ISOLASI, IDENTIFIKASI DAN UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN SENYAWA FLAVONOID PADA KULIT BATANG GAYAM SKRIPSI OLEH : MADE HANY ANASTASIA NIM. 1108105020 JURUSAN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS UDAYANA BUKIT JIMBARAN 2015
ISOLASI, IDENTIFIKASI DAN UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN SENYAWA FLAVONOID PADA KULIT BATANG GAYAM SKRIPSI Skripsi ini diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains (S.Si) di Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana OLEH: MADE HANY ANASTASIA NIM. 1108105020 Menyetujui : Pembimbing I Pembimbing II Sri Rahayu Santi, S.Si., M.Si NIP. 19681117 199403 2 003 Dr. Drs. Manuntun Manurung, MS NIP. 19610525 199009 1 001 Mengesahkan Ketua Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana Anak Agung Bawa Putra, S.Si., M.Si. NIP. 19680602 199601 1 001 TEAM PENGUJI SIDANG SKRIPSI ii
TIM PENGUJI SIDANG SKRIPSI ISOLASI, IDENTIFIKASI DAN UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN SENYAWA FLAVONOID PADA KULIT BATANG GAYAM OLEH : MADE HANY ANASTASIA 1108105020 Skipsi ini disidangkan di Bukit Jimbaran Pada hari Rabu tanggal 10 bulan Juni tahun 2015 Tim Penguji Sidang Skripsi Ketua Sekretaris Sri Rahayu Santi, S.Si., M.Si NIP. 19681117 199403 2 003 Dr. Drs. Manuntun Manurung, M.S NIP. 19610525 199009 1 001 Anggota Drs. Made Arsa, M.Si NIP. 19511029 198103 1 003 Dr. Dra. Ni Made Suaniti, M.Si NIP. 19640917 199203 2 009 Ni Luh Rustini, S.Si., M.Si. NIP. 19720910 199802 2 001 iii
ABSTRAK Gayam (Inocarpus fagiferus Fosb.) merupakan tumbuhan tropis yang kulit batangnya telah dimanfaatkan sebagai obat tradisional. Penelitian ini bertujuan untuk menguji aktivitas antioksidan senyawa flavonoid pada kulit batang gayam dan mengidentifikasi golongan flavonoidnya. Ekstraksi 1000 g kulit batang gayam menggunakan etanol 96% menghasilkan ekstrak kental etanol sebanyak 30 g. Partisi 15 g ekstrak etanol-air (7:3) dengan menggunakan kloroform dan n-butanol menghasilkan berturut-turut 1,5 g ekstrak kental kloroform, 5,87 g ekstrak kental n-butanol dan 5,63 g ekstrak air. Uji flavonoid dengan pereaksi Wilstatter dan Bate-Smith Matcalf menunjukkan bahwa ekstrak n-butanol dan ekstrak air positif mengandung flavonoid. Aktivitas antioksidan flavonoid tersebut diuji dengan metode DPPH dan metode lipid peroksida ammonium tiosianat menunjukkan bahwa ekstrak n-butanol memiliki aktivitas sebagai antioksidan dengan nilai IC 50 sebesar 24 ppm dan ekstrak n-butanol memiliki kemampuan dalam menghambat terbentuknya lipid peroksida dengan daya hambat sebesar 63,04 %. Pemisahan ekstrak n-butanol menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT) preparatif dengan fase gerak kloroform dan fase diam silika gel GF 254 menghasilkan 4 fraksi dan uji flavonoid menunjukkan hanya fraksi F3 saja yang positif mengandung flavonoid. Analisis dengan FTIR menunjukkan isolat mengandung gugus fungsi -OH, C=O, C-O alkohol, C=C aromatik, CH aromatik dan CH alifatik. Hasil analisis dengan spektrofotometer UV-vis menunjukkan isolat memiliki dua serapan yaitu pada panjang gelombang 310,60 nm dan 261 nm yang diduga merupakan serapan dari senyawa flavonoid golongan isoflavon dan diperkirakan mempunyai gugus hidroksi pada atom C-5 dan C-7. Uji aktivitas antioksidan menunjukkan isolat flavonoid mampu meredam radikal bebas DPPH dengan nilai IC 50 sebesar 1 ppm. Kata kunci : Gayam, flavonoid, antioksidan. iv
