BAB III METODE PENELITIAN A. Metodologi Penelitian Penelitian ini dilakukan dengan menggunakan metodologi penelitianeksperimental. Dalam hal ini 3 sampel kecap akan diuji kualitatif untuk mengetahui kandungan natrium benzoat, kemudian sampel yang dinyatakan positif mengandung natrium benzoat diuji kuantitatif untuk mengetahui kadar natrium benzoat dalam sampel kecap tersebut. B. Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah timbangan analitik (OHAUSS),cawan porselen,corong (pyrex), kertas saring, Erlenmeyer (pyrex),spektrofotometer UV-Visibel (Shimadzu AA-6650), hotplate, penangas air, dan alat-alat gelas. Bahan yang digunakan: kecap, akuades, asam benzoat (p.a Merck), dietil eter (C 2 H 5 OC 2 H 5 ) (p.a Merck), asam klorida (HCl) (Brataco), natrium hidroksida (NaOH) (Brataco), amonium hidroksida (NH 4 OH) (Brataco), natrium klorida (NaCl) (Brataco) dan besi III klorida (FeCl 3 ) (p.a Merck). C. Waktu Dan Tempat Penelitian Penelitian akan dilaksanakan di Laboratorium Farmasi, Laboratorium MIPA Terpadu dan Sublab KimiaUniversitas Sebelas Maret Surakarta pada bulanmaret Mei 2016. 21
22 D. Rancangan Penelitian Penelitian dimulai dengan pengambilan sampel kecap menggunakan metode purposive sampling.dilakukan ekstraksi natrium benzoat menggunakan metode ekstraksi cair-cair, kemudian ekstrak yang diperoleh digunakan untuk analisis kualitatif dan analisis kuantitatif.analisis kualitatif dilakukan dengan penambahan reagen FeCl 3. Analisis kuantitatif dilakukan dengan metode kurva standard menggunakan Spektrofotometer UV-Vis. Validasi metode dilakukan dengan menentukan nilai LOD dan %recovery.pada analisis kuantitatif natrium benzoat dalam sampel dilakukan tiga kali replikasi. Hasil dari analisis kuantitatif dievaluasi dengan membandingan kadar natrium benzoat dalam sampel dengan batas maksimum penggunaan BTP pengawet yang telah ditetapkan dalam Peraturan Kepala BPOM Nomor 36 Tahun 2013.
23 Sampling Ekstraksi Purposive sampling Kecap produksi lokal Surakarta 3 merk kecap Ekstraksi cair-cair Pelarut dietil eter : air (1:2) Ekstraksi bertingkat Ekstrak dietil eter Uji Kualitatif Uji Kuantitatif Validasi Metode FeCl 3 Hasil positif Spektrofotometri UV-Vis Penentuan panjang gelombang maksimum Pembuatan kurva kalibrasi Pengukuran ekstrak Replikasi tiga kali % recovery LOD dan LOQ Hasil Dihitung berdasar kurva standar Evaluasi hasil pengukuran Gambar 4. Alur rencana penelitian E. Prosedur Penelitian 1. Pengambilan sampel Sampel kecap diambil dari Pasar Gede di kota Surakarta.Pengambilan sampel dilakukan pada bulan Januari 2016. Sampel yang diambil berjumlah 3 dengan merk yang berbeda merupakan kecap produksi lokal kota Surakarta.Selanjutnya sampel dianalisis di Laboratorium Farmasi,Laboratorium MIPA Terpadu, dan Sublab Kimia Universitas Sebelas Maret Surakarta. 2. Pembuatan larutan pereaksi a. Pembuatan NaCl Jenuh
24 Sebanyak 30 g NaCl ditimbang dan dilarutkan dengan 100 ml akuades di dalam beaker glass kemudian diaduk hingga NaCl tersebut tidak larut lagi. b. Pembuatan HCl 3 % (v/v) Sebanyak 4 ml HCl dipipet dan diencerkan dengan akuades dalam labu ukur 50 ml hingga tanda batas lalu dihomogenkan. c. Pembuatan NaOH 10 % (w/v) Sebanyak 10 g NaOH pellet ditimbang dan dilarutkan dengan 100 ml hingga homogen. d. Pembuatan FeCl 3 5 % (w/v) Sebanyak 5 g FeCl 3 ditimbang dan dilarutkan dengan 100 ml aquadest sampai homogen. 