteri bersifat motil, jika bentuk koloni mengikuti goresan kemungkinan besar bakteri bersifat non motil. Bakteri berukuran sangat kecil dan tipis sehingga sukar dilihat struktur tubuhnya walaupun dengan bantuan mikroskop. Untuk melihat morfologi bakteri secara lebih jelas dikembangkan teknik pewarnaan bakteri. Prinsip pewarnaan bakteri adalah pertukaran antara ion zat warna dengan ion protoplasma sel. Praktikum Mikrobiologi Laut [M10A205] TA 2013 Page 19
Terdapat dua kelompok zat pewarna bakteri, yaitu : (1) bersifat Asam, berupa anion dan umum digunakan dalam bentuk garam natrium. (2) bersifat Alkali, berupa kation dan umum digunakan dalam bentuk klorida. Selain zat warna diperlukan zat tambahan yang berfungsi untuk mengendapkan hasil reaksi zat warna dengan komponen dinding sel bakteri. Zat tersebut dikenal dengan istilah zat Pematek yang akan melekatkan zat warna pada plasma sel. Teknik pewarnaan bakteri dapat dibagi menjadi dua jenis, yaitu : Pewarnaan Sedehana atau Tunggal, dengan menggunakan satu macam zat warna seperti : Metilen Blue, Karbol Violet dan Air Fucshin. Pewarnaan Differensial dengan menggunakan dua atau lebih zat warna. Pengamatan morfologi bakteri hasil pewarnaan dilakukan di bawah pengamatan mikroskop. Berdasarkan Pewarnaan GRAM, bakteri diklasifikasikan ke dalam 2 (dua) kelompok besar yaitu : Bakteri Gram Positif dan Gram Negatif. Perbedaan utama di antara keduanya adalah struktur dan komposisi dinding selnya. Bakteri Gram Positif mampu mempertahankan zat warna utama dalam pewarnaan Gram, yaitu Gentian Violet, sehingga nampak berwarna ungu saat pengamatan dikarenakan dinding sel kelompok bakteri ini tersusun oleh sebagian besar Peptidoglikan, yang mampu mengikat zat warna dan tidak rusak saat dicuci dengan alcohol. Sementara itu, bakteri Gram negatif memiliki komposisi dinding sel yang sebagian besar tersusun dari lapisan lipid, sehingga pada saat pewarnaan kurang dapat mempertahankan zat warna utama terutama saat dicuci dengan alcohol (lipid rusak saat dicuci dengan alcohol), akibatnya kelompok bakteri ini memberikan kenampakan warna merah (warna dari zat warna ke dua : safranin atau air fuchsin) di akhir kegiatan pewarnaan Gram. Seri reagen yang digunakan dalam Teknik Pewarnaan Gram meliputi : Zat Warna I (Gentian/Crystal Violet), Larutan Iodine, Alcohol, dan Zat Warna II (Safranin/ Air Fuchsin). Adapun ilustrasi kondisi sel bakteri saat pewarnaan Gram tampak seperti pada Gambar berikut : Praktikum Mikrobiologi Laut [M10A205] TA 2013 Page 20
Gambar : Kondisi Sel Bakteri saat Pewarnaan Gram UJI KATALASE Identifikasi suatu jenis bakteri dilakukan melalui serangkaian pengujian dan pengamatan. Pewarnaan gram bertujuan untuk membantu mengetahui kategori kelompok bakteri berdasarkan struktur dinding sel dan bentuk bakteri. Uji katalase merupakan salah satu pengujian biokimia untuk mengidentifikasi bakteri apakah menghasilkan enzim katalase atau tidak. Enzim katalase dihasilkan oleh beberapa jenis bakteri dalam rangka mencegah oksidasi radikal bebas yang dapat merusak atau membunuh bakteri. Ada beberapa jenis pengujian biokimia lain yang merupakan bagian dari pengidentifikasian suatu jenis bakteri diantaranya :kemampuan bakteri menghasilkan enzim hidrolitik terhadap substrat yang ditambahkan pada media, kemampuan memfermentasi gula, mengoksidasi nitrat dsb. Uji katalase sangat mudah dilakukan dengan menggunakan hydrogen peroksida 3% yang diberikan pada bakteri target, pembentukan buih/busa menunjukkan kemampuan bakteri menghasilkan enzim katalase. Prinsip dari uji katalase adalah pernapasan anaerob, mikroorganisme memproduksi hydrogen peroksida dan dalam beberapa kasus, bahkan mencapai racun toksik superoksida. Akumulasi dari Praktikum Mikrobiologi Laut [M10A205] TA 2013 Page 21
