4 Metode Penelitian ini dilakukan pada beberapa tahap yaitu, pembuatan media, pengujian aktivitas urikase secara kualitatif, pertumbuhan dan pemanenan bakteri, pengukuran aktivitas urikase, pengaruh ph, pengaruh suhu, pengaruh konsentrasi, dan pengukuran stabilitas. Diagram alir penelitian disajikan pada Lampiran 3. Pembuatan Media Heterotrof Media Heterotrof Padat. Bahan media heterotrof padat dimasukan ke dalam labu Erlenmeyer dan dipanaskan hingga homogen dan mencair. Kemudian labu Erlenmeyer ditutup dengan sumbat dan disterilisasi menggunakan autoklaf selama kurang lebih 15 menit dengan suhu 121 C dan tekanan 15 pst. Labu Erlenmeyer dikeluarkan dari autoklaf setelah itu dituang ke dalam cawan petri hingga media dingin dan memadat. Media digunakan untuk meremajakan sel. Media Heterotrof Cair. Kandungan media heterotrof cair sama dengan heterotrof padat dengan penambahan glukosa,125 g, tanpa pemberian agar. Selanjutnya, proses sterilisasi tidak berbeda dengan sterilisasi heterotrof padat. Uji Aktivitas Secara Kualitatif Bakteri ditanam pada media heterotrof padat yang ditambahkan asam urat,2% (asam urat tidak larut). Lalu campuran tersebut diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 24 jam, 48 jam, dan 72 jam. Setelah itu, dilihat hasil pertumbuhanya berupa zona bening (positif urikase), bakteri terpilih dilihat aktivitasnya melalui besarnya zona bening. Pertumbuhan dan Pemanenan Bakteri Bakteri ditumbuhkan pada sebuah media padat yang mengandung asam urat,1 mm. diinkubasi selama 2 hari pada suhu 37 C. Bakteri yang tumbuh selanjutnya ditanam pada 5 ml media cair yang berisi asam urat,1 mm dan diinkubasi pada 37 C selama 1 hari sampai OD 6 = 1. Sel bakteri dipanen dengan sentrifuse pada kecepatan 1. rpm (8 x g) selama 1 menit. Pelet dipisahkan dari supernatan, dicuci dua kali dengan bufer fosfat ph 7 dan diresuspensikan dengan NaCl 85%. Pengukuran Spektrofotometri (Bergmeyer et al. 1974) Sebanyak ml suspensi bakteri (OD=1) ditambahkan ke dalam 3,9 ml bufer borat ph 8 dan,1 ml asam urat 3,57 mm, kemudian diinkubasi selama 5 menit. Selanjutnya nilai serapan diukur pada panjang gelombang 293 nm dengan satuan aktivitas urikase yaitu Unit/mL. Aktivitas urikase = A 3,12 12,6 t keterangan 3,12 = volume total dalam pengukuran (ml) 12,6 = koefisien ekstingsi asam urat pada λ 293nm (Cm 2 µmol -1 ) = volume enzim yang digunakan (ml) t = waktu inkubasi (5 menit) Pengaruh ph, Suhu, Konsentrasi dan Stabilitas Pengukuran nilai ph bufer dilakukan pada ragam nilai ph bufer 6, 7, 8, 9, dan 1. Pengukuran nilai suhu dilakukan pada ragam nilai suhu 15, 25, 35, 45, dan 55 C. Pengukuran konsentrasi substrat dilakukan dengan mengamati penurunan konsentrasi asam urat pada ragam konsentrasi,11,16 mm dalam bufer borat ph optimum dan temperatur kamar (25 C). Pengukuran nilai stabilitas bakteri dilakukan dengan cara menyimpan bakteri pada suhu 4 C selama 1, 2, dan 7 hari. HASIL DAN PEMBAHASAN Uji Aktivitas Secara Kualitatif Sel B. subtilis, B. megaterium, dan B. cereus ditumbuhkan pada media heterotrof. Bakteri tersebut memiliki ciri berbentuk batang, merupakan bakteri gram positif karena mengikat warna ungu kebiruan dari kristal violet, dan bersifat katalase positif jika ditetesi H 2 O 2. Penentuan aktivitas urikase yang dihasilkan oleh bakteri dapat dilakukan secara kualitatif yang berguna untuk melihat aktivitas urikase terbesar dalam sel bakteri secara kasar dan cepat. Penentuan sel bakteri secara kualitatif dilakukan dengan mengamati zona bening pada media padat yang telah ditambahkan asam urat,2% seperti terlihat pada Gambar 4.
