LAPORAN PRAKTIKUM FARMAKOGNOSI ANALISIS HISTOKIMIA DAN KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS SERBUK BUAH (Piperis Nigri Fructus) Oleh : 1. Anis R. (112210101061) 2. Maulana Fadlil S. (112210101066) 3. Husnul Bararoh (112210101090) 4. Herlina Ekawati (132210101005) 5. Wahyu Agustina (132210101025) 6. Riza Fahmi Q. K. (132210101075) LABORATORIUM FARMAKOGNOSI BAGIAN BIOLOGI FARMASI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS JEMBER 2014
BAB I PENDAHULUAN 1.1 LATAR BELAKANG Klasifikasi o Kingdom : Plantae (tumbuhan) o Divisi : Spermatophyta (tanaman berbiji) o Sub divisi : Angiospermae (biji berada di dalam buah) o Kelas : Magnoliopsida (berkeping dua / dikotil) o Ordo : Piperales o Famili : Piperaceae o Genus : Piper o Spesies : Piper nigrum Linn Lada atau merica adalah rempah-rempah berwujud biji-bijian yang dihasilkan tanaman Piper nigrum L. Lada sangat penting dalam komponen masakan dunia dan dikenal luas sebagai komoditi perdagangan penting di dunia. Piperin merupakan suatu senyawa yang sangat bermanfaat dalam kesehatan. Piperin banyak ditemukan pada simplisia yang termasuk dalam keluarga piperaceae, yaitu pada Piperis nigrii fructus, Piperis albi fructus, Piperis retrofracti fructus, dll. Tanaman yang termasuk dalam keluarga piperaceae sangat banyak ditemukan hampir seluruh dataran rendah di Indonesia, karena tanaman ini tidak tahan dengan genangan air. Piperis nigri sangatlah mudah ditemukan di seluruh daerah di Indonesia dengan harga yang relative rendah. Pada umumnya kandungan piperin dalam piperis nigri sebanyak 1,7-7,4%. Genus Piper memiliki banyak spesies. Sekitar 600 2.000 spesies di antaranya tersebar di daerah tropis. Dari jumlah tersebut, terdapat beberapa spesies yang telah dibudidayakan, antara lain Piper nigrum (lada), Piper betle (sirih), dan Piper retrofractum (cabai jawa) (Rukmana, 2003). Chromosome pada piper nigrum berjumlah 2n = 52. Bangsa Piper termasuk kelas Dicotyledae, ordo Piperales dan keluarga Piperaceae. Di antara 600 jenis bangsa Piper yang terdapat di daerah tropis, kurang lebih 40 jenis berasal dari Indonesia.
Deskripsi Tanaman: Tanaman herbal tahunan, memanjat. Batang bulat, beruas, bercabang, mempunyai akar pelekat, warna hijau kotor. Daun tunggal, bulat telur, pangkal bentuk jantung, ujung runcing, tepi rata, panjang 5-8 cm, lebar 2-5 cm, pertulangan menyirip, warna hijau. Bunga majemuk, bentuk bulir, menggantung, panjang 3,5-22 cm, warna hijau. Buah buni, bulat, buah muda berwarna hijau dan setelah tua berwarna merah. Sifat Lada Lada memiliki rasa pedas, berbau khas dan aromatik. Rasa pedas dari buah lada hitam, 90-95% disebabkan oleh adanya komponen trans-piperin yang ada dalam buah kering kadarnya 2-5% dan terdiri atas senyawa asam amida piperin dan asam piperinat. Rasa pedas piperin masih ada walaupun diencerkan 1:200000. Rasa pedas juga disebabkan oleh adanya kavisin yang merupakan isomer basa piperin. Kandungan lain yang menghasilkan bau aromatic adalah minyak atsiri dengaan kadar 1-2.5% yang mengandung piperonal, eugenol, safrol, metil eugenol, dan miristissin. Lada hitam juga mengandung monoterpen dan seskuiterpen. (Wiryowidagdo, Sumaali, 2007) Khasiat dan Kegunaan Penggunaan, lada digunakan sebagai stomakik, karminatif, dan bumbu masak. Khasiat dari buah lada yaitu dapat mengobati kaki bengkak pada ibu hamil, kolera, nyeri haid, rematik, salesma, air mani yang encer, dan impoten(septiatin, 2008). Efek farmakologis lada diantara lain: o o o o o Kamfena merangsang timbulnya kejang. Boron meluruhkan haid, merangsang keluarnya hormone androgen dan estrogen. Mencegah pengeroposan tulang, menghambat prostaglandin, relaksasi otot, menghilangkan kelelahan Merangsang semangat, calamine dan chavicine Merangsang syaraf pusat calamine. 1.2 RUMUSAN MASALAH
