Laporan Penentuan Kadar Asam Amino Dalam Sampel I. Judul Percobaan : Penentuan Kadar Asam Amino Dalam Sampel II. Mulai Percobaan : Senin/14 Oktober 2012 Selesai Percobaan : Senin/14 Oktober 2012 III. Tujuan Percobaan : Menentukan asam amino yang terdapat dalam sampel dengan kromatografi kertas IV. Tinjauan Pustaka : Asam Amino Asam amino adalah senyawa organik yang memiliki gugus fungsional karboksil (- COOH) dan amina (biasanya NH2). Dalam biokimia, seringkali pengertiannya dipersempit : keduanya terikat pada atom karbon (C) yang sama dan disebut atom C alfa. Gugus karboksil memberikan sifat asam dan gugus amina memberikan sifat basa. Struktur umum dari asam amino : Dimana R adalah gugus fungsi yang menentukan jenis dari asam amino. Semua asam amino yang ditemukan pada protein memiliki ciri yang sama, yaitu adanya gugus karboksil dan amina yang diikat pada atom karbon yang sama. Struktur asam amino secara umum adalah satu atom C yang mengikat empat gugus: gugus amina (NH2), gugus karboksil (COOH), atom hidrogen (H), dan satu gugus sisa (R, dari residue) atau disebut juga gugus atau rantai samping yang membedakan satu asam amino dengan asam amino lainnya. Atom C pusat tersebut dinamai atom Cα ("C-alfa") sesuai dengan penamaan senyawa bergugus karboksil, yaitu atom C yang berikatan langsung dengan gugus karboksil.oleh karena gugus amina juga terikat pada atom Cα ini, senyawa tersebut merupakan asam α-amino.
Asam amino biasanya diklasifikasikan berdasarkan sifat kimia rantai samping tersebut menjadi empat kelompok.rantai samping dapat membuat asam amino bersifat asam lemah, basa lemah, hidrofilik jika polar, dan hidrofobik jika nonpolar. Jenis- jenis asam amino diantaranya : Asam amino alifatik sederhana Glisina (Gly, G) Alanina (Ala, A) Valina (Val, V) Leusina (Leu, L) Isoleusina (Ile, I) Asam amino hidroksi-alifatik Serina (Ser,S) Treonina (Thr, T) Asam amino dikarboksilat (asam) Asam aspartat (Asp,D) Asam Glutamat (Glu, E) Amida Asparagina (Asn, N) Glutamina (Gln,Q) Asam Amino basa Lisina (Lys, K) Arginina (Arg, R) Histidina (His, H), memiliki gugus siklik Asam Amino dengan sulfur Sisteina (Cys, C) Metionina (Met, M) Prolin Prolina (Pro, P), memiliki gugus siklik Asam amino aromatic Fenilanilina (Phe, F) Tirosina (Tyr, Y) Triptofan (Trp,W) Fungsi asam amino antara lain penyusun protein, termasuk enzim, kerangka dasar sejumlah senyawa penting dalam metabolism. Kromatografi Kertas Dalam Analisis Campuran Asam Amino Untuk mengetahui jenis-jenis dari asam amino yang terkandung dari suatu bahan/sampel, biasanya digunakan metode kromatografi kertas.kromatogrfi kertas diterapkan untuk analisis campuran asam amino karena asam amino memiliki sifat yang larut dalam air dan tidak mudah menguap sehingga dapat dipisahkan melaui perpindahan fasa gerak (eluen) pada fasa diam (adsorben).asam amino akan terbawa oleh fasa gerak dan akan mengendap atau menempel pada fasa diam (adsorben) setelah menempuh jarak tertentu.
