METODOLOGI PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian Kegiatan penelitian ini meliputi kegiatan lapang dan kegiatan laboratorium. Kegiatan lapang dilakukan melalui pengamatan dan pengambilan data di Balai Pembibitan Ternak Unggul (BPTU) Indrapuri dan Saree Kabupaten Aceh Besar, Rumah Potong Hewan (RPH) kota Banda Aceh dan RPH Kabupaten Aceh Besar. Kegiatan laboratorium ekstraksi DNA dan karakterisasi keragaman gen GH/Alu I dilakukan di Laboratorium Genetika Molekuler Ternak Bagian Pemuliaan dan Genetika Fapet IPB, sedangkan identifikasi SNP, D-Loop dan DNA Mikrosatelit dilakukan di Laboratorium Molekuler dan Genetik CAAS (Chinese Academy of Agricultural Sciences)-ILRI (International Livestock Research Institute) Beijing-China. Pengujian kualitas karkas dan daging dilakukan di Laboratorium Ruminansia Besar, Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan. Kegiatan penelitian ini dilaksanakan dari bulan Oktober 2009 November 2010. Sampel Darah Sapi Aceh Penelitian ini menggunakan sapi Aceh yang merupakan sapi lokal yang berasal dari Propinsi Nanggroe Aceh Darussalam. Penentuan sampel penelitian di BPTU Indrapuri (Lampiran 1) dan Saree (Lampiran 2), karena kedua tempat tersebut merupakan Balai pembibitan Ternak Unggul sapi Aceh dan RPH Kotamadya Banda Aceh (Lampiran 2) mewakili populasi sapi Aceh di Kotamadya Banda Aceh. Jumlah sampel dari BPTU Indrapuri sebanyak 129 sampel, Saree Aceh Besar sebanyak 54 sampel dan RPH Kotamadya Banda Aceh sebanyak 17 sampel. Pengambilan sampel darah sapi Aceh menggunakan tabung venojact 5 ml pada vena jugularis, kemudian disimpan pada kotak es (ice box) untuk dibawa ke Laboratorium Genetika dan Pemuliaan Ternak Fapet IPB. Sampel darah sapi Aceh untuk sekuensing gen GH (Tabel 1) berasal dari Banda Aceh (14), Saree (17) dan Indrapuri (26). Sekuen sapi pembanding dari Gen Bank (Lampiran 3).
16 Tabel 1 Jumlah sampel darah yang digunakan untuk analisis gen GH/SNP Populasi n Disekuen Hasil sekuen Banda Aceh 17 14 9 Saree 54 17 12 Indrapuri 129 26 23 Total 200 57 44 Sampel DNA yang digunakan untuk sekuensing D-Loop (Tabel 2) berasal dari Banda Aceh (11), Saree (20) dan Indrapuri (29). Sekuen sapi pembanding yang digunakan berasal dari sekuen sapi yang berasal dari GenBank (Lampiran 4). Tabel 2 Jumlah sampel darah yang digunakan untuk analisis D-Loop Populasi n Disekuen Hasil sekuen Banda Aceh 17 11 7 Saree 54 20 2 Indrapuri 129 29 20 Total 200 57 29 Pengambilan sampel darah sapi Aceh untuk DNA mikrosatelit (Tabel 3) berasal dari Banda Aceh (17), Saree (54) dan Indrapuri (129). Tabel 3 Jumlah sampel darah yang digunakan untuk analisis mikrosatelit Hasil sekuen Populasi n BM1824 SPS115 ILSTS028 Banda Aceh 17 8 3 7 Saree 54 37 9 31 Indrapuri 129 81 40 81 Total 200 126 52 119 Sampel Daging Sapi Aceh Penelitian ini menggunakan daging (otot) sapi Aceh yang merupakan sapi lokal yang berasal dari Propinsi Nanggroe Aceh Darussalam. Pengambilan sampel di RPH Kotamadya Banda Aceh sebanyak 12 sampel dan RPH Antasalam Kabupaten Aceh Besar sebanyak 30 sampel (Tabel 4). Sampel otot yang digunakan merupakan otot longisimus dorsi pada bagian rusuk ke 12-13. Sapi yang dipotong merupakan sapi yang dipelihara secara tradisional, yaitu