1. Bagaimana analisis histokimia serbuk buah merica (Piperis nigri Fructus) dengan penambahan reagen kimia? 2. Bagaimana analisis senyawa serbuk merica (Piperis nigri Fructus) dengan KLT dalam 1.3 TUJUAN kondisi tertentu? 1. Mahasiswa dapat menganalisis histokimia serbuk merica (Piperis nigri Fructus) dengan penambahan reagen kimia. 2. Mahasiswa dapat menganalisis senyawa serbuk merica (Piperis nigri Fructus) dengan KLT dalam kondisi tertentu. BAB II DASAR TEORI
Uji histokimia bertujuan untuk mengetahui berbagai macam zat kandungan yang terdapat dalam jaringan tanaman. Dengan pereaksi yang spesifik, zat-zat kandungan tersebut akan memberikan warna yang spesifik pula, sehingga mudah di deteksi. (Anonim. l987 : 2) Pada analisis histokimia inilah dibutuh beberapa reagen untuk menguji kandungan yang terdapat dalam serbuk analit yang diuji. Kandungan senyawa kimia yang telah ditemukan dalam buah merica atau lada yaitu minyak atsiri, pinena, kariofilena, lionena, filandrena alkaloidpiperina, kavisina, piperitina, piperidina, zat pahit dan minyak lemak. Rasa pedas disebabkanoleh resin yang disebut kavisin. Kandungan piperine dapat merangsang cairan lambung danair ludah. Selain itu lada bersifat pedas, menghangatkan dan melancarkan peredaran darah. Sedangkan analisis dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan cara pemisahan campuran senyawa menjadi senyawa murninya dan mengetahui kuantitasnya yang menggunakan. Kromatografi juga merupakan analisis cepat yang memerlukan bahan sangat sedikit, baik penyerap maupun cuplikannya. Ada banyak teknik pemisahan tetapi kromatografi merupakan teknik paling banyak digunakan. Kromatografi sangat diperlukan dalam kefarmasian dalam memisahkan suatu campuran senyawa. Kromatografi merupakan metode pemisahan yang sederhana. Dalam kromatografi, komponen-komponen terdistribusi dalam dua fase. Salah satu fase adalah fase diam. Kromatografi merupakan suatu proses pemisahan yang mana analit analit dalam sampel terdistribusi antara dua fase yaitu fase diam dan gerak. Fase diam dapat berupa bahan padat dalam bentuk molekul kecil atau dalam bentuk cairan yang dilapiskan pada pendukung padat atau dilapiskan pada dinding kolom. Fase gerak dapat berupa gas atau cairan. Jika gas digunakan sebagai fase gerak maka prosesnya dikenal sebagai kromatografi gas. Dalam kromatografi cair dan juga kromatografi lapis tipis, fase gerak yang digunakan selalu cair (Rohman, 2009). Kromatografi melibatkan pemisahan terhadap campuran berdasarkan perbedaan - perbedaan tertentu yang dimiliki oleh senyawanya. Perbedaan yang dapat dimanfaatkan meliputi kelarutan dalam berbagai pelarut serta sifat polar. Kromatografi biasanya terdiri dari fase diam (fase stationer) dan fase gerak (fase mobil).fase gerak membawa komponen suatu campuran melalui fase diam, dan fase diam akan berikatan dengan komponen tersebut
dengan afinitas yang berbeda-beda. Jenis kromatografi yang berlainan bergantung pada perbedaan jenis fase, namun semua jenis kromatografi tersebut berdasar pada asas yang sama. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) yaitu kromatografi yang menggunakan lempeng gelas atau alumunium yang dilapisi dengan lapisan tipis alumina, silika gel, atau bahan serbuk lainnya. Kromatografi lapis tipis pada umumnya dijadikan metode pilihan pertama pada pemisahan dengan kromatografi. Kromatografi lapis tipis adalah metode pemisahan fisikokimia. Lapisan yang memisahkan, yang terdiri atas bahan berbutir butir (fase diam), ditempatkan pada penyangga berupa plat gelas, logam atau lapisan yang cocok. Campuran yang akan dipisah berupa larutan, ditotolkan