ABSTRACT Gayam (Inocarpus fagiferus Fosb) is a tropical plant that stem bark has been used as traditional medicine. This research aim to identify antioxidant activity isolate flavonoids from stem bark of gayam and identify the class of flavonoids compound. Extraction 1000 g stem bark powder of gayam with 8500 ml of 96 % ethanol to yield 30 g concentrated ethanol extract. Partition of 15 g extract ethanol-water (7:3) with chloroform and n-buthanol to yield 1,5 g concentrated chloroform extract, 5,87 g concentrated n-buthanol extract and 5,63 g concentrated water extract. The flavonoids test using Wilstatter and Bate-Smith Matcalf reagent showed that n-buthanol and water extract contain flavonoids compound. Antioxidant activity of flavonoids tested with DPPH method and and lipid peroxide ammonium thiocyanate method showed that n-buthanol extract had antioxidant activity with value IC 50 of 24 ppm and n-buthanol extract has ability to inhibit the formation of lipid peroxide with value inhibition of 63,04 %. Separation of n-buthanol extract was using thin layer chromatography preparative with chloroform as mobile phase and silica gel GF 254 as stasioner phase were obtained four fraction and the flavonoids test showed that fraction F3 contain flavonoids compound. FTIR analysis was identified that isolate had functional groups such as -OH, C=O, C-O alcohol, C=C aromatic, C-H aromatic and C-H aliphatic. Isolate analysis with UV-vis had 2 peaks at λ 310 nm and 261 nm which indicated flavonoids group of isolfavone and had hydroxyl group at C-5 and C-7. Antioxidant activity test with DPPH method showed that the isolate had antioxidant activity with value IC 50 of 1 ppm. Keywords : Gayam, flavonoids, antioxidant v
KATA PENGANTAR Puji dan syukur penulis panjatkan kehadapan Tuhan Yang Maha Esa karena atas berkat dan rahmat-nya sehingga penulis dapat menyelesaikan Skripsi yang berjudul Isolasi, Identifikasi dan Uji Aktivitas Antioksidan Senyawa Flavonoid pada Kulit Batang Gayam. Pembuatan Skripsi ini merupakan salah satu syarat untuk menyelesaikan pendidikan di Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Skripsi ini dapat tersusun karena bimbingan, arahan dan bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena itu dalam kesempatan ini penulis ingin menyampaikan ucapan terima kasih kepada: 1. Bapak Anak Agung Bawa Putra, S.Si., M.Si. selaku Ketua Jurusan Kimia FMIPA UNUD dan Bapak Dr. I Nengah Wirajana, S.Si., M.Si., selaku Sekretaris Jurusan Kimia FMIPA UNUD. 2. Ibu Sri Rahayu Santi, S.Si., M.Si. selaku dosen pembimbing I, sekaligus sebagai Pembimbing Akademik dan Bapak Dr. Drs. Manuntun Manurung, M.S selaku dosen pembimbing II, yang telah memberikan bimbingan dan dukungan moral serta nasihat hingga skripsi ini dapat terselesaikan. 3. Bapak Drs. Made Arsa, M.Si., Ibu Dr. Dra. Ni Made Suaniti., M.Si. dan Ibu Ni Luh Rusini, S.Si., M.Si. selaku tim penguji terima kasih atas saran dan masukannya. 4. Bapak Dr. Drs. I Made Sukadana, M.Si. terima kasih atas bimbingan dan arahannya sehingga skripsi ini dapat terselesaikan. vi
