III. METODOLOGI 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Maret sampai dengan Mei 2012 di Laboratorium Budidaya Perikanan Fakultas Pertanian Universitas Lampung. 3.2 Alat dan Bahan 3.2.1 Penelitian Pendahuluan 3.2.1.1 Pembuatan Media Adapun alat dan bahan yang digunakan dalam pembuatan media adalah sebagai berikut: (1) Alat : Petridish (Normax ), tabung reaksi (Iwaki glass TM ), erlenmeyer (Pyrex ), hot stirrer plate (Stuart CB162 TM ), corong (Iwaki glass TM ), lampu bunsen, autoclave, sprayer, alumunium foil, timbangan digital (BOECO Germany d=0,001 gr), kapas, karet, plastik dan refrigerator. (2) Bahan : Alkohol 70%, aquadest, media TSA (Tryptone Soya Agar) (OXOID TM, USA), TSB (Tryptone Soya Broth) (OXOID TM, USA), GSP (Glutamate Starch Phenol-red) (MERK TM, Germany).
3.2.1.2 Pembuatan Vaksin A. salmonicida dengan Penambahan Adjuvant Adapun alat dan bahan yang digunakan dalam pembuatan vaksin A. salmonicida dengan penambahan adjuvant adalah sebagai berikut: (1) Alat : Jarum ose (Pyrex ), spektrofotometer (Genesys-20, Thermospectronic), mikropipet (Nesco ), dan sentrifuge (80 2). (2) Bahan : Formaln 1%, isolat bakteri A. salmonicida (koleksi stasiun karantina ikan kelas I Panjang, Lampung), PBS (phospat buffer saline), Al(OH) 3, KAl(SO 4 ) 2, dan FIA. 3.2.1.3 Persiapan Penelitian Adapun alat dan bahan yang digunakan dalam persiapan penelitian adalah sebagai berikut: (1) Alat : Akuarium ukuran 60x40x40 cm 3 15 buah (5 perlakuan dengan 3 kali ulangan), aerator, selang aerasi, dan batu aerasi. (2) Bahan : Ikan mas (Cyprinus carpio L) ukuran ± 30 gr sebanyak 200 ekor (berasal dari petani ikan, Pringsewu, Lampung), dan pakan ikan komersil dengan kadar protein 30 32%. 3.2.2 Uji Pengaruh Penambahan Adjuvant pada Vaksin A. salmonicida Adapun alat dan bahan yang digunakan dalam uji pengaruh penambahan adjuvant pada vaksin A. salmonicida adalah sebagai berikut: (1) Alat : Needle/spuit 26 G ukuran 1 ml (Terumo TM ), botol falcon (Iwaki TM ), skopnet, baskom berbahan plastik.
(2) Bahan : Ikan uji, vaksin inaktif A. salmonicida, vaksin inaktif A. salmonicida dengan penambahan Al(OH) 3, vaksin inaktif A. salmonicida dengan penambahan KAl(SO 4 ) 2, dan vaksin inaktif A. salmonicida dengan penambahan FIA. 3.2.3 Pengamatan 3.2.3.1 Titer Antibodi Adapun alat dan bahan yang digunakan dalam pengamatan titer antibodi adalah sebagai berikut: (1) Alat : Needle/spuit 26 G ukuran 1 ml, refrigerator, botol falcon, micrdilution plate (REF. 650101, Greiner bio one TM ; PS microplate 96 well), mikropipet, tabung eppendorf (Pyrex. Under lic), plastik, dan sentrifuge. (2) Bahan : Minyak cengkeh, larutan EDTA (Ethylen Diamine Tetracetic Acid) (LT-Baker TM ), Sampel darah ikan mas per ulangan (tanpa vaksin dan adjuvant, tanpa adjuvant, vaksin dengan penambahan Al(OH) 3, vaksin dengan penambahan KAl(SO 4 ) 2, dan vaksin dengan penambahan penambahan FIA). 3.2.3.2 Analisis Kualitas Air Adapun alat dan bahan yang digunakan untuk pengukuran kualitas air adalah sebagai berikut: (1) Alat : Termometer suhu (Japan. 1-100 0 C), ph meter (Hanna Instruments. Microcomputer. Ketelitian:0,00 14,00), dan DO meter (Lutron. DO-5509). (2) Bahan : Sampel air akuarium pemeliharaan ikan mas (Cyprinus carpio L).