17 digembalakan pada siang hari dan dikandangkan pada malam hari. Pemotongan dilakukan secara tradisional. Tabel 4 Jumlah sampel daging yang digunakan untuk analisis gen GH/AluI Populasi Jumlah sample RPH Banda Aceh 12 RPH Aceh Besar 30 Total 42 Jumlah sapi yang dipotong sekitar 2-3 ekor/minggu. Pengambilan sampel otot sapi Aceh sebanyak 500 g. Pembekuan sampel otot dilakukan 4-5 jam setelah pemotongan, kemudian disimpan pada kotak es (ice box) dan dibawa ke Laboratorium Genetika dan Pemuliaan Ternak Fapet IPB untuk ekstrasi DNA dan Laboratorium Ruminansia Besar, Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan untuk pengujian kualitas karkas dan daging. Ekstraksi DNA Genom (Darah) Ekstraksi DNA genom yang berasal dari darah sapi Aceh dilakukan dengan metoda Sambrook et al. (1989) yang telah dimodifikasi dengan menggunakan buffer lysis sel (400 µl 1 x STE, dan 40 µl 10% SDS dan 10 µl proteinase-k). DNA dimurnikan dengan metode fenol-kloroform, yaitu dengan menambahkan 40 µl 5 M NaCl dan 400 µl fenol dan kloroform iso amil alkohol (CIAA). DNA diendapkan dengan 40 µl 5 M NaCl dan 800 µl etanol absolut. Endapan dicuci satu kali dengan menambahkan 800 µl 70% etanol, disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 5 menit, etanol (supernatan) dibuang dan pelet diuapkan. Endapan/pelet DNA dilarutkan dengan 10 µl 80% TE (Elution buffer). Ekstraksi DNA Genom (Daging) Ektraksi DNA dilakukan dari daging sapi. Prosedur ektraksi mengikuti metode fenol-kloroform (Sambrook et al. 1989). Sampel yang berasal dari daging dalam alkohol sebanyak 70 mg dimasukan ke dalam tabung 1,5 ml. Alkohol dihilangkan dari sampel dengan menambahkan air destilasi sampai 1000
18 µl, dan dibiarkan selama 20 menit. Sampel kemudian diendapkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 8000 rpm selama 5 menit. Sampel yang telah bersih dari alkohol ditambahkan 1x STE (sodium tris EDTA) sampai volume 340 µl, 40 µl sodium dosesil sulfat 10% dan 20 µl proteinase-k 5 mg/ml. Campuran diinkubasi pada suhu 50 ºC selama semalam sambil digoyang pelan. Sampel yang telah diinkubasi ditambahkan 400 µl larutan fenol, 400 µl kloroform iso amil alkohol (24:1) dan 40 µl NaCl 5M. Campuran digoyang pada suhu ruang selama satu jam. Sampel selanjutnya disentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm selama 10 menit hingga fase air terpisah dengan fase fenol. Fase air dipindahkan dalam tabung baru dengan volume terukur. Molekul DNA diendapkan dengan cara menambahkan 2x volume alkohol absolut dan 0,1x volume NaCl 5M. Campuran kemudian diinkubasi pada suhu -20 ºC selama semalam. Pengendapan DNA selanjutnya dilakukan dengan sentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm selama 10 menit. Endapan DNA yang diperoleh dicuci dengan alkohol 70%, kemudian diendapkan lagi. Endapan DNA yang telah bersih dari alkohol dipulihkan dengan menambahkan 100 µl TE (Tris EDTA). Sampel DNA disimpan pada suhu -20 ºC dan siap untuk digunakan. Identifikasi Single Nucleotide Polymorphism (SNP) Amplifikasi DNA. DNA diamplifikasi dengan metode Polymerase Chain Reaction (PCR). Mesin PCR yang digunakan adalah GeneAmp PCR System 9700 Applied Biosystem. Setiap reaksi PCR dibuat dengan volume 50 µl terdiri atas 5 µl 1x buffer PCR; 4µl dntp;1 µl Taq DNA Polymerase; 1 µl Primer Forward dan Reverse; 3 µl DNA dan 35 µl dh 2 O. Program PCR diatur sebagai berikut: Denaturasi awal pada suhu 94 ºC selama 5 menit dilakukan 1x ulangan, dilanjutkan dengan 33 x ulangan, setiap ulangan terdiri atas denaturasi pada suhu 94 ºC selama 30 detik, 30 detik annealing pada suhu 59 ºC, elongasi pada suhu 72 ºC selama 30 detik, dilanjutkan ekstensi pada suhu 72 ºC selama 5 menit. Produk PCR disimpan pada suhu 4 ºC selama 25 menit. Susunan basa primer yang digunakan ditampilkan pada Tabel 5, sementara susunan keseluruhan basa gen GH dengan kode akses M577641.1 dapat dilihat pada Lampiran 5.