Adsorben dalam kromatografi kertas adalah kertas saring, yakni selulosa. Sampel yang akan dianalisis ditotolkan ke ujung kertas yang kemudian digantung dalam wadah. Kemudian dasar kertas saring dicelupkan ke dalam pelarut yang mengisi dasar wadah.setiap asam amino bergerak dari titik awal sepanjang jarak tertentu.setiap jenis asam amino akan selalu menempuh jarak yang khas dari masing-masing asam amino asalkan jenis kertas, eluen, dan pelarutnya sama. Dari dasar inilah, dapat dibandingkan jarak tempuh eluen dari masing-masing asam amino yang telah diketahui dengan jarak tempuh eluen yang timbul pada sampel. Jarak tempuh relative pada pelarut disebut sebagai Rf, untuk tiap senyawa berlaku rumus : Rf = jarak yang ditempuh oleh senyawa/jarak yang ditempuh oleh pelarut Larutan Ninhidrin kemudian disemprotkan pada kertas saring setelah pelarut mencapai batas atas dan menghasilkan senyawa berwarna, utamanya coklat dan ungu.asam-asam amino berinteraksi dengan ninhidrin membentuk produk yang disebut ungu ruhmann.reaksi ini biasanya digunakan sebagai uji bercak untuk mendeteksi adanya asam amino pada kertas kromatografi. Adapun reaksi umum secara keseluruhan adalah : Ninhidrin + H3N+-CHR-COO- anion ungu + RCHO + CO2 + 3H2O + H + V. Alat dan Bahan : Alat: - Kertas kromatografi - Pipa kapiler - Gelas dasar datar - Benang - Botol semprot - Oven - Kaca Penutup Bahan: - Asam asetat glacial - n-butanol - aquades - larutan asam amino standar
- HCl pekat - Larutan sampel VI. Cara Kerja/Alur Kerja 1. Pembuatan larutan pengemulsi (fasa gerak) 2. Menentukan komponen asam amino
Hasil VIII. Analisis Data 1. Pembuatan larutan pengemulsi (fasa gerak) Prinsip kromatografi adalah adanya perbedaan distribusi antara fasa gerak dan diam. Eluen ini digunakan sebagai fasa geraknya.maka pada langkah awal bertujuan untuk pembuatan larutan pengemulsi atau eluen yang digunakan sebagai fase gerak.mula-mula 25 ml n-butanol ditambahkan 6 ml asam asetat glasial dan 25 ml aquades.ketiga larutan jernih, tak berwarna.ketiga larutan yang bercampur ini dinamakan eluen yang akan berfungsi sebagai fasa gerak dalam kromatografi lapis tipis, eluen ini bercampur dan menjadi dua lapisan, yaitu lapisan atas dan bawah. Kemudian menuangkan larutan tersebut pada lemari kromatografi (chamber) yang berupa gelas dan diselubungi kertas saring di dalamnya hingga tertutup seluruh dinding gelas pada bagian dalam. Kemudian menutup chamber yang telah berisi larutan tersebut dengan kaca sehingga suasana dalam chamber tersebut menjadi jenuh akan uap dari larutan tersebut. Tanda bahwa suasana dalam chamber telah jenuh adalah kertas saring yang berada dalam chamber telah menjadi basah secara keseluruhan.tujuan penjenuhan chamber ini adalah untuk menjadikan eluen memenuhi chamber dan fungsinya sebagai fasa gerak dalam kromatografi berjalan dengan baik. Jika eluen tidak memenuhi chamber, maka distribusi daripada fasa diam tidak akan dapat berjalan sehingga kromatografi gagal dan hasil yang diperoleh tidak teliti. Padahal dalam kromatografi bertujuan untuk menentukan senyawa apa yang terdapat dalam sampel dengan ditandai adanya bercak/noda yang menunjukkan suatu senyawa. Tiap senyawa memiliki distribusi yang berbeda-beda dalam suatu fasa gerak. Pemilihan eluen sangat penting karena jika eluen yang digunakan memiliki konsentrasi yang tidak sesuai dengan sampel yang akan dipisahkan, maka kromatografi dapat tidak berjalan. Jika eluen terlalu polar akan menyebabkan seluruh noda yang ditotolkan pada kertas naik sampai batas atas tanpa mengalami pemisahan, jika eluen kurang polar, maka noda yang ditotolkan tidak akan bergerak sama sekali.