3.3 Rancangan Penelitian Dalam penelitian ini adjuvant ditambahkan ke dalam vaksin inaktif A. salmonicida dengan 5 perlakuan (3 perlakuan penambahan adjuvant dan 2 perlakuan sebagai kontrol). Pada setiap perlakuan diulang sebanyak 3 kali. Perlakuannya adalah sebagai berikut : Perlakuan A : Kontrol (-) tanpa pemberian vaksin maupun adjuvant (3 ulangan) Perlakuan B : Kontrol (+) pemberian vaksin tanpa penambahan adjuvant (3 ulangan) Perlakuan C : Pemberian vaksin dengan penambahan Al(OH) 3 sebanyak 6 ppm (3 ulangan) Perlakuan D : Pemberian vaksin dengan penambahan KAl(SO 4 ) 2 sebanyak 6 ppm (3 ulangan) Perlakuan E : Pemberian vaksin dengan penambahan FIA, perbandingan vaksin dan FIA sebesar 1:1 (3 ulangan) Dosis pemberian Al(OH) 3 dan KAl(SO 4 ) 2 sebanyak 6 ppm mengacu pada penelitian yang dilakukan oleh Retmonojati (2007), dan dosis Penambahan FIA dengan perbandingan vaksin dan FIA sebesar 1:1 mengacu pada penelitian yang dilakukan oleh Fikri, dkk (2002). Model Rancangan Acak Lengkap dengan uji Annova yang digunakan adalah sebagai berikut: Yij = µ + τi + ij Keterangan: i : Perlakuan A, B, C, D, dan E
j : Ulangan 1, 2, dan 3 Yij : Nilai pengamatan dari penambahan jenis adjuvant yang berbeda ke-i terhadap imunogenisitas vaksin inaktif whole cell A. salmonicida pada ikan mas ulangan ke-j µ : Nilai tengah umum τi : Pengaruh pemberian jenis adjuvant yang berbeda ke-i terhadap imunogenisitas vaksin inaktif whole cell A. salmonicida pada ikan mas. ij : Pengaruh Galat Percobaan pada penambahan jenis adjuvant yang berbeda ke-i terhadap imunogenisitas vaksin inaktif whole cell A. salmonicida pada ikan mas ulangan ke-j (Mattjik dan Sumertajaya, 2002). Rancangan acak lengkap (RAL) digunakan untuk menguji perbedaan antar perlakuan pada taraf kepercayaan 95% dan dilanjutkan dengan uji Dunnet jika perlakuan berbeda nyata. 3.4 Metode Penelitian 3.4.1 Penelitian Pendahuluan 3.4.1.1 Pembuatan Media Adapun metode pembuatan media pada penelitian ini adalah sebagai berikut: (1) Disterilisasi alat dan bahan yang akan digunakan. (2) Disiapkan media-media yang akan digunakan (TSB, TSA, GSP). (3) Ditimbang media-media yang digunakan sesuai dengan takaran pada kemasan lalu dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer.
(4) Ditambahkan aquadest kemudian dihomogenisasi menggunakan hor stirrer plate. (5) Media TSB dituangkan ke dalam tabung reaksi, media TSA dan GSP dituangkan ke dalam cawan petri. Proses penuangan dilakukan di dekat bunsen agar bakteri yang tidak dibutuhkan tidak tumbuh pada media tersebut. (6) Media kemudian disterilisasi dengan autoklaf. (7) Media disimpan dalam refrigerator dan siap digunakan. 3.4.1.2 Pembuatan Vaksin A. salmonicida dengan Penambahan Adjuvant Adapun metode pembuatan vaksin A. salmonicida dengan penambahan adjuvant adalah sebagai berikut: (1) Isolat bakteri A. salmonicida dikultur pada media cair TSB, lalu diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang. (2) Dilakukan pengkayaan dengan cara inokulum A. salmonicida dipindahkan dari media TSB ke media TSA lalu diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang. (3) Kemudian dilakukan pemanenan bakteri A. salmonicida dengan cara dikumpulkan dengan batang spreader dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer menggunakan corong. (4) Vaksin diinaktifasi dengan penambahan formalin 1% kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang. (5) Dilakukan uji viabilitas bakteri pada medium spesifik GSP dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang. (6) Jika bakteri sudah tidak tumbuh, dilakukan pencucian formalin menggunakan PBS dengan cara dipisahkan vaksin dengan formalin menggunakan sentrifuge