19 Tabel 5 Basa primer GH/AluI (Gen Bank M57764.1, Gordon et al. 1983) Lokus Suhu Annealing Produk PCR Sekuen Primer GH 59 ºC 404 bp F:5'-TAGGGGAGGGTGGAAAATGGA-3' R:5'-GACACCTACTCAGACAATGCG-3' Elektroforesis Produk PCR. Produk PCR dielektroforesis dengan mesin Applied Biosystem 3130x Genetic Analyzer dan dianalisis dengan software GeneMapper versi 4.0. Hasil analisis pada layar monitor akan menunjukkan grafik dengan puncak-puncak (peak) dalam ukuran base pairs (bp) pada masingmasing sampel. Tampilan grafik yang konsisten membentuk satu ukuran puncak yang sama menunjukkan bahwa sampel teramplifikasi dan memiliki alel yang homozigot. Sementara sampel yang memiliki dua puncak dengan ukuran berbeda menunjukkan dua alel yang heterozigot. Apabila terdapat tampilan grafik yang tidak beraturan, ini menandakan hasil yang kosong atau tidak bisa dinilai. Apabila diperoleh tanda sinyal yang lebih dari dua grafik, maka sampel tersebut tercemar dengan DNA yang lain dan tidak digunakan. Analisis Data. Analisis data SNP dari hasil sekuen fragmen gen GH sapi Aceh di analisis kesamaan sekuensnya (homology) dengan sekuen yang terdapat di GenBank (Lampiran 3) dengan software program Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altchul et al. 1997) [www.ncbi.nhl.nih.gov./blast]. Analisis ini bertujuan untuk memastikan bahwa sekuen yang dianalisis adalah fragmen gen GH dengan melihat ukuran panjang basanya, dapat juga untuk mengetahui ada tidaknya mutasi yang terjadi pada gen GH dan sekuen basa nukleotida spesifik. Kesamaan suatu sekuen adalah tinggi apabila nilai yang didapat > 200 bits (Lampiran 6). Frekuensi Gen. Frekuensi genotipe merupakan rasio dari jumlah suatu genotipe terhadap jumlah populasi. Frekuensi alel merupakan rasio suatu alel terhadap keseluruhan alel pada suatu lokus dalam suatu populasi. Frekuensi masingmasing alel setiap lokus dihitung berdasarkan rumus Nei dan Kumar (2000):
20 X i = (2n ii + n ij ) / (2N) Keterangan: X i : frekuensi alel ke-i n ii : jumlah individu untuk genotipe ii n ij : jumlah individu untuk genotipe ij N : jumlah sampel Identifikasi D-Loop Amplifikasi DNA. DNA D-Loop diamplifikasi dengan Polymerase Chain Reaction (PCR). Mesin PCR yang digunakan adalah GeneAmp PCR System 9700 Applied Biosystem. Setiap reaksi PCR memerlukan volume 50 µl dengan komposisi sebagai berikut: 5 µl 1x buffer PCR; 4µl dntp; 1 µl Taq DNA Polymerase; 1 µl primer Forward; 1 µl primer Reverse, 4 µl DNA; dan 34 µl dh 2 O. Denaturasi awal pada suhu 95 ºC selama 5 menit dilakukan 1x ulangan, dilanjutkan dengan 31 x ulangan masing-masing dengan langkah denaturasi pada suhu 94 ºC selama 30 detik, 30 detik annealing pada suhu 60 ºC, elongasi pada suhu 72 ºC selama 30 detik, dilanjutkan ekstensi pada suhu 72 ºC selama 5 menit. Produk PCR disimpan pada suhu 4 ºC selama 25 menit. Susunan basa primer yang digunakan, ditampilkan pada Tabel 6. Tabel 6 Basa primer D-Loop Primer Reff Suhu annealing Produk PCR Sekuen Primer Loftus et al. 1994 60 ºC 980 bp F:5'-CTGCAGTCTCACCATCAACC-3' R:5'-GCTGGGACCAAACCTATGTC-3' Elektroforesis Produk