berupa berupa bercak atau pita (awal). Setelah plat atau lapisan ditaruh didalam bejana tertutup rapat yang berisi larutan pengembang yang cocok. Kromatografi lapis tipis digunakan untuk pemisahan senyawa secara cepat, dengan menggunakan zat penyerap berupa serbuk halus yang dipaliskan serta rata pada lempeng kaca. Lempeng yang dilapis, dapat dianggap sebagai kolom kromatografi terbuka dan pemisahan dapat didasarkan pada penyerapan, pembagian atau gabungannya, tergantung dari jenis zat penyerap dan cara pembuatan lapisan zat penyerap dan jenis pelarut. Kromatografi lapis tipis dengan penyerap penukar ion dapat digunakan untuk pemisahan senyawa polar. Harga Rf yang diperoleh pada kromatografi lapis tipis tidak tetap, jika dibandingkan dengan yang diperoleh pada kromatografi kertas. Oleh karena itu pada lempeng yang sama di samping kromatogram zat yang di uji perlu dibuat kromatogram zat pembanding kimia, lebih baik dengan kadar yang berbeda-beda (Dirjen POM, 1979, hal. 782). Kromatografi lapis tipis menggunakan plat tipis yang dilapisi dengan adsorben seperti silika gel, aluminium oksida (alumina) maupun selulosa. Adsorben tersebut berperan sebagai fasa diam. Fasa gerak yang digunakan dalam KLT sering disebut dengan eluen. Pemilihan eluen didasarkan pada polaritas senyawa dan biasanya merupakan campuran beberapa cairan yang berbeda polaritas, sehingga didapatkan perbandingan tertentu. Eluen KLT dipilih dengan cara trial and error. Kepolaran eluen sangat berpengaruh terhadap Rf (faktor retensi) yang diperoleh. Pada saat senyawa akan di uji di lempeng atau plat tipis, wadah (chamber/gelas kimia) di tutup terlebih dahulu hal ini bertujuan untuk meyakinkan bahwa kondisi dalam gelas kimia terjenuhkan oleh uap dari pelarut. Untuk mendapatkan kondisi ini, dalam gelas kimia atau chamber biasanya ditempatkan kertas saring
yang terbasahi oleh pelarut. Kondisi jenuh dalam gelas kimia dengan uap mencegah penguapan pelarut. Pemisahan terjadi selama perambatan kapiler (pengembangan). Karena pelarut bergerak lambat pada lempengan, komponen-komponen yang berbeda dari campuran pewarna akan bergerak pada kecepatan yang berbeda dan akan tampak sebagai perbedaan bercak warna. Untuk campuran yang tidak diketahui, lapisan pemisah (sifat penyerap) dan sistem larutan pengembang harus dipilih dengan tepat karena keduanya bekerjasama untuk mencapai pemisahan. Selain itu hal yang juga penting adalah memilih kondisi kerja yang optimum yang meliputi sifat pengembangan, jarak pengembangan, atmosfer bejana dan lain- lain. Jarak pengembangan senyawa pada kromatogram biasanya dinyatakan dengan angka Rf Rf = Jarak titik pusat bercak dari titik awal Jarak garis depan dari titik awal Analisis dengan KLT dapat digunakan untuk mengidentifikasi simplisia yang kelompok kandungan kimianya telah diketahui. Kelompok kandungan kimia tersebut antara lain : Alkaloid, antraglikosida, arbutin, glikosida jantung, zat pahit, flavonoid, saponin, minyak atsiri, kumarin, asam fenol karboksilat, valepotriat. Istilah dalam KLT 1. Fase Diam Fase diam yang digunakan dalam KLT merupakan penjerap berukuran kecil dengan diameter partikel antara 10-30 μm. Semakin kecil ukuran rata-rata partikel fase diam dan semakin sempit kisaran ukuran fase diam, maka semakin baik kinerja KLT dalam hal efisiensi dan resolusinya. Penyerap yang paling sering digunakan adalah silika dan serbuk selulosa, sementara mekanisme sorpsi yang utama pada KLT adalah adsorpsi dan partisi(gandjar & Rohman, 2007). 2. Fase Gerak Fase gerak pada KLT dapat dipilih dari pustaka, tetapi lebih sering dengan mencobacoba karena waktu yang diperlukan hanya sebentar. Sistem yang paling sederhana ialah campuran 2 pelarut organik karena daya elusi campuran kedua pelarut ini dapat mudah diatur sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat terjadi secara optimal. Berikut adalah beberapa petunjuk dalam memilih dan mengoptimasi fase gerak :
1. Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena KLT merupakan teknik yang sensitif. 2. Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga Rf terletak antara 0,2-0,8 untuk memaksimalkan pemisahan. 3. Untuk pemisahan dengan menggunakan fase diam polar seperti silika gel, polaritas fase gerak akan menentukan kecepatan migrasi solut yang berarti juga menentukan nilai Rf. Penambahan pelarut yang bersifat sedikit polar seperti dietil eter ke dalam pelarut non polar seperti metil benzene akan meningkatkan harga Rf secara signifikan (Gandjar & Rohman, 2007). BAB III
METODE KERJA 3.1 ALAT DAN BAHAN A. ALAT 1. Plat tetes 2. Pipet tetes 3. Pipet volume 4. Mikropipet 5. Neraca analitik 6. Tabung reaksi 7. Ultrasonik 8. Plat tipis (Silika gel 60 F 254 ) 9. Spektrofotometer UV B. BAHAN 1. Serbuk buah Merica (Piperis Nigri Fructus) 2. Larutan uji untuk KLT, dibuat dengan kadar 5% dalam metanol. 3.2 CARA KERJA A. Analisis histokimia : Ambil dan letakkan ke plat tetes ± 2 mg serbuk buah Piper nigrum Linn Tambahkan ± 5 tetes reagen Asam Sulfat P Asam Sulfat 10N Asam Klorida encer Natrium Hidroksida 5% Kalium Hidroksida 5% Amonia 25% Feri Klorida 5% Amati hasil serbuk buah Piper nigrum Linn setelah pemberian reagen B. Analisis KLT Analisis senyawa identitas dengan KLT dilakukan dengan kondisi sebagai berikut: Pembanding : piperin 0,05 % dalam metanol Volume penotolan : totolkan 5 ul pembanding dan 50 ul larutan uji.
Fase gerak : toluen : etil asetat ( 7:3) Fase diam : silika gel 60 F 254. Penampak noda : draendroff, panaskan lempeng pada 100 o C selama 5-10 menit, kemudian amati pada UV 366 nm. Warna noda : merah bata, Rf piperin ± 0,35 Buat larutan eluen (toluen : etil asetat = 7:3) dalam 10 ml (toluen : etil asetat = 7ml : 3ml) Masukkan dalam chamber, lalu tutup chamber dan pastikan ada kertas saring didalamnya Buat larutan pembanding piperin 0,05% dalam metanol Timbang 5 gram serbuk daun sampel Masukkkan tabung reaksi Larutkan dalam larutan metanol 10 ml Masukkan ke ultrasonik Di saring, masukkan labu ukur Ad dengan metanol Tandai lempeng KLT dengan pensil (setips mungkin) Totolkan eluen sampel dan pembanding (piperin 0,5% dalam metanol) pada lempeng KLT menggunakan mikropipet A. ANALISIS HISTOKIMIA BAB IV PEMBAHASAN Semprotkan larutan anisal dehide ke lempeng KLT Panaskan lempeng, amati di bawah sinar UV, dan hitung nilai Rfnya
Pada uji histokimia Piper nigrum menggunakan beberapa reagen yaitu Asam sulfat P, Asam sulfat 10 N, Asam asetat P, Asam asetat encer, Ammonia 25%, Feri klorida 5%. Reagen yang digunakan pada hasil praktikum tidak semua memberikan hasil yang positif pada uji histokimia Piper nigrum, yang tidak memberikan hasil positif yaitu reagen Asam klorida encer, Natrium Hidroksida 5%, Kalium Hidroksida 5%, dan Feri klorida 5%, sehingga kandungan kimia pada Piper nigrum adalah sebagai berikut : 1. Reagen Asam sulfat P Reagen asam sulfat P merupakan reagen yang digunakan untuk mengidentifikasi senyawa Terpenoid dan pada uji histokimia memberikan hasil positif sehingga Piper Nigri Fructus mengandung Terpenoid. 2. Ammonia 25% Reagen Ammonia merupakan reagen yang digunakan untuk mengidentifikasi senyawa flavonoid dan pada uji histokimia memberikan hasil positif sehingga Piper Nigri Fructus mengandung Flavonoid. 3. Asam asetat P Reagen Asam asetat P merupakan reagen yang digunakan untuk mengidentifikasi senyawa alkaloid dan pada uji histokimia memberikan hasil positif sehingga Piper Nigri Fructus mengandung alkaloid.
