47 LAMPIRAN LAMPIRAN 1. Alur Kerja Ekstraksi Biji Alpukat (Persea Americana Mill.) Menggunakan Pelarut Metanol, n-heksana dan Etil Asetat Biji Alpukat - Dicuci dibersihkan dari kotoran - Di potong menjadi ukuran yang lebih kecil - Dimasukkan ke dalam oven pada suhu 30-40 o C sampai kering - Dihaluskan - Dimasukkan dalam tabung Erlenmeyer 500 ml - Ditambahkan ± 150 ml pelarut metanol - Dimaserasi selama 3 hari - Disaring dan disimpan dalam tabung Erlenmeyer lain - Dimaserasi kembali dengan volume yang sama Maserat - Disentrifuse pada kecepatan 3000 rpm selama 15 menit Supernatan - Dipekatkan dengan menggunakan rotary - Evaporator pada suhu tidak lebih dari 50 C - Hal yang sama dilakukan terhadap jenis pelarut n-heksana dan etil asetat Ekstrak Biji Alpukat
48 LAMPIRAN 2. Alur Kerja Pembuatan Larutan Standar McFarland 10 8 CFU/ml 0,048 M 0,18 M - Diambil sebanyak 0,5 ml - Diambil sebanyak 99,5 ml - Dihomogenkan kedua larutan Hasil Larutan standar 0,5 McFarland 1x 108 CFU/ml - Diukur densitas suspensi dengan menggunakan spektrofotometer (nilai O.D. 625nm ± 0,13)
49 LAMPIRAN 3. Skrining Fitokimia Pemeriksaan Alkaloida 0,5 g serbuk biji alpukat - Ditambahkan 1 ml asam klorida 2 N - Ditambahkan 9 ml akuadest - Dipanaskan diatas penangas air selama 2 menit - Didinginkan - Disaring Filtrat Hasil - Diambil 3 tetes filtrat, lalu ditambahkan 2 tetes pereaksi Meyer - Diambil 3 tetes filtrat, lalu ditambahkan 2 tetes pereaksi Bouchardat - Diambil 3 tetes filtrat, lalu ditambahkan 2 tetes pereaksi Dragendorf
50 Pemeriksaan Flavonoida 0,5 g serbuk biji alpukat Filtrat Larutan - Dilarutkan dengan 10 ml metanol - Direfluks selama 10 menit - Disaring panas-panas melalui kertas saring - Diencerkan dengan 10 ml akuadest - Ditambah 5 ml n-heksan - Dikocok - Didiamkan - Diambil lapisan metanol - Diuapkan pada temperature 40 0 C - Sisa dilarutkan dalam 5 etil asetat - Disaring - Diuapkan 1 ml larutan hingga kering - Diuapkan 1 ml larutan hingga kering - Dilarutkan dalam 1-2 ml etanol 96% - Dilarutkan dalam 1 ml etanol 96% - Ditambahkan 0,5 g serbuk seng - Ditambahkan 0,1 g magnesium - Ditambahkan 2 ml asam klorida 2N - 10 tetes asam klorida pekat - Didiamkan selama satu menit - Ditambahkan 10 ml asam klorida pekat Larutan berwarna merah Larutan berwarna merah jingga/ungu Pemeriksaan Tanin 0,5 g serbuk biji alpukat - Dilarutkan dengan 10 ml akuadest - Disaring - Filtratnya diencerkan dengan akuadest sampai tidak berwarna - Diambil 2 ml larutan - Ditambahkan 1-2 tetes pereaksi besi (III) klorida Berwarna biru/hijau kehitaman
