Tugas Akhir SB 091351 Sitotoksisitas Ekstrak Spons Laut Aaptos suberitoides Terhadap Siklus Sel Kanker HeLa Ika Puspita Ningrum 1507100059 DOSEN PEMBIMBING: Dra. Nurlita Abdulgani, M.Si N. D. Kuswytasari, S.Si., M.Si
Latar belakang Kanker serviks Pengobatan medis efek samping relatif besar dan biaya mahal Antikanker dari bahan alam sponge Analisis siklus sel Aaptos suberitoides berpotensi sebagai antikanker untuk kanker serviks Praskrining dan uji sitotoksisitas in vitro terhadap sel HeLa
Permasalahan Sitotoksisitas in vitro Analisis siklus sel Aaptos suberitoides berpotensi sebagai antikanker pada sel HeLa dengan nilai LC 50 133.968 µg/ml dan IC 50 sebesar 153.007 µg/ml Fase apakah dalam siklus sel HeLa yang dihambat oleh ekstrak spons laut A. suberitoides
Batasan masalah Analisis siklus sel menggunakan metode flow cytometry dengan pewarnaan propidium iodide. Parameter yang diukur adalah persentase jumlah sel pada masing-masing fase siklus sel
Tujuan untuk mengetahui toksisitas ekstrak spons laut Aaptos suberitoides terhadap siklus sel kanker HeLa Sebagai produk farmasi untuk pengembangan obat antikanker baru Manfaat Sebagai dasar pengembangan dalam upaya pemanfaatan sumber daya hayati laut di Jawa Timur
Metodologi Penelitian waktu Bulan Januari - Juni 2011 tempat LPPT dan Laboratorium Patologi Fakultas Kedokteran UGM Yogyakarta
Skema Kerja treatmen Flow cytometry Propagasi sel Hela Pemanenan sel Hela Pembuatan medium kultur (Penumbuh) RPMI 1640 Preparasi sampel untuk flow cytometry
Pembuatan Medium Kultur RPMI 1640 Fetal Bovine Serum (FBS) 10% Hasil dimasukkan ke dalam botol steril sebanyak 20mL + 2 ml penisilin-streptomisin 1% + 1mL fungizon 0,5% disterilisasi + 200 ml medium RPMI 1640 murni semua perlakuan dibuat di dalam LAF disimpan di dalam lemari pendingin pada suhu ± 4 C
Propagasi Sel HeLa Ampul Kultur Sel HeLa diambil dari stok yang disimpan dalam tangki cair yang diletakkan dalam locator pada suhu -196 C dicairkan dalam air sampai suhunya mencapai ± 37 C disemprot dengan alcohol 70% dibuka dan sel dipindahkan ke dalam tabung conical steril yang berisi 10ml medium RPMI 1640 Suspensi Sel HeLa Hasil disentrifuge suspensi sel dengan kecepatan 1500 rpm selama ± 5 menit Supernatan dibuang, pellet ditambah 1 ml medium penumbuh RPMI 1640 yang mengandung FBS 10% diresuspensikan perlahan sampai homogeny ditumbuhkan dalam beberapa (2-3) buah tissue culture flask kecil diinkubasi dalam incubator pada suhu 37 C dengan aliran 5% CO 2 dan 95% O 2 selama 24 jam media diganti ditumbuhkan sel sampai konfluen dan jumlahnya cukup untuk penelitian
Pemanenan Sel Sel HeLa dilihat hingga jumlahnya cukup atau konfluen (± 70%) dicuci dengan PBS sebanyak dua kali + tripsin 0,25% sebanyak 300 µl Diinkubasi selama tiga menit di dalam inkubator + ± 5 ml medium kultur diresuspensi secara perlahan menggunakan pipet Sel telah siap digunakan untuk penelitian Hasil