5 (c) Gambar 4 Zona bening B. subtilis, B. megaterium, dan (c). Zona bening menunjukkan bahwa asam urat telah didegradasi oleh enzim urikase ekstraseluler yang dihasilkan oleh bakteri (Azab et al. 25). Zona bening yang dihasilkan sel bakteri memperlihatkan ukuran yang berbeda-beda (Tabel 1). Zona bening belum muncul pada hari pertama karena bakteri sedang mengalami fase pertumbuhan. Pola produksi enzim seperti itu terjadi selama fase pertumbuhan sehingga sintesis eksoenzim terhambat. Zona bening muncul pada waktu 48 dan 72 jam karena represi katabolit selesai sehingga biosintesis eksoenzim meningkat (Priest 1988). Pada hari kedua, zona bening terbesar ditujukan oleh B. subtillis sebesar 2,5 cm, sebesar,5 cm sementara pada B. megaterium belum terlihat zona bening hal ini dikarenakan bakteri sedang dalam fase pertumbuhan. Dari hasil tersebut diharapkan B. subtilis memiliki aktivitas urikase lebih besar dari dua bakteri lainya. Tabel 1 Pengamatan zona bening pada berbagai isolat bakteri. Bakteri Hari 1 Hari 2 Hari 3 B. subtilis + +++ ++++ B. megaterium - + ++ + ++ ++++ keterangan: - = belum terlihat zona bening + = zona bening sudah agak telihat ++ = zona bening terlihat,5 cm +++ = zona bening terlihat 2,5 cm ++++ = zona bening terlihat > 2,5 cm Uji Aktivitas Secara Kuantitatif Penentuan aktivitas urikase murni dilakukan pada ph 8,5 suhu 25 C sebesar 1,2282 Unit/mL (Lampiran 4). Pengukuran aktivitas dilakukan berdasarkan penurunan konsentrasi asam urat pada panjang gelombang 293 nm, yang merupakan oksidasi asam urat membentuk alantoin. Alantoin yang terbentuk tidak menyerap pada panjang gelombang 293 nm sehingga penurunan serapan pada panjang gelombang 293 nm sebanding dengan keberadaan konsentrasi asam urat (Trivedi et al. 1978). Aktivitas urikase dari beberapa sel bakteri diperlihatkan pada Tabel 2. Aktivitas tertinggi ditunjukkan oleh B. subtilis sebesar,57 Unit/mL kultur, sementara aktivitas terkecil dimiliki oleh B. megeterium, yaitu sebesar,322 Unit/mL kultur. Perbedaan aktivitas pada bakteri disebabkan adanya perbedaan jenis bakteri. Tabel 2 Pengukuran aktivitas urikase. Keterangan Aktivitas (Unit/mL kultur) B. subtilis.57.437 B. megaterium.322 Pengaruh ph Terhadap Aktivitas Enzim Setiap enzim mempunyai ph optimum yang berbeda. Disekitar ph optimum enzim mempunyai kestabilan yang tinggi dan hanya aktif pada kisaran ph tertentu. Pada penelitian ini kisaran ph bufer diatur pada rentang 6 1. Pengukuran dilakukan pada konsentrasi asam urat tetap, yaitu 3,57 mm. Respon maksimum diperoleh urikase murni pada ph 8 (Gambar 5 a) sebesar 1,2455 Unit/mL. Hal ini terjadi karena gugus penerima proton pada tapak aktif enzim berada dalam tingkat ionisasi yang diinginkan. Penelitian ini sesuai dengan penelitian Arslan (28) dengan menggunakan metode amperometri, yakni optimum pada ph 8. Aktivitas (U/mL) 2, 1,5 1,,5,1,8 5 6 7 8 9 1 ph B. subtilis B. megaterium 5 6 7 8 9 1 ph Gambar 5 Hubungan aktivitas urikase enzim murni dan tiga jenis Bacillus pada ph bufer borat.