PCR. Produk PCR dielektroforesis dengan mesin Applied Biosystem 3130x Genetic Analyzer dan dianalisis dengan software GeneMapper versi 4.0. Hasil analisis pada layar monitor menunjukkan grafik dengan puncak-puncak (peak) dalam ukuran base pairs (bp) pada masing-masing sampel. Analisa Data. Analisis data D-Loop dilakukan dengan pensejajaran runutan basa nukleotida D-Loop dengan menggunakan software program MEGA versi 4.1 (Tamura et al. 2007), dengan membandingkan sekuen yang berasal dari
21 GenBank (Lampiran 4). Program dnasp (http://www.ub.es/dnasp) digunakan untuk mendapatkan NJ tress dan mengidentifikasikan haplotipe, kemudian digunakan software NETWORK 4.510 (www.fluxus engineering.com/network). Identifikasi DNA Mikrosatelit Amplifikasi DNA Mikrosatelit. Mikrosatelit diamplifikasi melalui Polymerase Chain Reaction (PCR). Mesin PCR yang digunakan GeneAmp PCR System 9700 Applied Biosystem. Setiap reaksi PCR dibuat volume 15 µl dengan komposisi reaksi PCR mengandung 1.5 µl 1x buffer PCR; 1µl dntp; 0.25 µl Taq DNA Polymerase; 0.25 µl primer; 1.5 µl DNA dan 10.5 µl dh 2 O. Denaturasi awal pada suhu 94 ºC selama 5 menit dilakukan 1x ulangan, dilanjutkan dengan 33 x ulangan dengan langkah denaturasi pada suhu 94 ºC selama 30 detik, 30 detik annealing pada suhu 55.5 ºC - 62 ºC, elongasi pada suhu 72 ºC selama 30 detik, dilanjutkan ekstensi pada suhu 72 ºC selama 5 menit, dan suhu penyimpanan 4 ºC selama 25 menit. Susunan basa primer yang digunakan, ditampilkan pada Tabel 7. Tabel 7 Basa primer mikrosatelit lokus BM1824, SPS115 dan ILSTS028 Suhu Produk Lokus annealing PCR (bp) Sekuen Primer BM1824 58 ºC 180-194 F:5'-GAGCAAGGTGTTTTTCCAATC-3' R:5'-CATTCTCCAACTGCTTCCTTG-3' SPS115 65 ºC 234-254 F:5'-AAAGTGACACAACACGTTCTCCAG-3' R:5'-AACGAGTGTCCTAGTTTGGCTGTC-3' ILSTS028 55 ºC 131-165 F:5'-TCCAGATTTTGTACCAGACC-3' R:5'-GTCATGTCATACCTTTGAGC-3' Elektroforesis Produk PCR. Produk PCR dielektroforesis dengan mesin Applied Biosystem 3130x Genetic Analyzer dan dianalisis dengan software GeneMapper versi 4.0. Hasil analisis pada layar monitor menunjukkan grafik dengan puncak-puncak (peak) dalam ukuran base pairs (bp) pada masing-masing sampel. Tampilan grafik yang konsisten membentuk satu ukuran puncak yang sama yang menunjukkan sampel teramplifikasi dan memiliki alel yang homozigot dan sampel yang memiliki dua puncak dengan ukuran berbeda menunjukkan dua alel yang heterozigot (Gambar 3). Apabila ada tampilan grafik
22 yang tidak beraturan, ini menandakan hasil yang kosong, bila diperoleh tanda sinyal yang lebih dari dua grafik, maka sampel tersebut tercemar dengan DNA yang lain dan tidak digunakan. Gambar 3. Grafik hasil elektroforesis Genetic Analyzer Applied Biosystem 3130x Analisis Data. Analisis data mikrosatelit dilakukan dengan software GeneMapper versi 4.0 (Applied Biosystems) dan hasil yang di peroleh di masukkan ke dalam tabulasi data sheet Excel. Frekuensi masing-masing alel setiap lokus mikrosatelit dihitung berdasarkan rumus Nei dan Kumar (2000): X i = (2n ii + n ij ) / (2N) Keterangan: X i : frekuensi alel ke-i n ii : jumlah individu untuk genotipe AiAi n ij : jumlah individu untuk genotipe AiAj N : jumlah sampel Derajat heterozigositas (ĥ) dihitung berdasarkan frekuensi alel pada tiap lokus DNA mikrosatelit dengan rumus Nei dan Kumar (2000) sebagai berikut: ĥ= 2n (1- x i 2 )/(2n-1) Keterangan: x i : frekuensi alel lokus ke-i n : jumlah sampel ĥ : heterozigositas lokus