Treatmen flow cytometry Sel HeLa Analisis Siklus Sel + 500 µl seri konsentrasi sampel (¼ IC 50 ) dan 500 µl seri konsentrasi cisplatin (¼ IC 50 ) Perlakuan kombinasi disistribusikan sebanyak 1000 µl dengan kepadatan 5 x 10 5 sel/1000 µl media ke dalam sumuran- sumuran pada 6-well plate diinkubasi di dalam incubator selama semalam Dibuang PBS dicuci dengan 500 µl PBS dibuang media kultur + 500 µl seri konsentrasi sampel (1/4 IC 50 ) + 500 µl seri konsentrasi sampel (1/10 IC 50 ) + 500 µl seri konsentrasi Cisplatin (1/4 IC 50 ) + 500 µl seri konsentrasi Cisplatin (1/10 IC 50 ) Perlakuan tunggal sampel Perlakuan tunggal Cisplatin Diinkubasi 24 jam + 1000 µl media kultur Kontrol sel
Preparasi sampel untuk flow cytometry Perlakuan kombinasi Perlakuan tunggal sampel Perlakuan tunggal Cisplatin Kontrol sel Diambil media, dipindahkan ke eppendorf I disentrifuge Dibuang media Dicuci dengan PBS sebanyak 3 kali + 150 µl tripsin-edta 0,25% Diinkubasi 3 menit Dibuang MK/PBS ependorf I dan II disentrifuge ditransfer ke ependorf II + 500 µl PBS ke dalam sumuran ditransfer ke ependorf II + 1 ml MK diresuspensi + dan resuspen pellet sel dengan 500 µl PBS dingin suspense sel digabungkan dalam ke dalam ependorf I ependorf kosong dibilas dengan PBS ditransfer ke ependorf I eppendorf I disentrifuge dibaca dengan flow cytometer FACS Calibur Ditransfer ke dalam flowcytotube diinkubasi di waterbath 37 C selama 10 menit Dibungkus dengan alufoil + reagen flow cytometry sebanyak 400 µl dan diresuspensi Dibuang PBS
Rancangan percobaan dan Analisa data Rancangan percobaan : RAL satu faktorial Analisis Data : one way ANOVA (α = 0,05) signifikan Uji LSD
Variabel dan hipotesis penelitian Variabel : Variabel bebas adalah konsentrasi ekstrak spons A. suberitoides dan Cisplatin, yaitu ¼ IC 50 dan 1/10 IC 50 Variabel respon adalah tahapan pada siklus sel HeLa, yaitu subg1, G1, S, dan G2/M Hipotesis : Ho = Tidak ada pengaruh penambahan ekstrak spons A.suberitoides pada tiap-tiap fase siklus sel HeLa H 1 = Ada pengaruh penambahan ekstrak spons A.suberitoides pada tiap-tiap fase siklus sel HeLa
HASIL DAN PEMBAHASAN Efek perlakuan pada morfologi sel HeLa
M1 9287 66.09 46.43 200.39 8.04 199.00 M2 1609 11.45 8.04 288.35 10.23 286.00 M3 1715 12.20 8.58 383.45 7.68 379.00 R3 Profil Siklus Sel M4 145 HeLa 1.03 0.73 521.32 7.71 506.00pada berbagai perlakuan M5 1094 7.79 5.47 63.19 64.59 48.00 R3 M5 M5 M1 M1 M2 M2 M2 M3 M3 M3 M4 M4 M4 R3 Histogram Statistics File: KONTROL HeLA.0813.10.012 Log Data Units: Linear Values Sample ID: KONTROL HeLA.0813.10 Patient ID: 0813.10.01 M3 Acquisition Date: 13-Aug-10 Gate: G3 M5 M2 Gated Events: 14052 Total Events: M4 20000 M1 Marker Events % Gated % Total Mean CV Median All 14052 100.00 70.26 217.21 36.07 199.00 M1 9855 70.13 49.28 197.68 7.23 196.00 M2 1536 10.93 7.68 292.49 10.19 291.00 M3 1617 11.51 8.09 374.85 7.38 369.00 M4 12 0.09 0.06 472.00 0.31 472.00 M5 1114 7.93 5.57 61.18 69.35 45.00 Histogram Statistics M3 File: CISPLATIN 1/4 HeLA.0813.10.015 M5 M2 Log Data Units: Linear Value M4 Sample ID: CISPLATIN 1/4 HeLA.0813.10 Patient ID: 0813.10.01 M1 Acquisition Date: 13-Aug-10 Gate: G3 M3 Gated Events: 13794 Total Events: 20000 M5 M2 M4 Marker Events M1 % Gated % Total Mean CV Median All 13794 100.00 68.97 259.56 48.01 251.00 M1 4755 34.47 23.77 209.54 9.88 211.00 M2 4883 35.40 24.41 284.91 9.65 282.00 M3 2250 16.31 11.25 380.26 8.10 374.00 M4 171 1.24 0.85 507.63 7.10 494.00 M5 1655 12.00 8.28 64.26 71.80 47.00 Histogram Statistics File: CISPLATIN 1/4 HeLA.0813.10.015M3 R3 Log Data Units: Linear Values Histogram