2. Menentukan komponen asam amino Percobaan ini bertujuan untuk mengidentifikasi asam-asam amino yang terdapat dalam sampel.untuk tujuan identifikasi tersebut, maka kami menggunakan beberapa standar larutan yang mengandung asam amino yaitu Lysin (larutan jernih, ada endapan putih), Sistein (larutan jernih, ada endapan putih keruh), dan Tyrosin (larutan jernih, ada endapan putih keruh).lysin berlabel botol A, Sistein berlabel botol B, dan Tyrosin berlabel botol C.Mula-mula adalah persiapan, kertas kromatografi dalam hal ini menggunakan kertas saring Whatman berukuran 7 x 12,5 cm diberi batas atas 0,5 cm dan batas bawah 1 cm. Kemudian memberi tanda titik A, B, C dan D dengan pensil sebagai titik menotolkan larutan. Masing-masing titik ditotoli larutan yaitu : Titik A : Larutan Lysin Titik B : Larutan Sistein Titik C : Larutan Tyrosin Titik D : Larutan Sampel Masing-masing titik berjarak 1 cm dan penotolan menggunakan pipa kapiler dan dilakukan penotolan sebanyak 5x. Diameter noda pada totolan tidak melebihi diameter 0,4 cm. Setiap penotolan, noda totolan dikeringkan terlebih dahulu sebelum ditotolkan lagi. Tujuan dilakukannya penotolan secara berulang kali supaya noda totolan tampak lebih jelas.setiap totolan pada titik A, B, C, dan D menghasilkan noda-noda tak berwarna pada kertas kromatografi. Totolan pada titik A, B, C, dan D ini adalah fasa diam yang akan dielusi oleh eluen yang telah dibuat pada percobaan pertama dalam chamber. Persiapan kertas kromatografi telah selesai, kemudian langkah berikutnya adalah memasukkan kertas kromatografi yang telah dilipat bagian ujungnya dan diberi tali ke dalam gelas dengan hati-hati ke dalam chamber / lemari kromatografi dan bagian tepi pelat tidak menyentuh dinding chamber hingga bagian bawah kertas kromatografi tercelup eluen tetapi tidak sampai menyentuh batas bawah. Kemudian menutup kembali chamber tersebut dengan kaca supaya terjadi elusi oleh eluen (fasa gerak). Berikutnya adalah mengamati proses kromatografi, yaitu terjadinya perambatan eluen pada kertas saring hingga mencapai batas atas. Setelah eluen mencapai batas atas kertas saring, maka kertas saring dikeluarkan.jarak tempuh eluen pada
kertas saring adalah 6 cm (jarak dari batas bawah sampai batas atas). Hasil dari proses kromatografi ini adalah kertas saring yang telah basah oleh perambatan eluen. Warna kertas saring tetap putih dan belum timbul noda/bercak.berikutnya, larutan disemprot dengan ninhidrin yaitu larutan untuk mengidentifikasi adanya asam amino dengan menunjukkan perubahan warna menjadi ungu.kemudian kertas saring dikeringkan dalam oven untuk memperoleh noda-noda bercak asam amino dengan ditandai adanya noda berwarna yang timbul secara jelas pada suatu jarak yang ditempuh oleh eluen. Setelah dikeringkan dalam oven, distribusi larutan berjalan lurus dan baik. Pada titik A (totolan larutan Lisin), muncul noda berwarna ungu dengan jarak noda 0,3 cm dari batas bawah. Pada titik B (totolan larutan sistein), muncul noda berwarna ungu dengan jarak noda 1,3 cm dari batas bawah dan pada titik C (totolan larutan tyrosin), muncul noda berwarna ungu dengan jarak noda 1 cm dari batas bawah. Untuk titik D yang merupakan totolan sampel (sampel D) yang dianalisis kandungan asam aminonya muncul dua noda berwarna ungu dengan jarak noda 0,2 cm dan 1,1 cm dari batas bawah, hal ini menunjukkan sampel D terdiri