23 Identifikasi Gen GH/AluI Amplifikasi Gen GH. Amplifikasi ruas gen GH dilakukan dengan metode PCR (polymerase chain reaction). Mesin PCR yang digunakan mesin thermal cycler (Ependorf 5332). Pereaksi yang digunakan untuk amplifikasi ruas gen target adalah 2 µl sampel DNA, masing-masing primer 25 pmol, campuran dntp 200 µm, MgCl 2 1 mm, taq polymerase 0.5 unit dan bufernya dalam larutan total 25 µl. Amplifikasi in vitro dengan mesin thermal cycler dilakukan dengan kondisi denaturasi awal pada suhu 94 ºC selama 5 menit, 35 siklus yang terdiri atas denaturasi pada suhu 94 ºC selama 30 detik, penempelan primer pada suhu 63 ºC selama 45 detik dan pemanjangan DNA baru pada suhu 72 ºC selama 1 menit, dan pemanjangan akhir pada suhu 72 ºC selama 5 menit. Susunan basa primer yang digunakan dapat dilihat pada Tabel 8. Tabel 8 Basa primer GH/AluI (Gen Bank M57764.1, Gordon et al. 1983) Lokus Suhu annealing Produk PCR Sekuen Primer GH/AluI 59 ºC 404 bp F:5'-TAGGGGAGGGTGGAAAATGGA-3' R:5'-GACACCTACTCAGACAATGCG-3' Penentuan Genotipe dengan Pendekatan PCR-RFLP Penentuan genotipe masing-masing individu dilakukan dengan pendekatan restriction fragment length polymorphism (RFLP) yang divisualisasikan pada gel agarosa 1.5% dengan bufer 0,5x TBE (tris borat EDTA) yang difungsikan pada tegangan 100 V selama 40 menit yang diwarnai dengan etidium bromida diatas UV trans illuminator. Enzim pemotong yang digunakan untuk ruas gen target adalah AluI. Analisa Data Frekuensi Gen. Frekuensi genotipe merupakan rasio dari jumlah suatu genotipe terhadap jumlah populasi. Frekuensi alel merupakan rasio suatu alel terhadap keseluruhan alel pada suatu lokus dalam suatu populasi. Frekuensi masingmasing alel setiap lokus dihitung berdasarkan rumus Nei dan Kumar (2000): X i = (2n ii + n ij ) / (2N)
24 X i : frekuensi alel ke- Keterangan: n ii : jumlah individu untuk genotipe ii i n ij : jumlah individu untuk genotipe ij N: jumlah sampel Metode Penilaian Kualitas Karkas dan Daging Sapi Aceh. Penilaian kualitas karkas meliputi bobot potong dan luas urat daging mata rusuk. Prosedur penilaian sebagai berikut: Bobot Potong: Bobot potong merupakan bobot sapi yang dihitung pada saat sapi akan dipotong. Bobot sapi diestimasi dari lingkar dada dengan menggunakan pita ukur. Luas Urat Daging Mata Rusuk: Pengukuran luas urat daging mata rusuk dilakukan pada irisan rusuk 12 dan 13. Patron permukaan irisan luas urat daging mata rusuk dicetak pada plastik dan digambar dengan spidol. Gambar bidang permukaan penampang melintang urat daging mata rusuk ditera dengan plastik grid (satuan satu inchi 2 tiap 10 titik) selanjutnya dihitung dalam satuan cm 2, jumlah titik yang tercakup pada bidang penampang melintang dijadikan