5. Seluruh staf Dosen dan staf Tata Usaha di lingkungan Jurusan Kimia Fakultas MIPA Universitas Udayana yang telah memberikan bantuan dan dukungan kepada penulis. 6. Bapak I Wayan Darma dan Ibu Ni Ketut Rukmini selaku orang tua penulis serta Putu Indah Permatasari selaku saudara penulis yang telah memberikan nasihat, dukungan, dan bantuan baik secara moral maupun materil. 7. Sahabat-sahabat penulis Sukma Sanjiwani, Meidayanti Putri, Ika Julianan, Dwijayanthi, Lia Kusumaningrum, Putu Yuliantari, Tutut Hardikawati, Eva Arista, Rahma Prabawanti, Sakde Wira Adi Capayanti, Anamalia, Andika Parahita, Saepul Bahri, Wayan Hermawan dan Dupi Andika terimakasih atas bantuannya dan semangatnya selama ini. 8. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu, yang juga turut membantu dan memberikan dukungan dalam menyelesaikan Skripsi ini. Penulis menyadari terbatasnya kemampuan yang penulis miliki sehingga Skripsi ini masih jauh dari sempurna, oleh karena itu kritik dan saran yang positif dari pihal- pihak sangat penulis harapkan demi kesempurnaannya. Bukit Jimbaran, Juni 2015 Penulis vii
DAFTAR ISI Halaman LEMBAR PENGESAHAN... ii TIM PENGUJI SKRIPSI... iii ABSTRAK... iv ABSTRACT... v KATA PENGANTAR... vi DAFTAR ISI... viii DAFTAR TABEL... xi DAFTAR GAMBAR... xii DAFTAR LAMPIRAN... xiii BAB I PENDAHULUAN... 1 1.1 Latar Belakang... 1 1.2 Rumusan Masalah... 3 1.3 Tujuan Penelitian... 3 1.4 Manfaat Penelitian... 3 BAB II TINJAUAN PUSTAKA... 4 2.1 Tumbuhan Gayam... 4 2.2 Antioksidan... 5 2.3 Flavonoid... 8 2.4 Analisis Senyawa Metabolit Sekunder pada Tumbuhan... 12 2.4.1 Ekstraksi... 12 2.4.1.1 Maserasi... 14 2.4.1.2 Partisi... 14 viii
2.4.2 Pemisahan dan Pemurnian... 15 2.4.2.1 Kromatografi lapis tipis... 15 2.4.2.1 Kromatografi lapis tipis preparatif... 16 2.4.3 Metode Identifikasi Isolat Aktif... 17 2.4.3.1 Uji fitokimia... 17 2.4.3.2 Uji aktivitas antioksidan... 18 2.4.3.3 Identifikasi dengan spektrofotomteri UV-vis... 21 2.4.3.4 Identifikasi dengan spektrofotometri FTIR... 26 BAB III METODOLOGI PENELITIAN... 27 3.1 Bahan dan Alat Penelitian... 27 3.1.1 Bahan penelitian... 27 3.1.2 Bahan kimia... 27 3.1.3 Alat penelitian... 27 3.2 Tempat Penelitian... 28 3.3 Prosedur Penelitian... 28 3.3.1 Penyiapan bahan... 28 3.3.2 Ekstraksi kulit batang gayam... 28 3.3.3 Uji flavonoid... 29 3.3.4 Uji aktivitas antioksidan... 29 3.3.4.1 Uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH... 29 3.3.4.2 Uji aktivitas antioksidan dengan metode lipid peroksida ammonium tiosianat... 30 3.3.5 Pemisahan dan pemurnian... 31 3.3.5.1 Kromatografi lapis tipis... 31 3.3.5.2 Kromatografi lapis tipis preparatif... 32 ix
3.3.6 Identifikasi isolat aktif... 33 3.3.6.1 Analisis dengan spektrofotometer UV-vis... 33 3.3.6.1 Analisis dengen spektrofotometer FTIR... 34 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN... 35 4.1 Identifikasi dan Penyiapan Bahan... 35 4.2 Ekstraksi Kulit Batang Gayam... 35 4.3 Uji Flavonoid Ekstrak Hasil Partisi... 36 4.4 Uji Aktivitas Antioksidan... 36 4.4.1 Penentuan panjang gelombang maksimum DPPH... 36 4.4.2 Uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH... 37 4.4.3 Uji aktivitas antioksidan dengan metode lipid peroksida ammonium tiosianat... 39 4.5 Pemisahan dan Pemurnian Senyawa Golongan Flavonoid... 41 4.5.1 Hasil pemisahan dengan KLT preparatif... 41 4.5.2 Hasil pemurnian dengan KLT... 43 4.6 Identifikasi Isolat Aktif... 44 4.6.1 Identifikasi dengan FTIR... 45 4.6.2 Identifikasi dengan UV-vis... 46 4.6.3 Uji aktivitas antioksidan isolat aktif... 49 BAB V SIMPULAN DAN SARAN... 52 DAFTAR PUSTAKA... 53 LAMPIRAN... 56 CURRICULLUM VITAE... 69 x
