PROGRAM STUDI SARJANA FARMASI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SUMATERA UTARA MEDAN 2014

OPTIMASI DAN VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT) PADA PENETAPAN KADAR SIKLAMAT DALAM MINUMAN RINGAN SKRIPSI OLEH: BINTANG DWIPUTRA NIM 091501050 PROGRAM STUDI SARJANA FARMASI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SUMATERA UTARA MEDAN 2014

OPTIMASI DAN VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT) PADA PENETAPAN KADAR SIKLAMAT DALAM MINUMAN RINGAN SKRIPSI Diajukan untuk melengkapi salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada Fakultas Farmasi OLEH: BINTANG DWIPUTRA NIM 091501050 PROGRAM STUDI SARJANA FARMASI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SUMATERA UTARA MEDAN 2014

PENGESAHAN SKRIPSI OPTIMASI DAN VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT) PADA PENETAPAN KADAR SIKLAMAT DALAM MINUMAN RINGAN OLEH: BINTANG DWIPUTRA 091501050 Dipertahankan di Hadapan Panitia Penguji Skripsi Fakultas Farmasi Pada Tanggal: 16 Agustus 2014 Pembimbing I, Panitia Penguji, Drs. Fathur Rahman Harun, M.Si., Apt Prof. Dr. Siti Morin Sinaga, M.Sc., Apt. NIP 195201041980031002 NIP 195008281976032002 Pembimbing II, Drs. Fathur Rahman Harun, M.Si., Apt. NIP 195201041980031002 Prof. Dr.rer.nat. E. De Lux Putra, SU., Apt. Drs. Nahitma Ginting, M.Si., Apt NIP 195306191983031001 NIP 195406281983031002 Dra. Sudarmi, M. Si., Apt. NIP 195409101983032001 Medan, September 2014 Fakultas Farmasi Dekan, Prof. Dr. Sumadio Hadisahputra, Apt. NIP 19531128198303100

KATA PENGANTAR Alhamdulillah, segala Puji dan syukur kehadirat Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat, hidayah, dan kemudahan kepada penulis sehingga dapat menyelesaikan penelitian dan penyusunan skripsi dengan judul Optimasi dan Validasi Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) pada Penetapan Kadar Siklamat dalam Minuman Ringan. Skripsi ini diajukan sebagai salah satu syarat guna memperoleh gelar Sarjana Farmasi dari Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara. Pada kesempatan ini penulis menyampaikan ucapan terimakasih yang sebesar-besarnya kepada Bapak Prof. Dr. Sumadio Hadisahputra, Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi yang telah memberikan fasilitas selama masa pendidikan. Bapak Drs. Fathur Rahman Harun, M.Si., Apt., dan Bapak Prof. Dr. rer. nat. Effendy De Lux Putra, S.U., Apt., yang membimbing penulis dengan penuh kesabaran dan tanggung jawab selama penelitian hingga selesainya penyusunan skripsi ini. Bapak dan Ibu staf pengajar Fakultas Farmasi yang telah mendidik selama perkuliahan. Bapak Koordinator Laboratorium Penelitian yang telah memberikan fasilitas, petunjuk dan membantu selama penelitian. Ibu Prof. Dr. Siti Morin Sinaga, M.Sc., Apt., Bapak Drs. Nahitma Ginting, M.Si., Apt., dan Ibu Dra. Sudarmi, M.Si., Apt., selaku dosen penguji yang memberikan masukan, kritik, arahan dan saran dalam penyusunan skripsi ini dan Ibu Sumaiyah, S.Si., M.Si., Apt., selaku dosen penasehat akademik yang telah banyak membimbing penulis selama masa perkuliahan hingga selesai.

