LAMPIRAN
Lampiran 1. Prosedur analisis 1. Kadar air (AOAC 1995) Sebanyak 5 g sampel ditimbang dalam cawan aluminium yang telah dikeringkan dan diketahui bobotnya. Cawan kemudian dikeringkan dalam oven pada suhu 105 110ºC selama tiga jam. Cawan dikeluarkan dan didinginkan dalam desikator, kemudian ditimbang. Pengeringan dilanjutkan lagi dan setiap setengah jam didinginkan dan ditimbang sampai diperoleh bobot yang konstan. Kadar air dihitung dengan persamaan berikut: 2. Kadar abu (AOAC 1995) Sebanyak 2 g sampel ditimbang dalam cawan porselen yang telah dikeringkan dan diketahui bobotnya. Cawan kemudian dipijarkan dan diabukan dalam tanur perabuan pada suhu 600ºC selama empat jam. Cawan dikeluarkan dan didinginkan dalam desikator, kemudian ditimbang. Pengabuan dilanjutkan sampai diperoleh bobot yang konstan. Kadar air dihitung dengan persamaan di bawah ini. 3. Kadar protein (AOAC 1995) Penentuan kadar protein ditentukan secara semi mikrokjedahl. Sampel bekas analisis kadar air sebanyak 1 g dan 2 g serbuk katalis (CuSO 4 :Na 2 SO 4 = 1.2 : 1) dimasukkan ke dalam labu Kjedahl, kemudian ditambahkan 2.5 ml larutan asam sulfat pekat. Sampel di dalam labu Kjedahl didestruksi dalam ruang asam sampai warna hijau jernih. Setelah dingin, hasil destruksi didestilasi dengan menggunakan alat Kjeltec. Nitrogen anorganik hasi destruksi dimasukkan ke dalam tabung suling dengan pembilas aquades, dan diletakkan ke dalam alat Kjeltec. Alat Kjeltec dihidupkan, maka secara otomatis tabung suling yang berisi sampel nitrogen anorganik akan terisi dengan larutan NaOH 6 N sampai warna cairan cokelat kehitaman. Destilat ditampung dalam labu erlenmeyer 300 ml yang berisi 25 ml larutan asama borat (H 3 BO 3 ) 2% serta diberi indikator mengsel sebanyak 3 tetes. Destilasi dilakukan selama kurang lebih empat menit atau sampai volume destilat dua kali volume semula. Selanjutnya ditritasi dengan larutan H 2 SO 4 0.02 N sampai diperoleh warna yang berubah dari hijau menjadi ungu. Hal tersebut juga dilakukan pada titrasi blanko. Kadar protein dihitung dengan persamaan berikut: Keterangan: A = jumlah titrasi sampel (ml) B = jumlah titrasi blanko (ml) C = bobot sampel (g) 36
Standarisasi normalitas H 2 SO 4 Natrium karbonat (Na 2 CO 3 ) hablur ditimbang sebanyak 0.05 g, kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml, dilarutkan dengan aquades, dan ditambahkan hingga tanda tera. Larutan kemudian dipipet sebanyak 10 ml ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan indikator merah metil 2 3 tetes, dititrasi dengan larutan H 2 SO 4 hingga terjadi perubahan warna dari kuning menjadi jingga. Standarisasi normalitas H 2 SO 4 dihitung dengan persamaan berikut: 4. Kadar lemak (AOAC 1995) Sampel bekas analisis kadar air ditimbang 2 sampai 3 g, kemudian dibungkus dengan kertas saring yang telah dikeringkan dan diketahui bobotnya. Ekstraksi dilakukan dengan menggunakan soxhlet yang dihubungan dengan pendingin balik, labu lemak yang berisi beberapa butir batu didih dan hot plate. Pelarut yang digunakan adalah heksan dengan volume setengah volume batu didih atau sekitar 60 kali putaran. Bekas sampel yang