ukuran luas urat daging mata rusuk. Penilaian kualitas daging meliputi nilai ph, persentase susut masak, nilai keempukan daging, daya mengikat air dan warna daging. Prosedur untuk pengukuran parameter tersebut diatas diuraikan sebagai berikut: Nilai ph Daging: pengukuran nilai ph daging menggunakan alat ph meter. Sampel daging sebanyak 10 gram ditambahkan 100 ml aquades, kemudian dicampur dengan mixer selama 1 menit selanjutnya diukur dengan ph meter yang telah dikalibrasi pada buffer 4.0 dan 7.0 dan dicatat hasilnya. Nilai keempukan daging: dilakukan dengan menggunakan alat pengukur keempukan. Sampel daging sebesar 200 gram dengan ketebalan ± 10 cm ditusukkan termometer bimetal sampai menembus bagian dalam daging, kemudian dimasukkan ke dalam panci berisi air hingga daging terendam semuanya, selanjutnya daging direbus sampai termometer menunjukkan angka 81 C. Daging dicetak dengan alat pengebor (corer) berdiameter 1.27 cm dan daging diukur untuk mengetahui daya putusnya (kg/cm 2 ). Semakin tinggi nilai yang didapat maka keempukan daging yang diukur semakin rendah.
25 Persentase Susut Masak (cooking loss): yaitu perbedaan antara bobot daging sebelum dan sesudah dimasak dan dinyatakan dalam persentase (%). Sampel daging sekitar 100 g dimasukkan ke dalam air rebus, namun terlebih dahulu ditancapkan termometer bimetal sampai menembus bagian dalam daging. Sampel daging harus terendam dalam air rebusan sampai suhu dalam daging menunjukkan angka 81 C lalu diangkat. Setelah itu sampel didinginkan selama 60 menit lalu ditimbang, selanjutnya setiap 30 menit ditimbang sampai sampel daging mempunyai berat konstan. Warna daging: ditentukan standar warna daging berdasarkan skor warna yaitu dengan menggunakan Photo Graphic Colour Standard. Skor warna tersebut memiliki skala angka dari 1 7, semakin besar skor maka warna daging dinyatakan semakin gelap. Cara mengukur yaitu dengan menentukan kesesuaian warna daging dengan standar warna daging, namun sebelumnya sampel daging disayat terlebih dahulu. Daya mengikat air: dilakukan dengan metode penekanan (press method) sesuai dengan petunjuk Hamm (Swatland 1984) yaitu sampel daging sebanyak 0.3 gram dibebani pada kertas saring diantara dua plat kaca dengan beban tekan sebesar 35kg selama lima menit. Daerah yang tertutup sampel daging dan telah menjadi rata dan luas daerah basah di sekitarnya ditandai dan diukur dengan planimeter. Daerah basah diperoleh dengan perhitungan selisih daerah yang tertutup daging dari daerah total yang meliputi pula area basah pada kertas saring. Jumlah air yang keluar dari daging dihitung dengan rumus: Area basah (cm 2 ) Mg H 2 O = - 0.8 0.0948 Area basah adalah luas air yang diserap pada kertas saring akibat penjepitan selama lima menit, yaitu selisih luas lingkaran luar dan dalam pada kertas saring. Pengukuran luas lingkaran dilakukan dengan planimeter (merk Hruden). Nilai kandungan air yang diperoleh berdasarkan rumus selanjutnya dipersentasikan terhadap bobot sampel, dengan demikian besar nilai yang didapat daya mengikat air daging akan semakin rendah.
26