6 Aktivitas urikase diperlihatkan B. subtilis, B. megaterium, dan secara berturutturut sebesar,116;,72; dan,858 Unit/mL kultur, dengan respon maksimum terjadi pada ph 8 (Gambar 5 b). Bomalaski et al. (22) mengemukakan bahwa respon maksimum pada berbagai jenis bakteri (C. utilis, Arthrobacter protoformiae, Aspergilus flavus) terjadi pada ph 8,5 dan 9 perbedaan ini terjadi karena adanya perbedaan jenis bakteri dan media pertubuhan. Pengaruh ph pada aktivitas enzim disebabkan oleh perubahan tingkat ionisasi pada enzim dan substrat sebagai akibat perubahan nilai ph. Penurunan aktivitas pada ph 6 dikarenakan adanya kelebihan ion H + yang dapat berikatan dengan sisi aktif enzim atau sisi lain enzim yang bermuatan positif akibatnya terjadi tolakan muatan sejenis, sehingga struktur enzim terbuka. Terbukanya struktur enzim menyebabkan terjadinya perubahan konformasi pada sisi aktif enzim. Bila sisi aktif enzim berubah maka reaksi tidak akan terjadi. Adanya ion OH - yang berlebihan (ph 1) dapat bereaksi dengan gugus karboksil pada sisi aktif sehingga muatan enzim berubah dan mengakibatkan penurunan aktivitas urikase (Kristiana 26). Pengaruh Suhu Terhadap Aktivitas Enzim Suhu merupakan parameter yang memberikan efek pada aktivitas enzim dan biasa digunakan untuk mengetahui ketergantungan respon enzim. Pengaruh suhu diamati dengan ragam suhu 15 65 C pada ph 8 menggunakan konsentrasi asam urat sebesar 3,57 mm. Enzim murni mencapai suhu optimum pada 55 C dengan aktivitas sebesar 1,497 Unit/mL, diatas suhu tersebut aktivitas mengalami penurunan. Hasil ini sesuai dengan penelitian Zang et al. (25). Proses penggunaan enzim pada suhu tinggi dapat meningkatkan laju reaksi dan mengurangi kemungkinan kontaminasi. Suhu juga mempengaruhi aktivitas urikase yang dihasilkan sel bakteri yang tumbuh pada keadaan mesofilik dengan variasi suhu 1 5 C (Gambar 6b). Suhu 35 C memperlihatkan suhu optimum pada B. subtilis dan berturut-turut,125 dan,867 Unit/mL kultur. Hal ini dikarenakan kedua bakteri tersebut merupakan bakteri mesofilik dengan rentang suhu pertumbuhan antara 25 35 C (B. subtilis) dan 3 4 C (). Selain itu, suhu optimum yang didapat merupakan kondisi fisiologis. Pada suhu tersebut bakteri hidup dengan baik dan urikase juga memberikan aktivitas yang cukup tinggi. Sementara aktivitas optimum B. megaterium terjadi pada suhu 45 C sebesar,19 Unit/mL kultur. Hal ini dikarenakan B. megaterium memiliki rentang suhu optimum 3 45 C. 2, 1,5 1,,5,14,12,1,8 15 3 45 6 75 Suhu ( C) 15 3 45 6 Suhu ( C) Gambar 6 Hubungan aktivitas urikase enzim murni dan tiga jenis Bacillus pada suhu. Kenaikan suhu dapat meningkatkan kecepatan reaksi pada kisaran tertentu (Murray et al. 23). Mula-mula kecepatan reaksi meningkat sejalan dengan kenaikan suhu dan peningkatan kecepatan reaksi ini disebabkan oleh peningkatan energi kinetik yang bereaksi. Penggunaan suhu yang terlalu tinggi dapat menurunkan fungsi kerja enzim akibat membukanya lipatan molekul protein yang menyebabkan kerusakan sisi katalitik enzim sehingga enzim terdenaturasi. Selain itu, suhu tinggi juga dapat mempengaruhi konformasi substrat sehingga substrat mengalami hambatan dalam memasuki tapak aktif enzim (Suhartono 1992). Pengaruh Konsentrasi Enzim B.Subtilis B.Megaterium Penggunaan enzim berlebih menyebab-kan tidak semua enzim berikatan dengan substrat sehingga kecepatan maksimum tidak tercapai dan reaksi menjadi tidak efisien (Pelezar dan Chan 1986). Gambar 7 menunjukkan perubahan konsentrasi enzim berkorelasi terhadap aktivitas urikase. Aktivitas urikase meningkat dengan bertambahnya konsentrasi enzim. Laju reaksi optimum enzim murni memperlihatkan kenaikan aktivitas sampai