Statistics File: EKSTRAK 1/4 HeLA.0813.10.017 Log Data Units: Linear Values Sample ID: EKSTRAK 1/4 HeLA.0813.10 M3 Patient ID: 0813.10.01 Acquisition Date: 13-Aug-10 Gate: G3 M5 M2 Gated Events: 15622 Total Events: 20000 M4 Marker Events % Gated M1 % Total Mean CV Median All 15622 100.00 78.11 216.17 60.51 199.00 M1 9702 62.10 48.51 197.87 8.85 196.00 M2 1660 10.63 8.30 290.22 9.93 289.00 M3 1609 10.30 8.04 381.43 7.76 375.00 M4 156 1.00 0.78 510.80 6.76 502.00 M5 2291 14.67 11.46 35.24 133.57 11.00 a. b. c. Histogram Statistics File: EKSTRAK 1/4 HeLA.0813.10.017 Log Data Units: Linear Values Sample ID: EKSTRAK 1/4 HeLA.0813.10 Histogram Patient ID: Statistics 0813.10.01 Acquisition Date: 13-Aug-10 M3 Gate: G3 Gated Events: 15622 File: CISPLATIN 1/10 M2 HeLA.0813.10.014 Total Events: 20000 Log Data Units: Linear Val M5 Sample ID: CISPLATIN 1/10 HeLA.0813.10 M4 Patient ID: 0813.10.01 M3 Marker Events Acquisition % Gated M1 Date: % Total 13-Aug-10 Mean CV Median Gate: G3 M5 M2 All 15622 Gated Events: 100.00 13969 78.11 201.84 46.85 197.00 M4Total Events: 20000 M1 10109 64.71 50.54 197.20 7.99 196.00 M1 M2 1703 Marker 10.90 Events 8.52 % Gated 294.60 % Total 10.07 Mean 295.00 CV Median M3 1532 All 9.81 13969 7.66 100.00 375.41 69.847.67 250.12 369.00 43.68 246.00 M4 62 M1 0.40 48990.31 35.07 485.03 24.501.60 202.12 484.00 10.78 200.00 M5 2280 M214.59443611.40 31.76 33.00 22.18 136.98 290.61 10.00 9.55 289.50 M3 2501 17.90 12.50 375.35 7.66 368.00 M4 127 0.91 0.64 503.40 5.26 499.00 M5 1986 14.22 9.93 82.61 61.83 89.00 d. e. f. Histogram Statistics File: CISPLATIN 1/10 HeLA.0813.10.014 Log Data Units: Linear Value M3 Sample ID: CISPLATIN 1/10 HeLA.0813.10 Patient ID: 0813.10.01 M2 R3
Distribusi sel HeLa setelah perlakuan Jenis Perlakuan Konsentrasi Jumlah Sel (%) subg1 G1 S G2/M Kontrol 0 6,41 46,44 8,04 8,53 Ekstrak A. suberitoides ¼ IC 50 10,00 48,50 8,25 7,98 1/10 IC 50 7,45 50,22 8,03 8,22 Cisplatin ¼ IC 50 8,34 23,76 24,28 11,17 1/10 IC 50 9,35 24,50 22,19 12,52 Kombinasi Cisplatin Ekstrak A. suberitoides ¼ IC 50 - ¼ 7,55 21,13 25,13 17,65 IC 50
Mekanisme ekstrak A. suberitoides dalam menghambat siklus sel HeLa A. suberitoides : ircinin - alkaloid - terpenoid induksi p21 dan p27 kadar siklin D menurun CDK4 dan CDK6 tidak diaktivasi Rb tidak terfosforilasi G1 arrest
Mekanisme perlakuan kombinasi S arrest dan peningkatan jumlah sel pada fase G2/M penahanan fase S : cisplatin : menghambat sintesis DNA ekstrak : senyawa histatin peningkatan fase G2/M : senyawa hymenialdisine : menghambat CHK1
KESIMPULAN Ekstrak A. suberitoides 38,25 µg/ml menyebabkan terjadinya apoptosis sebesar 10% dan akumulasi sel terbesar pada fase G1 yaitu sebesar 50,22%, ekstrak A. suberitoides 15,3 µg/ml menyebabkan terjadinya apoptosis sebesar 7,45% dan akumulasi sel terbesar juga pada fase G1 sebesar 48,50%.
Saran Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut menggunakan ekstrak Aaptos suberitoides dengan konsentrasi yang lebih tinggi agar pengaruh ekstrak terhadap siklus sel HeLa dapat terlihat dengan lebih jelas. Ekstrak spons A. suberitoides yang digunakan untuk penelitian perlu dimurnikan terlebih dahulu menjadi bentuk senyawa murni sehingga memiliki aktivitas biologi yang lebih tinggi.