51 Pemeriksaan Glikosida 3 g serbuk biji alpukat 20 ml filtrat - Dilarutkan dengan 30 ml campuran etanol 96% akuadest - Ditambahkan 10 ml HCl 2 N - Direfluks selama 10 menit - didinginkan - Disaring - Ditambahkan 25 ml akuadest - Ditambahkan 25 ml timbal (II) asetat 0,4 M - Dikocok - Didiamkan selama 5 menit - Disaring - Dilarutkan dengan 20 ml campuran kloroform:isopropanol (3:2) - Ditambahkan natrium sulfat anhidrat secukupnya - Disaring - Diuapkan pada temperatur tidak lebih dari 500C - Dilarutkan sisanya dengan 2 ml metanol - Diambil 0,1 ml larutan percobaan di masukkan kedalam tabung reaksi - Diuapkan - Ditambahkan 2 ml air - Ditambahkan 2 tetes pereaksi molish - Ditambahkan hati-hati 2 ml asam sulfat pekat Cincin warna ungu Pemeriksaan Saponin 0,5 g serbuk - Dimasukkan kedalam tabung reaksi - Ditambahkan 10 ml akuadest - Didinginkan - Dikocok kuat-kuat selama 10 detik - Timbul busa yang mantap tidak kurang dari 10 menit setinggi 1-10 cm - Ditambahkan 1 tetes larutan asam klorida 2 N Busa
52 Pemeriksaan Steroida/triterpenoida 1 g serbuk - Dimaserasi dengan 20 ml n-heksan selama 2 jam - Filtrat diuapkan dalam cawan penguap - Ditambahkan 2 tetes asam asetat anhidrat - Ditambahkan 1 tetes asam sulfat pekat Warna ungu atau merah kemudian berubah menjadi biru hijau
53 LAMPIRAN 4. Uji Toksisitas dengan Metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) Sampel 20 mg Dilarutkan dalam 2 ml metanol Larutan induk konsentrasi 10000 ppm @ 0,5 ml ke dalam 3 vial Ketika ditambahkan air laut konsentrasi menjadi @ 0,5 ml ke dalam 3 Ketika ditambahkan air laut konsentrasi menjadi 100 ppm 0,5 ml 0,5 ml Ditambahkan 5 ml metanol Larutan dengan konsentrasi 1000 ppm Ditambahkan 5 ml metanol Larutan dengan konsentrasi 100 ppm @ 0,5 ml ke dalam 3 vial - Dibiarkan pelarutnya menguap - Ditambahkan 50 µl dimetilsulfoksida (DMSO) - Ditambahkan air laut hingga hampir mencapai batas kalibrasi - 10 ekor larva udang dimasukkan ke dalam masing-masing vial uji - Kemudian tambahkan air laut hingga batas kalibrasi - Biarkan selama 24 jam dan hitung larva yang mati Hitung nilai LC 50
54 LAMPIRAN 5. Alur Kerja Daya Hambat Ekstrak Biji Alpukat (Persea Americana Mill.) Terhadap Bakteri Patogen Bakteri Ekstrak Biji - Disubkultur selama ± 24 jam pada media N - Diencerkan dengan DMSO sesuai konsentrasi yaitu 5, 10, 15, dan 20% - Diambil dengan jarum ose - Ditetesi sebanyak 10μl pada cakram kertas steril - Dilarutkan dalam larutan fisiologis (NaCl 0.9%) - Kontrol (-) digunakan cakram kertas yang berisi 10μl DMSO - Dihomogenkan dan disesuaikan kekeruhannya - Kontrol (+) digunakan cakram kertas dengan standar McFarland kloramfenikol 30μg dan nistatin 10µg Suspensi Bakteri - Disebarkan dengan cotton swab pada permukaan media MHA - Diletakkan cakram kertas yang sudah berisi ekstrak meatbolit sekunder isolat potensial Hasil - Diinkubasi pada T: 37 o C selama 24-48 jam - Diukur zona hambat yang terbentuk dengan jangka sorong Diameter Zona