7 konsentrasi enzim,5 Unit sebesar 2,11 Unit/mL, sementara laju reaksi optimum pada B. subtilis, B. megaterium, dan terjadi pada suspensi bakteri 1 ml OD 6 /5 ml biakan secara berturut-turut sebesar,891;,768; dan,792 Unit/ ml kultur. Aktivitas (U/mL kultur) 2, 1,5 1,,5,1,8 y = 2,944x +,54 R² =,93,2,4,6,8 1 [urikase] Unit y = 4x + 8 R² =,958,5 1, 1,5 Suspensi bakteri (ml OD 6 /5 ml biakan) Gambar 7 Hubungan aktivitas urikase enzim murni dan B. subtilis pada konsentrasi enzim. Pengaruh Konsentrasi Substrat Asam Urat Peningkatan konsentrasi substrat memengaruhi kecepatan enzim dalam mengkatalisis reaksi. Pada konsentrasi substrat yang rendah, kecepatan reaksi pun akan menurun. Sebaliknya peningkatan konsentrasi substrat akan meningkatkan kecepatan reaksi. Namun kecepatan reaksi akan mencapai keadaan konstan ketika enzim telah habis bereaksi dengan substrat. Peningkatan konsentrasi substrat lebih lanjut akan menyebabkan tidak terjadi lagi penambahan kecepatan reaksi (Gambar 8), karena katalitik enzim sudah terikat seluruhnya dengan substrat membentuk kompleks enzim substrat (Lehninger et al. 24). 2, 1,5 1,,5 1,8431,5,1,15,2 [S] mm Gambar 8 Hubungan aktivitas urikase enzim murni pada konsentrasi substrat. Konsentrasi substrat asam urat pada pengukuran enzim murni diragamkan antara,11,16 mm. Gambar 8 memperlihatkan substrat mencapai keadaan stabil pada konsentrasi,114 mm dengan nilai aktivitas sebesar 1,8183 Unit/mL. Linearitas asam urat berkisar antara,11,114 mm. Hasil penelitian memperlihatkan bahwa metode ini dapat digunakan untuk mengukur asam urat sampai konsentrasi,114 mm. Korelasi aktivitas urikase terhadap konsentrasi substrat asam urat diperlihatkan pada Gambar 8. Bentuk kurva tersebut menunjukkan aktivitas urikase menurut persamaan Michaelis- Menten. Akan tetapi, nilai K m dan V max sulit ditentukan dengan tepat dari kurva Michaelis- Menten. Oleh karena itu, diperlukan cara lain untuk memperoleh nilai K m dan V max yang lebih tepat. Nilai K m dan V maks urikase ditentukan dengan metode Lineweaver-Burk (Gambar 9). Melalui ekstrapolasi persamaan regresi linear, diperoleh nilai K m urikase sebesar.215 mm dan V maks sebesar 2,838 Unit/mL. Hal ini berarti untuk mencapai setengah dari kecepatan maksimum dibutuhkan substrat dengan konsentrasi 8 mm sehingga konsentrasi asam urat sebesar 16 mm sudah cukup dijadikan dasar untuk optimasi selanjutnya. Semakin rendah nilai K m semakin kuat ikatan antara enzim dan substrat. Nilai K m menunjukkan konsentrasi substrat pada saat kecepatan reaksi mencapai setengah dari V maks yang ditandai dengan terbentuknya kompleks enzim-substrat yang stabil. Pada saat V maks seluruh enzim akan terikat dengan substrat dan enzim tersebut sudah jenuh terhadap substrat (Lehninger et al. 24). Parameter lain dalam penentuan kinetika adalah k kat. Terbentuknya k kat dari kompleks enzimsubstrat menjadi produk lebih menggambarkan efisiensi katalitik jumlah maksimum molekul substrat yang dikonversi menjadi alantoin. Nilai k kat pada enzim murni sebesar 959,3773 menit -1. 1/v,8,6,4,2 y =,13x +,4799 R² =,9519 1 2 3 4 1/[S] Gambar 9 Kurva Lineweaver-Burk enzim murni.