dengan kecepatan 3500 rpm selama 30 menit. Pencucian formalin dilakukan sebanyak 3 kali, setiap kali dilakukan pencucian formalin, cairan atau supernatant dibuang. (7) Dihitung kepadatan vaksin inaktif dengan spektrofotometer (λ=625 nm) mengacu pada standar McFarland. (8) Ditambahkan adjuvant masing-masing sebanyak 6 ppm (Al(OH) 3 dan KAl(SO 4 ) 2 ) ke dalam vaksin, dan perbandingan 1:1 untuk FIA. 3.4.1.3 Persiapan Penelitian Adapun metode persiapan penelitian adalah sebagai berikut: (1) Dipersiapkan ikan mas (Cyprinus carpio L) ukuran ±30 gr sebanyak 200 ekor lalu diadaptasi selama 1 minggu di bak tandon yang diberi aerasi (2) Kemudian ikan dimasukkan ke dalam akuarium ukuran (60x40x40cm 3 ) dengan kepadatan 10 ekor per akuarium tiap ulangan (3) Selama masa pemeliharaan atau adaptasi, ikan diberi aerasi serta diberi pakan pelet 2 3 kali sehari menggunakan pelet komersial secara adlibitum yaitu pakan diberikan sedikit demi sedikit hingga ikan tidak merespon lagi pakan yang diberikan. (4) Dilakukan juga manajemen kualitas air dan kesehatan ikan diantaranya siphon, ganti air dan lain - lain. 3.4.2 Uji Pengaruh Penambahan Adjuvant pada Vaksin A. salmonicida Vaksin diberikan pada setiap ikan uji dengan metode penyuntikan secara intra peritoneal (i.p) dengan dosis pemberian vaksin 0,1 ml/ikan dengan kepadatan bakteri 10 7 sel/ikan (Kamiso, dkk., 2005). Vaksin diberikan 2 kali yaitu vaksinasi
I pada awal pemeliharaan dan vaksinasi II (booster) diberikan seminggu setelah vaksinasi I. 3.4.3 Pengamatan 3.4.3.1 Titer Antibodi Pengambilan sampel darah untuk uji titer antibodi dilakukan sebelum vaksinasi, seminggu setelah vaksinasi I, seminggu setelah vaksinasi II (booster), dan 30 hari setelah pemeliharaan. Adapun metode pengambilan darah adalah sebagai berikut: (1) Ikan diambil dan dimasukkan ke dalam ember lalu terlebih dahulu dibius dengan minyak cengkeh. (2) Spuit ukuran 1 ml dibilas dengan larutan EDTA, lalu darah ikan diambil menggunakan spuit pada bagian vena caudalis. (3) Darah ikan yang telah diambil dimasukkan dalam tabung eppendorf lalu dipisahkan antara plasma darah dan endapannya dengan menggunakan sentrifuge dengan kecepatan 3500 rpm selama 15 menit untuk mendapatkan serumnya. (4) Diambil serum darah ikan pada bagian atas hasil sentrifuge kemudian endapannya dibuang. (5) Serum darah ikan yang diambil dapat disimpan pada refrigerator. Pengamatan titer antibodi dilakukan menggunakan mikrodilution plate dengan metode aglutinasi mengacu pada prosedur standar mikroaglutinasi (Roberson, 1990) dengan sedikit modifikasi secara lengkap, tanpa uji aglutinasi sebagai berikut :
(1) Serum @ 25 µl dimasukkan ke dalam sumuran 1 dan 2. (2) PBS @ 25 µl dimasukkan ke dalam sumuran 2 12. (3) Sumuran kedua direpipeting untuk mengencerkan serum, kemudian dilanjutkan ke sumuran 3-11. (4) Ag @ 25 µl dimasukkan ke dalam sumuran 1 12. (5) Mikrodilution plate digoyang goyangkan selama 3 menit dengan pola membentuk angka 8. (6) Hasil titer diinkubasi dalam refrigerator selama 1 malam. (7) Dilakukan pengamatan reaksi aglutinasi pada masing masing sumuran yang ditandai dengan adanya kabut berwarna putih yang menyebar ke seluruh sumuran yang berarti antibodi telah terbentuk. 3.4.3.2 Analisis Kualitas Air Parameter kualitas air yang diamati adalah oksigen terlarut, ph, dan suhu. Pengukuran kualitas air dilakukan dua kali sehari pada pagi dan sore hari. 3.5 Parameter Uji Parameter yang diamati dalam penelitian ini adalah pengaruh penambahan adjuvant yang dilihat dari titer antibodi dan kualitas air (suhu, DO, dan ph). 3.6 Analisis Data Rancangan yang dipakai dalam penelitian ini yaitu rancangan acak lengkap (RAL). Data yang didapatkan dianálisis dengan análisis ragam (annova) dan diperlihatkan dalam bentuk grafik dan tabel. Apabila hasil uji antar perlakuan berbeda nyata maka dilakukan uji lanjut Dunnet dengan selang kepercayaan 95%.