55 LAMPIRAN 6. Hasil Uji Toksisitas Ekstrak Biji Alpukat 1. Hasil Uji Toksisitas Ekstrak Metanol Dengan Metode BSLT Konsentrasi (μg/ml) Jumlah larva Artemia tiap uji Jumlah larva Artemia yang mati Persen kematian (%) Nilai probit 1 2 3 Rata-rata 1 10 0 0 0 0 0 0 3 10 1 1 1 1 10 3,178 5 10 2 2 1 1,7 17 4,046 Nilai Probit 5 4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 Kurva Uji Toksisitas Ekstrak Metanol y = 1.011x - 0.626 0 1 2 3 4 5 6 Konsentrasi (µg/ml) PerhitunganLC 50 : Persamaanregresi : y =ax+b Maka y = 1,0115x -0,6265 a = 1,0115 b = -0,6265 Untuk LC 50 responadalah 50% sehingganilaiprobit (y) adalah 5,00 5 = 1,0115x -0,6265 1,0115 x = 5 +0,6265 1,0115x = 5,6265 x = 5,6 LC 50 = x = 5,6 µg/ml (ppm) 2. Hasil Uji Toksisitas Ekstrak Etil Asetat Dengan Metode BSLT
56 Konsentrasi (µg/ml) Jumlah larva Artemia tiap uji Jumlah larva Artemia yang mati Persen kematian (%) Nilai probit 1 2 3 Rata-rata 1 10 2 0 1 1 10 3,178 3 10 3 0 2 1,7 17 4,046 5 10 10 10 10 10 100 9,768 12 Kurva Uji Toksisitas Ekstrak Etil Asetat Nilai Probit 10 8 6 4 2 0 y = 1.647x + 0.721 0 1 2 3 4 5 6 Konsentrasi (µg/ml) PerhitunganLC 50 : Persamaanregresi : y = ax+b Maka y = 1,6475x + 0,7215 a = 1,6475 b = 0,7215 Untuk LC 50 responadalah 50% sehingganilaiprobit (y) adalah 5,00 5 = 1,6475x + 0,7215 1,6475 x = 5 0,7215 1,6475 x = 4,2785 x = 2,6 LC 50 = x = 2,6μg/mL(ppm) 3. Hasil Uji Toksisitas Ekstrak N-Heksan Dengan Metode BSLT
57 Konsentrasi (μg/ml) Jumlah larva Artemia tiap uji Jumlah larva Artemia yang mati Persen kematian (%) Nilai probit 1 2 3 Rata-rata 1 10 1 1 1 1 10 3,178 3 10 6 5 1 4 40 4,747 5 10 10 8 5 7,7 77 5,772 Nilai Probit 7 6 5 4 3 2 1 0 Kurva Uji Toksisitas Ekstrak n-heksan y = 0.648x + 2.620 0 1 2 3 4 5 6 Konsentrasi (μg/ml) PerhitunganLC 50 : Persamaanregresi : y = ax+b Maka y = 0,6485x + 2,6202 a = 0,6485 b = 2,6202 Untuk LC 50 responadalah 50% sehingganilaiprobit (y) adalah 5,00 5 = 0,6485x + 2,6202 0,6485 x = 5 2,6202 0,6485 x =2,3798 x =3,7 LC 50 = x = 3,7μg/mL (ppm) Tabel Nilai Probit % 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0. 2,674 2,946 3,119 3,249 3,355 3,445 3,524 3,595 3,659
58 10 3,178 3,773 3,825 3,874 3,920 3,964 4,006 4,046 4,085 4,122 20 4,158 4,194 4,228 4,261 4,294 4,326 4,357 4,387 4,417 4,447 30 4,476 4,504 4,532 4,560 4,597 4,615 4,642 4,668 4,695 4,721 40 4,747 4,733 4,798 4,824 4,849 4,900 4,925 4,950 4,950 4,975 50 5,000 5,030 5,050 5,075 5,100 5,126 5,151 5,182 5,202 5,277 60 5,253 5,279 5,305 5,332 5,358 5,385 5,413 5,468 5,468 5,496 70 5,524 5,553 5,583 5,613 5,643 5,674 5,706 5,772 5,722 5,806 80 5,842 5,878 5,519 5,854 5,994 6,036 6,080 6,125 6,175 6,227 90 6,282 6,341 6,405 6,476 6,576 6,645 6,751 6,881 7,054 7,326 100 9,768