Jumlah serbuk daun Serbuk buah Tabel hasil pengamatan +Reagen (5 tetes) Percobaan Literatur Hasil Asam sulfat P Hijau Hijau Positif Asam sulfat 10 N Coklat Coklat Positif Asam asetat P Coklat Coklat Positif Asam asetat Coklat Kuning Negatif Piperis Nigri encer 2mg. Feri klorida 5% Hijau Violet Kuning Negatif Amonia 25 % Coklat Coklat Positif Berdasarkan uji tersebut, dapat ditarik kesimpulan bahwa Piperis Nigri Fructus mengandung senyawa flavonoid, alkaloid, dan terpenoid. B. ANALISIS KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS KLT merupakan metoda kromatografi cair yang melibatkan dua fasa yaitu fasa diam dan fasa gerak. Fasa geraknya berupa campuran pelarut pengembang dan fasa diamnya dapat berupa serbuk halus yang berfungsi sebagai permukaan penyerap (kromatografi cair-padat) atau berfungsi sebagai penyangga untuk lapisan zat cair (kromatografi caircair). Fase gerak kromatografi disebut juga dengan eluent. Fasa diam pada KLT sering disebut penyerap walaupun berfungsi sebagai penyangga untuk zat cair di dalam sistem kromatografi cair-cair. Hampir segala macam serbuk dapat dipakai sebagai penyerap pada KLT, contohnya silika gel (asam silikat), alumina (aluminium oksida), kiselgur (tanah diatomae) dan selulosa. Silika gel merupakan penyerap paling banyak dipakai dalam KLT (Iskandar, 2007).
Pada praktikum kali ini, analisis senyawa identitas dengan KLT dilakukan dengan kondisi sebagai berikut: Pembanding : piperin 0,05 % dalam metanol Volume penotolan : totolkan 5 ul pembanding dan 50 ul larutan uji. Fase gerak : toluen : etil asetat ( 7:3) Fase diam : silika gel 60 F 254. Penampak noda : draendroff, panaskan lempeng pada 100 o C selama 5-10 menit, kemudian amati pada UV 366 nm. Warna noda : merah bata, Rf piperin ± 0,35 Pada praktikum kali ini didapatkan hasil sebagai berikut : jarak tempuh sampel = 3,15 cm jarak tempuh standar = 3,1 cm jarak tempuh eluen = 8 cm Dari data tersebut, maka dapat dihitung nilai Rf sampel dan standar Rf sampel = Jarak tempuh sampel Jarak tempuh eluen = 3,15 cm 8 cm = 0,3938 Rf sampel = Jarak tempuh standar Jarak tempuh eluen = 3,1 cm 8 cm = 0,3875
BAB V PENUTUP Pada uji histokimia, penambahan reagen yang memberikan hasil yang positif dapat ditarik kesimpulan bahwa Piperis Nigri Fructus mengandung senyawa flavonoid, alkaloid, dan terpenoid. Pada analisis dengan metode KLT didapatkan nilai Rf sampel sebesar 0,3938 dan nilai Rf standar sebesar 0,3875, dapat di simpulkan bahwa nilai Rf sampel dan standar berbeda namun tidak terlampau jauh. Pada saat analisis dengan metode KLT terdapat warna ungu saat dipanaskan, selain itu terdapat warn pink dan hijau, hal ini menyatakan bahwa Piperis Nigri Fructus mengandung terpen dan alkaloid.
DAFTAR PUSTAKA Dirjen POM. 1979. Farmakope Indonesia Edisi III. Departemen Kesehatan RI: Jakarta Stahl Egon. 1985. Analisis Obat secara Kromatografi dan Mikroskopi. ITB: Bandung. Depkes RI. 1978. Materia Medika Indonesia Jilid II. Departemen Kesehatan RI: Jakarta Rohman. 2009. Kromatografi untuk Analisis Obat. Graha Ilmu: Yogyakarta Khopkar, S.M. 2002. Konsep Dasar Kimia Analitik. UI-Press: Jakarta.
LAMPIRAN Uji histokimia pada plat tetes serbuk daun Piper nigrum Linn dengan reagen-reagen kimia Eluen sampel setelah penyaringan Lempeng/plat tipis silika gel di bawah sinar UV