telah terekstrak minyaknya dikeringkan dalam oven serta ditimbang bobotnya sampai diperoleh bobot konstan. Kadar lemak dihitung dengan persamaan berikut: 5. Kadar serat kasar (AOAC 1995) Sebanyak 2 g sampel bekas kadar lemak dimasukkan ke dalam erlenmeyer 500 ml dan ditambah 100 ml larutan asama sulfat 0.325 N. Campuran sampel kemudian didihkan dengan alat pendingin tegak selama kurang lebih 30 menit, kemudian ditambahkan lagi 50 ml larutan kemudian disaring dengan kertas saring Whatman no. 41 yang telah dikerinkan dan diketahui bobotnya. Pembialasan hasil saringan dilakukan berturut-turut dengan larutan asam sulfat 0.325 N, air panas, dan etanol. Kertas saring dikeringkan dalam oven selama 1 2 jam, kemudian didinginkan dalam desikator an ditimbang bobotnya. Pengeringan diulangi setiap setengah jam, kemudian ditimbang sampai diperoleh bobot konstan. Kadar serat kasar dihitung dengan persamaan berikut: 6. Analisis komponen serat a. Penetapan NDF (Neutral Detergent Fiber) (Van Soest 1969 dalam Apriantono et al. 1989) Sampel sebanyak 0.5 g (A) dimasukkan ke dalam erlenmeyer berukuran 250 ml. Sampel yang mengandung pati ditambahkan dengan α-amilase 30 ml dalam bufer fosfat ph 7.0 ± 0.05 selama 16 jam dalam inkubator 40ºC. Sampel kemudian ditambahkan larutan NDF sebanyak 100 ml dan 0.5 g Na 2 SO 3. Larutan NDF terdiri atas bahan kimia sebagai berikut: akuades 1 l, sodium lauril sulfat 30 g, EDTA 18.61 g, natrium borat 10 H 2 O 6.81 g, di-na 2 HPO4 anhidrat 4.56 g dan 2-etoksietanol murni 10 ml (ph akhir larutan 6.9 7.1). Kemudian sampel direfluks pada pendingin tegak selama 60 menit dan disaring dengan bantuan pompa vakum menggunakan filter glass 2-G-3. Sampel dibilas dengan 37
air panas beberapa kali kemudian dilanjutkan dengan aseton beberapa kali. Hasil penyaringan tersebut dikeringkan dalam oven 100ºC hingga diperoleh bobot tetap, setelah itu dimasukkan dalam desikator selama satu jam, kemudian dilakukan penimbangan (B). Filter dilabukan pada tanur suhu 450-500ºC sampai diperoleh bobot tetap, kemudian ditimbang (C). Kadar NDF dihitung dengan rumus berikut. Keterangan : A= bobot sampel (g) B= bobot filter glass dan sampel setelah dioven (g) C= bobot filter glass dan sampel setelah ditanur (g) b. Penetapan ADF (Acid Detergent Fiber) dan hemiselulosa (Van Soest 1969 dalam Apriantono et al. 1989) Sampel sebanyak 1 g (A), dimasukkan ke dalam gelas piala serta ditambahkan dengan 100 ml larutan ADF. Larutan ADF terdiri atas 1 liter H 2 SO 4 1 N dan 20 g CTAB (Cethyle Trimethyl Ammonium Bromide). Sampel yang telah ditambahkan larutan tersebut dipanaskan selama satu jam di atas pendingin balik. Penyaringan dilakukan dengan bantuan pompa vakum dengan menggunakan filter glass 2-G-3. Pencucian dilakukan bergantian dengan air panas beberapa kali kemudian dilanjutkan dengan aseton beberapa kali. Hasil penyaringan tersebut dikeringkan dalam oven 100ºC hingga diperoleh bobot tetap, setelah itu dimasukkan dalam desikator selama satu jam, kemudian dilakukan penimbangan (B). Filter diabukan pada tanur dengan suhu 450-500ºC sampai diperoleh bobot tetap, kemudian ditimbang (C). Kadar ADF dihitung