zat ini dapat mengakibatkan kematian organisme kecuali mereka dapat mendegradasi secara enzimatis. Zat ini diproduksi ketika lingkungan aerob, fakultatif anaerob, dan mikroaerofil digunakan dalam jalur pernapasan aerobic, dimana oksigen merupakan akhir aseptor electron, selama pendegradasian karbohidrat untuk produksi energy. Organisme mampu memproduksi katalase yang secara cepat mampu mendegradasi hydrogen peroksida. 2H2O2 2H2O + O2 Organisme aerobic yang kekurangan katalase dapat mendegradasi terutama superoksida toksik menggunakan enzim superoksida dismutase. Produk akhir dari superoksida dismutase adalah H2O2, tapi ini memiliki sedikit toksik terhadap sel bakteri daripada superoksida. Produksi katalase dapat ditentukan dengan menambahkan substrat H2O2 tepat ketika diinkubasi dalam NA agar miring kultur. Jika terdapat katalase, reaksi kimia dapat diindikasikan dengan adanya buih-buih yang menandakan adanya oksigen bebas (O2). Jika tidak terdapat buih, maka menunjukkan hasil negatif. PROSEDUR PELAKSANAAN PRAKTIKUM : 1. TEKNIK PEMBUATAN APUSAN BAKTERI Alat : Jarum Ose Gelas Object Bunsen Bahan : Biakan (Agar Culture/ Broth Culture) NaCl Fisiologis Spiritus Prosedur : Sumber dari biakan Padat (Solid Medium) 1. Dengan menggunakan Jarum Ose, ambil 2 loop NaCl Fisiologis, tempatkan di atas Object Glass; 2. Dengan menggunakan Jarum Ose (ujung runcing), ambil 1 koloni bakteri dari biakan Padat, tempatkan di atas suspensi NaCl Fisiologis yang sudah ada di atas Object Glass, 3. Ratakan suspensi dengan membentuk area apusan; 4. Keringkan suspensi pada suhu ruang untuk beberapa menit; 5. Lewatkan suspensi di atas api bunsen untuk fiksasi apusan. Praktikum Mikrobiologi Laut [M10A205] TA 2013 Page 22
Sumber dari biakan Cair (Liquid Medium) 1. Dengan menggunakan Jarum Ose, ambil 2 loop Biakan Cair (Broth Culture), tempatkan di atas Object Glass; 2. Ratakan suspensi dengan membentuk area apusan; 3. Keringkan suspensi pada suhu ruang untuk beberapa menit; 4. Lewatkan suspensi di atas api bunsen untuk fiksasi apusan. Praktikum Mikrobiologi Laut [M10A205] TA 2013 Page 23
Ilustrasi Teknik Pembuatan Apusan bakteri dapat dilihat pada Gambar berikut : Gambar : Teknik Pembuatan Apusan Bakteri Praktikum Mikrobiologi Laut [M10A205] TA 2013 Page 24
2. TEKNIK PEWARNAAN GRAM Alat : Object Glass Cover Glass Pipet Tetes Botol Semprot Bunsen Bahan : Apusan Bakteri Zat Warna Gentian Violet Iodine Alcohol Zat Warna Safranin/ Air Fuchsin Aquades Spiritus Prosedur : 1. Persiapkan Apusan bakteri yang telah dibuat pada tahap sebelumnya; 2. Teteskan 1 tetes Zat Warna I (Gentian Violet) ke atas area apusan, biarkan selama 20 detik; 3. Cuci perlahan dengan menggunakan air aquades, biarkan 2 detik; 4. Teteskan 1 tetes Larutan Iodine ke atas apusan, biarkan 30 detik s.d. 1 menit; 5. Cuci dengan Alcohol, hingga larutan yang mengalir sudah tidak berwarna (sekitar 10 20 detik); 6. Cuci perlahan dengan menggunakan air aquades, biarkan selama 2 detik; 7. Teteskan 1 tetes Zat Warna II (Safranin/ Air Fuchsin), biarkan selama 20 detik; 8. Cuci perlahan dengan menggunakan air aquades, biarkan selama 2 detik; 9. Keringkan di suhu ruang; 10. Amati di atas mikroskop dengan perbesar 100 x Objektif, dengan bantuan minyak imersi; Praktikum Mikrobiologi Laut [M10A205] TA 2013 Page 25
Ilustrasi Prosedur Pewarnaan Gram dapat dilihat pada Gambar berikut : Gambar : Prosedur Pewarnaan Gram Prosedur Uji Katalase Bahan : Biakan padat bakteri berumur 24 jam NaCl fisiologis 0,9% Hydrogen peroksida 3% Alat: Slide glass Kawat ose Bunsen Praktikum Mikrobiologi Laut [M10A205] TA 2013 Page 26
Prosedur: 1 Biakan padat bakteri target yang telah diinkubasi sehari semalam disiapkan. 3. NaCl fisiologis 0,9% diambil sebanyak 2 ose dan ditempatkan pada slide glass 4. Koloni bakteri diambil 1 ose secara aseptis kemudian disapukan pada slide glass yang telah diberi NaCl fisiologis. 5. Hidrogen peroksida 3% sebanyak 1 tetes ditempatkan diatas sapuan dan diamati pembentukan buih. Koloni positif mennghasilkan enzim katalase jika dihasilkan buih. 6. Hasil praktikum dicatat pada tabel pengamatan. PARAMATER YANG DIAMATI : No Sumber Isolat GRAM Perbesaran Mikroskop Positif Negatif No Sumber Isolat Uji Katalase Keterangan Positif Negatif Praktikum Mikrobiologi Laut [M10A205] TA 2013 Page 27