Penulis juga mengucapkan terima kasih dan penghargaan yang tiada terhingga kepada Ayahanda Kamaluddin, dan Ibunda Ns. Chuchum Sumiarty, S.Kep. CVRN tercinta, atas doa dan pengorbanannya dengan tulus dan ikhlas, juga kepada Kakanda Surya Gemilang, dan Adinda Sukma Juwita, serta temanteman mahasiswa Farmasi Angkatan 2009 yang selalu setia memberi doa, dorongan dan motivasi kepada penulis selama menempuh pendidikan S-1 Farmasi. Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih banyak kekurangannya, oleh karena itu sangat diharapkan kritik dan saran yang bersifat membangun dari semua pihak guna perbaikan skripsi ini. Akhir kata penulis berharap semoga skripsi ini bermanfaat bagi ilmu pengetahuan khususnya bidang farmasi.. Medan, Agustus 2014 Penulis, Bintang Dwiputra

OPTIMASI DAN VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT) PADA PENETAPAN KADAR SIKLAMAT DALAM MINUMAN RINGAN Abstrak Penggunaan bahan tambahan pangan dewasa ini sangat beragam, dari pengawet sampai pemberi aroma dan pemanis. Pemanis buatan yang termasuk dalam bahan tambahan pangan adalah pemanis pengganti gula (sukrosa), yang salah satunya adalah siklamat. Penggunaan siklamat dibatasi oleh BPOM karena memiliki efek samping, yaitu dapat menyebabkan kanker prostat. Metode penetapan kadar siklamat telah ditetapkan oleh BPOM untuk sediaan sirup, tetapi keberhasilan suatu metode tergantung daripada matriks sampel sehingga metode analisa siklamat dalam sirup belum tentu dapat digunakan untuk sediaan lain. Tujuan penelitian ini adalah untuk melakukan optimasi dan validasi metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) pada penetapan kadar natrium siklamat dalam minuman ringan dan untuk mengetahui kesesuaian kadar natrium siklamat dalam minuman ringan yang beredar di pasaran yang ditetapkan secara KCKT dengan ketentuan yang ditetapkan BPOM. Penelitian ini dilakukan dengan menggunakan alat KCKT Agilent dengan kolom Agilent C 18 (150 x 4,6 mm). Jenis sediaan minuman ringan yang digunakan adalah Teajus, Sisri, X-Teh, Nutrijeruk, Vitacool, and Segar Sari yang beredar di pasaran. Optimasi yang dilakukan pada penetapan kadar secara KCKT antara lain ph dapar fosfat dan komposisi fase gerak dapar fosfat dan methanol yang dideteksi dengan detektor UV-Vis pada panjang gelombang 201 nm. Hasil penelitian menunjukkan bahwa komposisi fase gerak dapar fosfat ph 7,0 : methanol dengan perbandingan 70:30 menghasilkan kondisi kromatografi yang optimal dalam penetapan kadar Na siklamat dalam minuman ringan secara KCKT. Metode ini memberikan hasil akurasi dan presisi yang baik dengan % recovery = 101,98%, relatif standar deviasi (RSD) = 0,15%; batas deteksi (LOD) = 9,37 ppm dan batas kuantitasi (LOQ) = 31,25 ppm. Dari enam minuman ringan yang dianalisis, tiga di antaranya, yaitu Nutrijeruk, Vitacool, dan Segar Sari dapat ditentukan kadarnya secara KCKT, dimana kadar Nutrijeruk dan Vitacool yang diperoleh melebihi batas yang ditentukan oleh BPOM sementara Segar Sari memenuhi persyaratan yaitu mengandung Na Siklamat tidak lebih dari 1000 ppm. Sedangkan untuk jenis minuman Teajus, Sisri, dan X-Teh tidak dapat dianalisis dengan kondisi kromatografi yang dilakukan. Kata kunci: KCKT, optimasi, validasi, Na Siklamat, minuman ringan