dengan rumus berikut. Keterangan : A= bobot sampel (g) B= bobot filter glass dan sampel setelah dioven (g) C= bobot filter glass dan sampel setelah ditanur (g) Maka: Kadar hemiselulosa = % NDF - %ADF c. Kadar selulosa Residu ADF (C) yang berada dalam filter glass diletakkan di atas nampan yang berisi air setinggi kira-kira 1 cm, kemudian ditambahkan H 2 SO 4 setinggi ¾ bagian filter glass dan dibiarkan selama 3 jam sambil diaduk-aduk. Penyaringan dengan filter glass dibantu dengan pompa vakum. Pencucian dilakukan dengan aseton dan air panas, kemudian dioven pada suhu 100ºC hingga diperoleh bobot tetap. Sampel didinginkan ke dalam desikator kemudian ditimbang (D). 38
Keterangan : A= bobot sampel (g) C= bobot filter glass dan residu ADF awal (g) D= bobot filter glass dan residu ADF setelah dioven (g) Maka: Kadar lignin = % ADF - %selulosa 6. Kadar pati (Djalil 2003) Sampel sebanyak 1 g dihidrolisis dengan 100 ml larutan HCL 3% selama 1 jam dengan autoclave suhu 115ºC. Selanjutnya dilakukan penetralan dengan larutan NaOH 4 N dan dilakukan pengenceran hingga diperoleh volume 250 ml. Filtrat sebanyak 10 ml dipipet dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer yang telah diisi dengan 25 ml larutan Luff Schroll. Campuran dididihkan dibawah pendingin tegak selama 10 menit kemudian dididnginkan. Larutan ditambahkan 20 ml larutan KI 20% dan 25 ml larutan H 2 SO 4 secara perlahan. Titrasi dilakukan dengan larutan Na 2 S 2 O 3 0.1 N hingga terbentuk larutan putih susu, kemudian ditambahkan indikator kanji 1% (terbentuk warna biru). Titrasi kembali dilakukan sampai warna biru hilang. Penetapan blanko juga perlu dilakukan dengan menggunakan aquades sebagai pengganti sampel. 7. Penetuan aktivitas enzim (Derosya 2010) Substrat masing-masing enzim, yaitu: soluble starch (α-amilase) dan birchwood xilan (xilanase) dibuat menjadi larutan 0.15% dalam buffer fosfat sitrat pada ph yang akan diujikan, sedangkan CMC (selulase) dibuat menjadi larutan 0.5% dalam buffer fosfat sitrat pada ph yang akan diujikan. Ketiga enzim tersebut juga diencerkan dengan buffer fosfat sitrat pada ph yang akan diujikan. Larutan substrat dan enzim kemudian dicampurkan dan diinkubasi pada suhu yang akan diujikan selama 30 menit. Tiap 10 menit, larutan dipipet sebanyak 2 ml kemudian ditambahkan pelarut DNS (dinitrosalisilat) sebanyak 6 ml untuk diukur gula pereduksi yang terbentuk. Sebagai kontrol, larutan substrat dan enzim pada waktu ke-0 juga diukur gula pereduksinya. Aktivitas enzim didapatkan dengan rumus berikut. 8. Nilai dextrose equivalent (DE) a. Gula pereduksi Larutan hasil hidrolisis pati tepung glukomanan dipipet sebanyak 10 ml, kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml. Larutan dipipet sebanyak 2 ml dan dimasukkan ke dalam tabung ulir 10 ml, ditambahkan larutan DNS (dinitrosalisilat) 6 ml. Larutan tersebut dimasukkan ke dalam air mendidih selama 5 menit dan didinginkan dalam air mengalir. Setelah itu, absorbansi larutan diukur pada panjang gelombang 550 nm dengan spektrofotometer. 39
