II. METODOLOGI 2.1 Persiapan Wadah dan Ikan Uji Wadah yang digunakan dalam penelitian ini adalah bak terpal dengan ukuran 2 m x1m x 0,5 m sebanyak 12 buah (Lampiran 2). Sebelum digunakan, bak terpal dicuci dengan deterjen dan dikeringkan di bawah terik matahari selama 1 hari. Selanjutnya, bak diisi air sampai ketinggian 25-30 cm dan dibiarkan di dalam terpal selama 3 hari. Ikan lele yang digunakan memiliki bobot awal rata-rata 3,53 ± 0,51 g dengan panjang awal 7,27 ± 0,34 cm. Ikan lele diadaptasikan di dalam terpal selama 1 minggu dan diberikan pakan sebanyak 2 kali sehari secara at satiation. Setelah proses adaptasi, ikan lele ditebar ke dalam terpal dengan kepadatan 100 ekor/m 2. Pemberian pakan selama perlakuan dilakukan berdasarkan FR (feeding rate) 8% biomassa dan diberikan sebanyak 2 kali dalam sehari. 2.2 Persiapan Pakan Uji Meniran yang digunakan dalam pakan uji adalah bagian daun. Pembuatan tepung meniran dilakukan dengan dibersihkannya daun meniran dari kotoran yang melekat dengan air mengalir. Setelah dibersihkan, daun meniran dikeringanginkan di udara tanpa terkena sinar matahari secara langsung kurang lebih selama 3 hari. Setelah kering, meniran dihaluskan dengan menggunakan blender agar menjadi bubuk dan selanjutnya dilakukan penyaringan menggunakan saringan halus dengan mesh size 0,5-1 mm. Pembuatan tepung bawang putih dilakukan dengan dibersihkannya bawang putih dari kulitnya. Selanjutnya bawang putih diiris tipis dan dikeringanginkan di udara tanpa terkena sinar matahari langsung kurang lebih selama 5 hari. Setelah dijemur, bawang putih dioven pada suhu 60 o C selama 1 jam agar bawang putih benar-benar kering. Setelah kering, bawang putih dihaluskan dengan menggunakan blender untuk dijadikan bubuk dan diayak menggunakan saringan halus dengan mesh size 0,5-1 mm. Pembuatan pakan uji dilakukan dengan mencampurkan semua bahan baku pakan dengan tepung meniran dan bawang putih. Perbandingan tepung meniran 3
dan bawang putih sebesar 1:2 pada perlakuan pencegahan. Dosis pengobatan adalah dua kali lipat dari dosis pencegahan (Angka, 2005). Berdasarkan perhitungan dari dosis pakan perlakuan pada penelitian Kurniawan (2010), maka rincian dosis campuran tepung meniran dan bawang putih perlakuan dalam penelitian ini dapat dilihat pada Tabel 1. Tabel 1. Dosis campuran tepung meniran dan bawang putih dalam pakan perlakuan Perlakuan Total (%) Meniran (%) Bawang Putih (%) Kontrol (-) 0 0 0 Kontrol (+) 0 0 0 Pencegahan 2,1 0,7 1,4 Pengobatan 4,2 1,4 2,8 Tepung meniran dan bawang putih sesuai dosis pada Tabel 1 dicampurkan pada saat proses pencampuran (mixing) bahan baku pada pembuatan pakan sehingga dapat bercampur secara merata. Setelah itu ditambahkan vitamin C 0,1% dan air sebanyak 30% dan dicetak, kemudian dikeringkan dengan menggunakan oven selama 2 jam pada suhu 60 o C. Pakan disimpan dalam wadah kedap udara. 2.3 Prosedur Penelitian Pengujian dilakukan untuk menganalisis pengaruh dari perlakuan pakan uji terhadap kelangsungan hidup ikan lele. Pengamatan sebelum uji tantang dilakukan selama 21 hari dan pengamatan setelah uji tantang dilakukan selama 14 hari. Perlakuan pencegahan diberikan pakan uji dari awal pemeliharaan sampai hari ke 21. Berdasarkan penelitian Widiani (2011), pemberian pakan yang mengandung bawang putih dan meniran untuk pencegahan terhadap bakteri Aeromonas hydrophila efektif diberikan selama 21 hari. Perlakuan pengobatan diberikan pakan uji pada hari ke 22 sampai hari ke 35. Ikan lele diberikan uji tantang berupa pergantian sumber air yaitu dari sumber air tandon ke sumber air selokan (berasal dari pembuangan air kolam) sebanyak 100%. Setiap terpal diisi dengan ikan lele dengan kepadatan 65 ekor/m 2. Selama proses pengamatan uji tantang selama 14 hari, tidak dilakukan pergantian air seperti saat pemeliharaan sebelumnya. 4