dari campuran dua asam amino yang berbeda. Dari perhitungan nilai R f (pada lampiran) diperoleh nilai yaitu pada titik A (larutan lysin), R f = 0,05 ; pada titik B (larutan Sistein), R f = 0,22 ; pada titik C (larutan Tyrosin), R f = 0, 17, dan pada titik D, (larutan sampel D)R f A = 0, 03, R f B = 0,18. R f A pada sampel D memiliki nilai yang mendekati Rf larutan lysine, dan R f A pada sampel D memiliki nilai yang mendekati Rf larutan Tyrosin Dari nilai R f tersebut maka dapat dianalisis sampel D mengandung asam amino lysin dan Sistein karena memiliki nilai yang hampir serupa dengan nilai R f dari larutan Lysin dan larutan sistein. IX. Diskusi : Pada percobaan kedua, bercak noda setelah disemprotkan ninhidrin dan dalam oven tidak tampak begitu jelas dan cenderung tailing (berekor). Hal ini menyulitkan dalam penentuan nilai R f baik pada titik A, B, C ataupun D sehingga penentuan kandungan asam amino dalam sampel menjadi lebih sulit. Padahal bercak noda yang tampak jelas akan menunjukkan R f yang akurat dan sebenarnya dan menunjukkan kandungan suatu senyawa (tiap senyawa memiliki nila R f yang berbeda). Hal ini mungkin karena kertas saring mungkin masih basah atau mengandung air sehingga mengganggu proses distribusi fasa gerak terhadap fasa diam. Hal ini dikarenakan kehadiran air yang merupakan senyawa polar dapat menarik sampel sehingga tidak dapat
dipisahkan dengan sempurna. Selain itu, juga dicurigai eluen yang digunakan kurang polar sehingga tidak memisahkan asam amino dengan sempurna.untuk mencegah hal tersebut mungkin sebaiknya kertas saring yang digunakan dalam kromatografi dikeringkan terlebih dahulu dalam oven untuk menghilangkan kandungan airnya. X. Kesimpulan Asam-asam amino yang terkandung dalam sampel (sampel D) adalah Lysin dan Tyrosin, hal ini dikarenakan pada sampel terdapat dua bercak noda dan memiliki nilai R f ( R f A = 0, 03, R f B = 0,18) yang hampir sama dengan larutan standar yang mengandung Lysin ( R f = 0,05 ) ; dan Tyrosin (R f = 0, 17). XI. Jawaban Pertanyaan : 1) Keuntungan dan kerugian dari metode pemisahan dengan Kromatografi Kertas : Keuntungan : a) Pada kromatografi Kertas peralatan yang dipakai tidak perlu alat-alat yang teliti. Hasil-hasil yang baik dapat diperoleh dengan peralatan dan materi-materi yang sangat sederhana. b) Senyawa-senyawa yang terpisahkan dapat dideteksi pada kertas dan dapat segera diidentifikasikan c) Harganya lebih murah jika dibandingkan dengan KLT d) kromatografi kertas preparatif diperlukan kertas yang lebih besar dari pada untuk analisis, Keuntungannya yaitu beban langan bilangan Rf menjadi besar sehingga pengukuran Rf merupakan parameter yang berharga dalam memaparkan senyawa baru. Kerugian : a) Tidak bisa melakukan analisis kuantitatif pada komponen-komponen sampel, hanya terbatas pada analisis kualitatif saja. b) Waktunya lebih lama dari pada adsorben lain, tapi lebih singkat dari pada KLT c) Tidak bisa menggunakan pereaksi H 2 SO 4 karena selulosa akan terdekomposisi 2) Metode kromatografi kertas dapat digunakan baik untuk melakukan analisis yang bersifat kuantitatif maupun kualitatif. Analisis Kuantitatif dilakukan berdasarkan perbandingan Rf dari zat sampel dengan harga Rf zat standar. Agar analisis kuantitatif dapat berhasil baik perlu diperhatikan hal hal berikut : a) Kondisi percobaan harus sama, karena harga Rf tergantung pada kondisi tersebut b) Adanya noda pada kromatogram belum berarti adanya zat tunggal dalam sampel c) Harus dicoba dengan berbagai pelarut