Kurva standar gula pereduksi Sebagai standar glukosa, dibuat larutan glukosa dengan konsentrasi 0, 50, 100, 150, 200, 250 dan 300 ppm dari larutan glukosa 500 ppm. Kemudian sebanyak 2 ml larutan dipipet dari masingmasing larutan glukosa tersebut dan dimasukkan ke dalam tabung ulir 10 ml. Larutan ditambahkan pereaksi DNS (dinitrosalisilat) sebanyak 6 ml, kemudian dimasukkan ke dalam air mendidih selama 5 menit dan didinginkan dalam air mengalir. Absorbansi larutan tersebut diukur pada panjang gelombang 550 nm menggunakan spektrofotometer. Absorbansi yang diperoleh kemudian diplotkan kedalam grafik sehingga diperoleh persamaan. b. Total gula Larutan hasil hidrolisis pati tepung glukomanan dipipet sebanyak 2 ml, kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml. Larutan tersebut dipipet 1 ml ke dalam tabung ulir 10 ml, ditambahkan larutan fenol 5% sebanyak 1 ml dan larutan H 2 SO4 sebanyak 5 ml. Larutan didiamkan pada suhu ruang hingga dingin dan terbentuk larutan berwarna jingga seulas. Kemudian larutan tersebut dimasukkan ke dalam air mendidih selama 15 menit dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 490 nm dengan spektrofotometer. Maka nilai DE dapat diperoleh dari rumus berikut. Kurva standar total gula Sebagai standar glukosa, dibuat larutan glukosa dengan konsentrasi 0, 10, 20, 30, 40, 50 dan 50 ppm dari larutan glukosa 100 ppm. Kemudian sebanyak 2 ml larutan dipipet dari masing-masing larutan glukosa tersebut dan dimasukkan ke dalam tabung ulir 10 ml. Larutan ditambahkan larutan fenol 5% sebanyak 1 ml dan larutan H 2 SO4 sebanyak 6 ml. Kemudian larutan tersebut dimasukkan ke dalam air mendidih selama 15 menit dan didinginkan dalam air mengalir. Absorbansi larutan tersebut diukur pada panjang gelombang 490 nm menggunakan spektrofotometer. Absorbansi yang diperoleh kemudian diplotkan kedalam grafik sehingga diperoleh persamaan. 8. Kadar glukomanan (Ohtsuki 1968) Pengukuran kadar glukomanan dilakukan dengan mengguanakan cara ekstraksi oleh etanol berdasarkan metode Whistler dan Richards (1970) dan Murtinah (1977) yang mengisolasi kadar tepung glukomana dari tepung iles-iles dengan menggunakan larutan etanol 95% secara pengkristalan kembali. Sampel tepung glukomanan sebanyak 1 g ditambah dengan 30 ml aquades, kemudian diekstraksi pada suhu 45ºC selama dua jam dengan kecepatan pengadukan tetap kontinyu. Setelah ekstraksi selesai, larutan ekstraksi dipisahkan dari ampas tepung iles-iles dengan cara sentrifugasi. Larutan kental hasil ekstraksi yang diperoleh dimasukkan ke dalam erlenmeyer, kemudian disimpan di dalam lemari es selama 1 jam. Setelah disimpan dalam lemari es, sampel ditambah larutan etanol 95% sebanyak 13 ml dengan dituangkan sedikit demi sedikit sambil diaduk-aduk hingga terjadi pengendapan glukomanan. Setelah glukomanan mengendap, biarkan endapan tersebut di dalam campuran sampai terjadi pemisahan lapisan antara glukomanan dan larutan. Endapan glukoamann dipisahkan dengan cara penyaringan dan endapan dicuci dengan larutan etanol 95%. Glukomanan yang diperoleh dikeringkan dalam oven pada suhu 35 40ºC sampai bobot tetap. Glukomanan yang 40