Gambar 1. Skema penelitian 2.4 Parameter Pengamatan Parameter yang diamati terdiri dari parameter jumlah ikan yang hidup dan bobot. Parameter tersebut selanjutnya digunakan untuk menghitung derajat kelangsungan hidup, laju pertumbuhan mutlak dan laju pertumbuhan harian. Pengamatan terhadap bakteri meliputi perhitungan jumlah bakteri total, pengamatan dominasi bakteri secara kualitatif, dan karakterisasi isolat bakteri terpilih. Parameter kualitas air meliputi parameter fisika (suhu), dan kimia (ph, DO, NH 3 ). 2.4.1 Derajat Kelangsungan Hidup Derajat kelangsungan hidup dihitung dari jumlah ikan yang hidup pada awal dan akhir pemeliharaan. Parameter tersebut dihitung dengan menggunakan rumus: 5
Kelangsungan hidup = Nt x 100% No Keterangan : No = jumlah populasi ikan yang hidup hari ke-0 (ekor) Nt = jumlah populasi ikan yang hidup hari ke-i (ekor) 2.4.2 Laju Pertumbuhan Mutlak Laju pertumbuhan mutlak dihitung pada setiap minggu (sampling) selama perlakuan dengan menggunakan timbangan digital. Ikan pada masing-masing perlakuan ditimbang bobotnya, kemudian dihitung nilai pertumbuhan ikan pada setiap perlakuan. Parameter tersebut dihitung dengan menggunakan rumus: GR = w t - w o t Keterangan: GR = Laju pertumbuhan mutlak (gram/hari) w t = Bobot rata-rata hari ke- t (gram) w o = Bobot rata-rata hari ke-0 (gram) t = Lama pemeliharaan 2.4.3 Laju Pertumbuhan Harian Laju pertumbuhan harian diamati pada setiap minggu selama perlakuan. Laju pertumbuhan harian ikan dihitung dari data bobot yang didapat pada kegiatan sampling. Parameter tersebut dihitung dengan menggunakan rumus: SGR = t wt wo 1 x 100% Keterangan: SGR = Laju pertumbuhan harian (%) wt = Bobot rata-rata individu waktu ke-i (gram/ekor) wo = Bobot rata-rata individu waktu ke-0 (gram/ekor) t = Periode pengamatan (hari) 2.4.4 Perhitungan Jumlah Bakteri Total dan Pengamatan Koloni Bakteri yang Dominan Secara Kualitatif Jumlah bakteri diamati dengan menyebar air sampel menggunakan metode sebar (Hadioetomo, 1989) pada media Trypticase Soy Agar (TSA) kemudian di inkubasi selama 1x24 jam pada suhu 28-30 o C. Pengamatan koloni bakteri yang 6
dominan secara kualitatif dilakukan dengan cara melihat bentuk dan warna koloni bakteri yang terbentuk pada media TSA. Jumlah bakteri dihitung dengan rumus: bakteri = koloni terhitung 1 vol.suspensibakteri 1 pengenceran Keterangan: Koloni terhitung Volume suspensi bakteri Pengenceran = Koloni bakteri yang tumbuh pada media TSA = Volume suspensi bakteri yang disebar pada media TSA = Pengenceran yang digunakan 2.4.5 Karakterisasi Isolat Bakteri Terpilih Karakterisasi terhadap isolat bakteri terpilih dilakukan melalui beberapa uji meliputi pewarnaan gram, uji O/Fi, uji katalase, uji oksidase, dan uji motilitas. Panduan identifikasi bakteri yang digunakan berdasarkan tabel Cowan (Cowan dan Steel, 1974). a) Pewarnaan Gram Isolat bakteri diambil dengan menggunakan ose secara aseptik dan diletakkan diatas gelas objek yang sebelumnya telah ditetesi dengan akuades. Bakteri dan akuades dicampurkan di atas gelas objek dan dikering-udarakan. Preparat bakteri yang telah kering, ditetesi dengan menggunakan larutan kristal violet selama 1 menit dan dibilas dengan air mengalir. Setelah kering, preparat ditetesi kembali dengan menggunakan larutan kalium