3. Ekstraksi Sebanyak 5 gram sampel kecap yang sudah dihomogenkan masingmasing ditimbang dalam cawan porselin, dimasukkan ke dalam beaker glass dan dicampur dengan larutan NaCl jenuh sampai volume 100 ml. Ke dalam larutan sampel ditambahkan sejumlah larutan NaOH 10 % sampai larutan bersifat alkalis (ph 8-9), dan diaduk dengan menggunakan batang pengaduk selama lima menit, selanjutnya disaring menggunakan kertas saring. Filtrat yang diperoleh ditambah dengan larutan HCl 3 % sampai larutan bersifat asam.larutan yang bersifat asam diekstraksi sebanyak 3 kali dengan dietil
25 eter masing-masing 15 ml.ekstrak dietil eter yang diperoleh digunakan untuk analisis kualitatif dan analisis kuantitatif. 4. Analisis kualitatif Ekstrak eter diuapkan dalam penangas air.larutan didinginkan dan ditambah beberapa tetes NH 4 OH pekat sampai larutan bersifat alkalis. Kelebihan amoniak dihilangkan dengan penguapan di atas penangas air, kemudian larutan ditambah dengan beberapa tetes larutan FeCl 3 5 %. Apabila terbentuk endapan berwarna kecoklatan menunjukkan adanya asam benzoat dalam sampel. 5. Analisis kuantitatif a. Penentuan panjang gelombang maksimum Larutan standar dengan konsentrasi 6 mg/l pada rentang panjang gelombang 400 200 nm dengan menggunakan instrumen spektrofotometer UV-Vis. Selanjutnya ditentukan panjang gelombang maksimum dengan melihat panjang gelombang yang menghasilkan absorbansi maksimun. b. Pembuatan kurva standar Pembuatan larutan standar didahului dengan pembuatan larutan induk 100 mg/l yang dibuat dengan melarutkan 10 mg asam benzoat ke dalam 100 ml dietil eter. Larutan standar dibuat dengan mengambil: 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 dan 0,6 ml larutan induk asam benzoat 100 mg/l ke dalam labu takar 10 ml kemudian masing-masing diencerkan dengan dietil eter sampai tanda batas. Konsentrasi larutan standar yang diperoleh berturut-turut ialah 1; 2; 3; 4; 5; 6 mg/l.masing-masing larutan standar asam benzoat diukur
26 absorbansinya pada panjang gelombang 225,6 nm lalu dibuat plotkonsentrasi dan absorbansi larutan standar. c. Penentuan kadar natrium benzoat pada kecap Ekstrak eter dibaca absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 225,6 nm, kemudian konsentrasi natrium benzoat dalam sampel ditentukan berdasarkan kurva standar. 6. Validasi metode analisis a. Penentuan perolehan kembali Sebanyak 10 mg asam benzoat dilarutkan dalam 100 ml akuades kemudian dipipet 2 mldimasukkan dalam labu ukur 50 ml dan diencerkan hingga tanda batas. Larutan ditambahkan NaOH 10% hingga bersifat alkalis kemudian disaring.filtrat yang diperoleh di tambah dengan larutan HCl 3 % sampai larutan bersifat asam.larutan yang bersifat asam diekstraksi sebanyak 3 kali dengan dietil eter masing-masing 15 ml. Selanjutnya membuat larutan asam benzoat baru dengan konsentrasi 4 mg/l dalam dietil eter. Kemudian ekstrak eter dan larutan asam benzoat 4 mg/l dibaca menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Hasil dari pembacaan absorbansi digunakan untuk menghitung nilai % recovery. b. Penentuan batas deteksi Slope dan simpangan deviasipersamaan garis regresi linier yangdiperoleh dari pembuatan kurva standar digunakan untuk menghitung batas deteksi.
27 LOD= 3 SD Slope 10 SD LOQ= Slope Dimana: LOD : Batas deteksi LOQ : Batas kuantitasi SD : Simpangan baku dari blanko Slope : Kemiringan kurva (nilai b hasil dari regresi linear)