Analisis Kualitatif dilakukan dengan mengidentifikasi komponen asam amino dari sampel terhadap suatu larutan asam amino yang telah diketahui sebelumnya berdasarkan nilai Rf, Pada percobaan ini ditandai dengan adanya warna ungu serta dari harga Rf sampel yang diselidiki lalu dibandingkan dengan harga Rf standarnya. 3) Faktor-faktor yang menentukan harga Rf yaitu : a) Pelarut disebabkan oleh pentingnya koefisien partisi, maka perubahan-perubahan yang sangat kecil dalam komposisi pelarut dapat menyebabkan perubahan- perubahan harga Rf. b) Kehadiran ion lain, misalnya adanya klorida dalam pemisahan yang dilakukan dengan larutanlarutan nitrat c) Sifat dari campuran berbagai senyawa mengalami partisi diantara volume-volume yang sama dari fasa tetap dan bergerak. Sifat campuran hampir selalu mempengaruhi karakteristik dari kelarutan satu terhadap lainnya hingga berpengaruh juga terhadap harga Rf d) Kertas pengaruh utama kertas pada harga Rf timbul dari perubahan ion dan serapan, yang berbeda untuk macam-macam kertas. Kertas mempengaruhi kecepatan aliran dan mempengaruhi kesetimbangan partisi. e) Suhu perubahan dalam suhu merubah koefisien partisi dan juga kecepatan aliran. f) Ukuran dari bejana volume dari bejana mempengaruhi homogenitas dari atmosfer sehingga mempengaruhi kecepatan penguapan dari komponen-komponen pelarut dari kertas. Jika bejana besar digunakan, ada tendensi perambatan lebih lama, seperti perubahan komposisi pelarut sepanjang kertas, maka koefisien partisi akan berubah juga. Dua faktor yaitu penguapan dan kompisisi mempengaruhi harga Rf. g) Kualitas adsorben h) Ketebalan lapisan, semakin tebal lapisan Rf nya semakin kecil i) Kejenuhan ruang kromatografi
Lampiran Perhitungan Perhitungan Rf : R f = Jarak tempuh noda / Jarak tempuh pelarut Diketahui : - jarak tempuh pelarut = 6 cm - jarak tempuh noda pada titik A = 0,3 cm - jarak tempuh noda pada titik B = 1,3 cm - jarak tempuh noda pada titik C = 1 cm - jarak tempuh noda pada titik D = 0,2 cm dan 1,1 cm Pada titik A (larutan Lysin): R f = 0,3 cm / 6 cm = 0,05 Pada titik B (larutan Sistein): R f = 1,3 cm / 6 cm = 0,22 Pada titik C (larutan Tyrosin): R f = 1 cm / 6 cm = 0, 17 Pada titik D (larutan sampel D) R f A = 0,2 cm / 6 cm = 0, 03 R f B = 1,1 cm / 6 cm = 0,18 LAMPIRAN FOTO
Sampel yang tersedia padapercobaan ini untuk diidentifikasi asam amino yang terkandung di dalamnya. Asam amino standar yang digunakandalam percobaan ini. Lysin, Cystein, Tyrosin
Hasil kromatografi dari asamamino. A adalah Lysin, B adalah Cystein, C adalah Tyrosin,dan D adalahsampel D yang diidentifikasi DAFTAR PUSTAKA Lehninger, Albert L. 1993. Dasar-dasar Biokimia Jilid 1. Terjemahan.Jakarta : Erlangga Tim. 2012. Petunjuk Praktikum Biokimia. Surabaya : Universitas Negeri Surabaya-FMIPA- Jurusan Kimia
Anonim.2012. Asam Amino, (Online).(http://id.wikipedia.org/wiki/asamamino, diakses pada Minggu, 14-10-2012). Takeuchi, Yoshito. 2009. Kromatografi, (Online). (http://www.chem-is-try.org/materikimia/kimia_dasar/pemurnian_material/kromatografi, diakses pada Minggu, 14-10-2012). Mimir. 2011. Cara Menganalisis Kromatografi kertas. (Online). http://robbaniryo.com/ilmukimia/cara-menganalisis-kromatografi-kertas/, diakses pada tanggal 19 Oktober 2012.