DAFTAR TABEL Halaman Tabel 2.1 Perubahan Warna Berbagai Golongan Flavonoid... 11 Tabel 2.2 Fase Gerak Untuk Analisis KLT... 16 Tabel 2.3 Rentang Absorbansi Spektrum UV-vis Senyawa Flavonoid... 23 Tabel 4.1 Ekstrak Pekat Hasil Partisi... 35 Tabel 4.2 Hasil Uji Flavonoid pada Masing-Masing Ekstrak Hasil Partisi... 36 Tabel 4.3 Data Absorbansi dan Perhitungan Persen (%) Peredaman Radikal Bebas Ekstrak n-butanol Kulit Batang Gayam... 37 Tabel 4.4 Data Absorbansi dan Perhitungan Persen (%) Peredaman Radikal Bebas Ekstrak Air Kulit Batang Gayam... 38 Tabel 4.5 Hasil Absorbansi Kompleks Lipid Peroksida... 40 Tabel 4.6 Hasil Daya Hambat Pembentukan Lipid Peroksida Ekstrak... 40 Tabel 4.7 Hasil Pemisahan Komponen Ekstrak n-butanol dengan KLT... 41 Tabel 4.8 Hasil Pemisahan Ekstrak n-butanol dengan KLT Preparatif... 42 Tabel 4.9 Hasil Uji Flavonoid Fraksi Hasil KLT Preparatif... 43 Tabel 4.10 Hasil KLT Uji Kemurnian... 44 Tabel 4.11 Data Spektrum Inframerah... 46 Tabel 4.12 Data Panjang Gelombang dan Pergeseran Panjang Gelombang... 48 Tabel 4.13 Hasil Pengukuran Aktivitas Antioksidan Pada Isolat F3... 49 xi
DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 2.1. Struktur Dasar Senyawa Flavonoid... 8 Gambar 2.2. Struktur Beberapa Senyawa Flavonoid... 9 Gambar 2.3. Reaksi DPPH dengan Atom H Netral dari Flavanol... 19 Gambar 2.4. Resonansi Senyawa Flavonoid... 22 Gambar 2.5 Reaksi Golongan Senyawa Flavonoid dengan Peraksi Geser NaOH... 24 Gambar 2.6 Reaksi Golongan Senyawa Flavonoid dengan Peraksi Geser NaOAc dan H 3 BO 3... 24 Gambar 2.7 Reaksi Golongan Senyawa Flavonoid dengan Peraksi Geser AlCl 3 dan HCl... 25 Gambar 4.1 Grafik Hubungan Konsentrasi Ekstrak n-butanol dengan Persen (%) Peredaman Radikal Bebas Rata-Rata... 38 Gambar 4.2 Grafik Hubungan Konsentrasi Ekstrak Air dengan Persen (%) Peredaman Radikal Bebas Rata-Rata... 39 Gambar 4.3 Kromatogram Lapis Tipis dari Beberapa Eluen... 41 Gambar 4.4. Kromatogram Lapis Tipis Preparatif... 42 Gambar 4.5. Kromatogram Lapis Tipis Uji Kemurnian... 44 Gambar 4.6. Spektrum Inframerah dari Isolat... 45 Gambar 4.7. Spektra UV-vis dari Isolat... 47 Gambar 4.8. Dugaan Struktur Senyawa Flavonoid Isolat... 49 Gambar 4.9 Grafik Hubungan Antara Konsentrasi Isolat dengan Persen (%) Peredaman Radikal Bebas Rata-Rata... 50 Gambar 4.10 Dugaan Penangkapan Radikal Bebas oleh Isolat... 51 xii
DAFTAR LAMPIRAN Halaman Lampiran 1. Hasil Determinasi Tanaman Gayam... 56 Lampiran 2. Skema Kerja Ekstraksi dan Partisi Senyawa Flavonoid pada Kulit Batang Gayam... 57 Lampiran 3. Skema Kerja Pemisahan, Pemurnian dan Identifikasi Kulit Batang Gayam... 58 Lampiran 4. Perhitungan Pembuatan Larutan Sampel dan Larutan DPPH... 59 Lampiran 5. Perhitungan Pembuatan Buffer Fospat... 62 Lampiran 6. Pembuatan 0,02 M FeCl 2 M dalam 3,5 % HCl... 64 Lampiran 7. Pembuatan larutan ammonium tiosianat... 66 Lampiran 8. Perhitungan Persen (%) Peredaman Radikal Bebas dan Persen (%) Daya Hambat... 67 Lampiran 9. Spektra panjang gelombang maksimum DPPH... 68 xiii