OPTIMIZATION AND VALIDATION OF HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY METHOD FOR CYCLAMATE DETERMINATION IN SOFT DRINKS Abstract The use of food additives nowadays is varied, from preservatives to aromatics and sweeteners. Artificial sweetener included in food additives is a sweetener used to replace sugar (sucrose), such as cyclamate. The usage of cyclamate is limited by BPOM because of the adverse effect of cyclamate that may cause prostate cancer. BPOM made a method to determine cyclamate amount in syrup. However, a success of a method depends on the matrix of the sample used, therefore, the method used for syrup may not be able to be used for soft drinks. The purposes of this study were to optimize and validate the HPLC method for determination of cyclamate in soft drinks and to determine whether the concentration of cyclamate in soft drinks distributed in the markets is suitable according to the BPOM regulations. This study was done with Agilent HPLC with Agilent C 18 column (150 x 4,6 mm). The soft drinks used in this study were Teajus, Sisri, X-Teh, Nutrijeruk, Vitacool, and Segar Sari distributed in the market. The optimations of the HPLC method in determining the concentration of Na Cyclamate were phosphate buffer s ph and mobile phase composition of phosphate buffer and methanol detected with UV-Vis detector at 201 nm. The research showed that phosphate buffer ph 7.0 : methanol as mobile phase was the optimal chromatography condition in determining Na cylamate in soft drinks using High performance Liquid Chromatography. This method gave good accuration and precision with % recovery = 101.98%, relative standard deviation (RSD) = 0.15%; limit of detection (LOD) = 9.37 ppm and limit of quantitation (LOQ) = 31.25 ppm. There were six soft drink samples analyzed, three samples -Nutrijeruk, Vitacool, and Segar Sari- could be determined using HPLC where the concentrations of cyclamate in Nutrijeruk and Vitacool were higher than the concentration allowed by BPOM while Segar Sari was acceptable according to the BPOM regulations (not more than 1000 ppm) and the samples Teajus, Sisri, and X-Teh could not be determined using the chromatography condition used. Keyword: HPLC,optimization, validation, cyclamate, soft drinks

DAFTAR ISI Halaman JUDUL... HALAMAN JUDUL... PENGESAHAN SKRIPSI... KATA PENGANTAR... ABSTRAK... ABSTRACT... DAFTAR ISI... DAFTAR TABEL... DAFTAR GAMBAR... DAFTAR LAMPIRAN... i ii iii iv vi vii viii xii xiii xiv BAB I PENDAHULUAN...... 1 1.1 Latar Belakang... 1 1.2 Perumusan Masalah... 3 1.3 Hipotesis... 3 1.4 Tujuan Penelitian... 4 1.5 Manfaat Penelitian... 4 1.6 Kerangka Pikir Penelitian... 4 BAB II TINJAUAN PUSTAKA... 6 2.1 Natrium Siklamat... 6 2.1.1 Sifat Fisikokimia... 6 2.1.2 Penggunaan... 6 2.1.3 Efek Samping... 6

2.2 Minuman Ringan... 7 2.3 Kromatografi... 7 2.3.1 Penggunaan Kromatografi... 7 2.3.2 Puncak Asimetris... 8 2.4 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)... 8 2.4.1 Cara Kerja KCKT... 9 2.4.2 Komponen KCKT... 10 2.4.3 Wadah Fase Gerak... 10 2.4.4 Pompa... 10 2.4.5 Injektor... 11 2.4.6 Kolom... 11 2.4.7 Detektor... 12 2.4.8 Pengolahan Data... 12 2.4.9 Fase Gerak... 13 2.4.10Dapar... 14 2.4.11Jenis Pemisahan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi... 14 2.5 Validasi Metode... 15 2.5.1 Akurasi (Kecermatan)... 15 2.5.2 Presisi (Keseksamaan)... 15 2.5.3 Spesifitas (Selektifitas)... 15 2.5.4 Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi... 15 2.5.5 Linearitas... 16 2.5.6 Rentang (Kisaran)... 16 2.5.7 Kekuatan (Ketahanan)... 16

2.5.8 Kekasaran (Ketangguhan)... 16 BAB III METODE PENELITIAN... 17 3.1 Tempat dan Waktu Penelitian... 17 3.2 Alat dan Bahan... 17 3.2.1 Alat...... 17 3.2.2 Bahan...... 17 3.3 Pengambilan Sampel... 18 3.4 Prosedur Kerja... 18 3.4.1 Pembuatan fase gerak... 18 3.4.2 Pembuatan pelarut... 18 3.4.3 Prosedur analisis menggunakan KCKT... 18 3.4.3.1 Penyiapan kromatografi cair kinerja tinggi... 18 3.4.3.2 Penentuan perbandingan fase gerak yang optimum..... 18 3.4.4 Analisis kualitatif... 19 3.4.4.1 Uji identifikasi Na Siklamat... 19 3.4.5 Analisis kuantitatif... 19 3.4.5.1 Pembuatan larutan induk baku Na Siklamat BPFI... 19 3.4.5.2 Pembuatan kurva kalibrasi Na Siklamat BPFI 19 3.4.5.3 Penetapan kadar sampel... 20 3.4.5.4 Analisis data penetapan kadar secara statistik.. 20 3.4.6 Validasi metode... 21 3.4.6.1 Akurasi (kecermatan)... 21