sudah kering berbentuk bubuk berwana cokelat dan ditimbang untuk diketahui bobotnya serta dihitung dengan menggunakan rumus berikut. 9. Penentuan rendemen tepung glukomanan Rendemen tepung glukomanan dihitung berdasarkan perbandingan antara bobot tepung ilesiles yang diperoleh dengan bahan mentah yang digunakan. Rendemen tepung glukomanan dapat dihitung dengan menggunakan rumus di bawah ini: 10. Kadar kekentalan larutan (Perry dan Chilton 1980) Kekentalan larutan glukoamanan ditentukan mengguanakan Viscometer Brookfield. Nilai kekentalan dalam satuan centipoise yang didapat dengan mengalikan faktor yang ada pada alat dengan nilai yang terbaca. Sampel sebanyak 2 g dibuat menjadi larutan konsentrasi 2%. Spindel yang diguanakan adalah spindel nomor 1 dengan kecepatan 60 putaran per menit dengan faktor konversi 1. Nilai viskositas dicari dengan menggunakan rumus berikut. 11. Derajat putih Pengukuran derajat putih tepung glukomanan dilakukan dengan menggunakan whiteness meter model C100. Skala pembacaan derajat putih yang digunakan antara 0-110. 41
Lampiran 2. Visualisasi tahapan proses pemurnian glukomanan 1 2 3 Umbi iles-iles Keripik iles-iles Penggilingan chips kering iles-iles dengan disc mill 4 5 6 Tepung iles-iles 40 mesh Hasil hidrolisis tepung glukomanan Pemisahan serat dan glukomanan dengan sentrifugasi 7 Ekstraksi glukomanan dengan etanol 95% 8 Pemisahan endapan glukomanan dengan hidrolisat Pengeringan endapan glukomanan 9 Tepung glukomanan (endapan glukomanan setelah digiling) 10 42
Lampiran 3. Hasil analisis sidik ragam (Anova) dan uji Duncan 1. Nilai DE Analisis ragam (Anova) nilai DE hidrolisat pati pada tepung glukomanan Sumber Keragaman db Jumlah Kuadrat Kuadrat Tengah F hitung F tabel Waktu 2 512.839 256.420 3.926* 9.552 Galat 3 195.939 65.313 Total 5 708.779 Keterangan : * : Tidak berbeda nyata dengan uji statistik pada α = 5% 2. Rendemen Analisis ragam (Anova) rendemen tepung glukomanan Sumber Keragaman db Jumlah Kuadrat Kuadrat Tengah F hitung F tabel Waktu 2 3.810 1.905 0.018* 9.552 Galat 3 315.246 105.082 Total 5 319.055 Keterangan : * : Tidak berbeda nyata dengan uji statistik pada α = 5% 3. Kadar glukomanan Analisis ragam (Anova) kadar glukomanan tepung glukomanan Sumber Keragaman db Jumlah Kuadrat Kuadrat Tengah F hitung F tabel Waktu 2 81.439 40.719 0.770* 9.552 Galat 3 158.704 52.901 Total 5 240.142 Keterangan : * : Tidak berbeda nyata dengan uji statistik pada α = 5% 4. Viskositas Analisis ragam (Anova) viskositas tepung glukomanan Sumber Keragaman Db Jumlah Kuadrat Kuadrat Tengah F hitung F tabel Waktu 2 886.750 443.375 16.147* 9.552 Galat 3 82.375 27.458 Total 5 969.125 Keterangan : * : Berbeda nyata dengan uji statistik pada α = 5% 43
Hasil uji lanjut metode Duncan viskositas tepung glukomanan Perlakuan rataan 0.05 A2 45.250 A A1 31.500 AB AB A3 15.500 B Keterangan : kode yang sama menunjukkan perlakuan tidak berbeda nyata kode yang berbeda menunjukkan perlakuan berbeda nyata 5. Derajat putih Analisis ragam (Anova) derajat putih tepung glukomanan Sumber Keragaman db Jumlah Kuadrat Kuadrat Tengah F hitung F tabel Waktu 2 3.915 1.958 0.750* 9.552 Galat 3 7.827 2.609 Total 5 11.742 Keterangan : * : Tidak berbeda nyata dengan uji statistik pada α = 5% 44