8 Konsentrasi substrat pada pengukuran menggunakan sel bakteri diragamkan antara 11 91 mm dan memperlihatkan hasil linear pada konsentrasi 11 56 mm. Deteksi asam urat dapat dilakukan sampai konsentrasi 56 mm dengan aktivitas yang ditunjukkan B.subtilis, B. megaterium dan B. cereus, secara berturut-turut sebesar 44; 95; dan 48 Unit/mL kultur. Aktivitas urikase (U/mL) Gambar 1 Hubungan aktivitas urikase B. subtilis pada konsentrasi substrat. Tabel 3 menunjukkan parameter kinetika untuk sel B. subtilis, B megaterium dan B. cereus. Nilai K m pada sel B. subtilis paling kecil dari pada bakteri lainnya sebesar 29 mm sehingga ikatan enzim substrat lebih kuat. Nilai V maks terbesar diperoleh B. subtilis adalah,853 mm/menit sehingga kecepatan reaksinya lebih besar dari bakteri lainya (Gambar 11). Efisiensi katalitik terbesar ditunjukkan oleh B. subtilis, yaitu sebesar 266,419 mm/menit ml OD 6. k kat lebih memperlihatkan efisiensi katalitik dalam mengkatalisis reaksi enzimatis asam urat menjadi alantoin. 1/vo 5 4 3 2 1,8 5,1 [S] (mm) y =.34x + 11.73 R² =.935 5 1 1/[S] Gambar 11 Kurva Lineweaver-Burk B. Subtilis. kurang dari 1 tahun (Zang et al. 27). Pada penelitian ini dilakukan penyimpanan urikase murni pada suhu 4 C dalam bufer ph 8,5. Data pengukuran kestabilan dapat dilihat pada Gambar 12. Stabilitas hari kedua mencapai 94,28% dan hari ketujuh mencapai 74,8%. Adanya penurunan kestabilan yang cukup besar terjadi akibat enzim telah rusak. Bakteri tidak aktif pada suhu 4 C, sehingga bakteri diharapkan memberikan kestabilan yang baik pada penyimpanan 4 C. Aktivitas urikase masih stabil pada hari kedua yakni sebesar 97,78% untuk sel B. subtilis dan 85,37% untuk sel, sementara penurunan besar terjadi pada B. megaterium, yakni sebesar 52,8 %. Hari ketujuh, kestabilan urikase yang dihasilkan sel B. megaterium menurun hingga 35,42%, sementara pada sel B. subtilis dan urikase masih stabil sekitar 54 67%. Penurunan aktivitas enzim selama tujuh hari penyimpanan dikarenakan bakteri telah mengalami kematian akibat rusaknya ikatan protein. Stabilitas (%) Stabilitas (%) 15 1 5 15 1 5 Gambar 12 2 4 6 8 Hari B. subtilis B. megaterium 2 4 6 8 Hari Kestabilan aktivitas urikase enzim murni dan tiga jenis Bacillus pada waktu. Tabel 3 Data nilai V maks, K m dan k kat Keterangan V maks K m k kat mm/menit mm mm/ menit ml OD=1 B. subtilis,853 29 266,419 12 36 171,6667 B. megaterium,824 36 257,5 Stabilitas Urikase pada Penyimpanan 4 C Enzim yang telah dilarutkan dalam bufer ph 8,5 disimpan pada -2 C akan bertahan SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Sel B. subtilis, B. megaterium dan B. cereus memiliki ph dan suhu optimum pada ph 8 dan 35-45 C. Metode spektrofotometri, dapat digunakan dalam mengukur asam urat secara in vivo sampai konsentrasi,1144 mm untuk enzim murni dan 56 mm untuk ketiga sel bakteri. Nilai V maks, K m dan k kat untuk enzim murni sebesar 2,838 U/mL enzim; 15 mm; dan 959,3773 menit -1.