iodida selama 1 menit dan dibilas dengan air mengalir. Selanjutnya preparat ditetesi dengan larutan alkohol selama 30 detik, dibilas dan dikeringkan. Preparat ditetesi kembali dengan menggunakan larutan safranin selama 30 detik, dibilas dan dikeringkan. Preparat diamati dengan mikroskop pada perbesaran 1000x. Hasil menunjukkan bakteri tersebut Gram positif apabila dalam pengamatan dengan mikroskop bakteri berwarna biru gelap atau ungu dan Gram negatif apabila bakteri berwarna merah muda. Bakteri dengan bentuk menyerupai batang maka bentuk bakteri tersebut adalah basil dan bakteri menyerupai bulatan maka bentuk bakteri adalah coccus. 7
b) Uji Oksidasi/Fermentasi Isolat bakteri diambil dengan menggunakan ose secara aseptik. Bakteri selanjutnya diinokulasikan kedalam satu set media O/F secara vertikal. Salah satu dari media O/F diberi parafin cair sebanyak 1 ml. Media O/F yang telah diinokulasikan di inkubasi selama 24 jam pada suhu 28-30 o C dan diamati perubahan warna yang terjadi pada media O/F tersebut. Hasil uji, reaksi oksidatif bila pada tabung yang tidak diberi paraffin berubah menjadi kuning, sedangkan reaksi fermentatif bila tabung yang diberi paraffin berwarna kuning atau kedua tabung berubah warna menjadi kuning. Uji O/F negatif apabila tidak terdapat perubahan warna pada kedua tabung tersebut. c) Uji Katalase Gelas objek disiapkan dan ditetesi larutan hydrogen peroksida (H 2 O 2 ). Kemudian isolat bakteri diambil dengan menggunakan ose secara aseptik dan diletakkan di atas larutan H 2 O 2 pada gelas objek, lalu diamati ada atau tidaknya gelembung. Hasil uji, reaksi positif apabila adanya gelembung-gelembung udara dan hasil negatif apabila tidak adanya gelembung udara. d) Uji Oksidase Gelas objek disiapkan dan diletakkan kertas cakram di atasnya. Lalu kertas cakram ditetesi dengan larutan P-aminodimethylaniline-oxalat 1%. Kemudian isolat bakteri diambil dengan menggunakan ose secara aseptik dan diletakkan di atas kertas cakram pada gelas objek, lalu diamati ada atau tidaknya perubahan warna pada kertas cakram. Hasil uji positif apabila adanya perubahan warna merah muda menjadi merah marun pada permukaan kertas cakram dan reaksi negatif apabila tidak adanya perubahan warna. e) Uji Motilitas Isolat bakteri diambil dengan menggunakan ose secara aseptik. Bakteri selanjutnya ditusukkan ke media SIM (sulfida indol motility) dengan kedalaman dua pertiga media. Selanjutnya media di inkubasi selama 24 jam pada suhu 28-30 o C, dan diamati tumbuhnya bakteri pada media tersebut. Hasil uji positif apabila 8
terdapat pertumbuhan bakteri pada permukaan medium dan hasil uji negatif apabila bakteri tumbuh hanya di sekitar bekas tusukan pada media SIM. 2.4.6 Kualitas Air Parameter kualitas air yang akan diamati meliput pengukuran suhu, ph, DO (oksigen terlarut), dan amoniak. Pengukuran parameter kualitas air dilakukan pada awal dan akhir penelitian. Tabel 2. Parameter kualitas air, satuan, dan alat ukur yang digunakan selama penelitian Parameter Satuan Alat ukur Suhu o C Termometer ph Unit ph meter DO (oksigen terlarut) mg/l DO meter Amoniak (NH 3 ) mg/l Spektrofotometer 2.5 Analisis Data Penelitian ini menggunakan RAL (rancangan acak lengkap). Data dianalisis menggunakan program SPSS 16.0 dan uji lanjut untuk beda nyata menggunakan uji Duncan. Parameter yang dianalisis statistik secara kuantitatif adalah derajat kelangsungan hidup, laju pertumbuhan mutlak dan laju pertumbuhan harian (Lampiran 3). Parameter yang dianalisis secara deskriptif adalah jumlah bakteri total dan kualitas air. 9