3.4.6.2 Presisi (keseksamaan)... 22 3.4.6.3 Batas deteksi (LOD) dan batas kuantitasi (LOQ) 22 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN... 24 4.1 Penentuan ph dapar fosfat... 24 4.2 Penentuan Komposisi Fase Gerak... 25 4.3 Analisis Kualitatif... 26 4.4 Analisis Kuantitatif... 27 4.4.1 Penentuan kurva kalibrasi... 27 4.4.2 Penetapan kadar analit dalam sampel yang dianalisis. 28 4.5 Hasil Uji Validasi... 29 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN... 31 5.1 Kesimpulan... 31 5.2 Saran... 31 DAFTAR PUSTAKA... 32 LAMPIRAN... 34

DAFTAR TABEL Halaman Tabel 4.1 Pengaruh ph dapar fosfat terhadap parameter kromatogram... 24 Tabel 4.2 Pengaruh komposisi fase gerak terhadap parameter kromatogram... 25 Tabel 4.3 Hasil penetapan kadar Na Siklamat dalam minuman ringan... 28 Tabel 4.4 Hasil Pengujian Validasi, dengan parameter akurasi, presisi, batas deteksi (LOD), batas kuantitasi (LOQ) Na Siklamat Vitacool dengan menggunakan metode adisi standar... 30

DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 1.1 Kerangka Pikir Penelitian... 5 Gambar 4.1 Kromatogram Na Siklamat secara KCKT menggunakan kolom Agilent Eclipse XDB (150 x 4,6 mm) dengan perbandingan fase gerak dapar fosfat : methanol (70 : 30) dan laju alir 1 ml/menit, volume penyuntikan 20 µl dan deteksi pada panjang gelombang 201 nm... 26 Gambar 4.2 Kromatogram hasil spike secara KCKT menggunakan kolom Agilent Eclipse XDB (150 x 4,6 mm) dengan perbandingan fase gerak dapar fosfat : methanol (70 : 30) dan laju alir 1 ml/menit, volume penyuntikan 20 µl dan deteksi pada panjang gelombang 201 nm... 27 Gambar 4.3 Kurva kalibrasi Na Siklamat BPFI secara KCKT menggunakan kolom Agilent Eclipse XDB (150 x 4,6 mm) dengan perbandingan fase gerak dapar fosfat:methanol (70:30) dan laju alir 1 ml/menit, volume penyuntikan 20 µl dan deteksi pada panjang gelombang 201 nm... 28

DAFTAR LAMPIRAN Halaman Lampiran 1 Kromatogram penyuntikan larutan Na Siklamat untuk mencari ph dapar fosfat yang optimum pada analisis...... 34 Lampiran 2 Kromatogram penyuntikan larutan Na Siklamat untuk mencari komposisi fase gerak dapar fosfat : methanol yang optimum pada analisis... 37 Lampiran 3 Lampiran 4 Lampiran 5 Lampiran 6 Lampiran 7 Lampiran 8 Kromatogram larutan Na Siklamat BPFI pada pembuatan kurva kalibrasi... 47 Perhitungan persamaan regresi dari kurva kalibrasi Na Siklamat BPFI yang diperoleh secara KCKT pada panjang gelombang 201 nm... 50 Perhitungan recovery dengan metode adisi standar...... 52 Kromatogram hasil recovery dari sampel Vitacool...... 53 Hasil pengujian validasi, dengan parameter akurasi, presisi, batas deteksi (LOD), batas kuantitasi (LOQ) Na Siklamat pada tablet Vitacool dengan menggunakan metode adisi standar..... 59 Contoh perhitungan % recovery dengan metode adisi standar... 60 Lampiran 9 Perhitungan batas deteksi (LOD) dan batas kuantitasi (LOQ)... 61 Lampiran 10 Kromatogram dari Nutrijeruk... 62 Lampiran 11 Lampiran 12 Lampiran 13 Contoh perhitungan untuk mencari kadar Na siklamat dalam sampel... 65 Analisis data statistik untuk mencari kadar sebenarnya dari penyuntikkan larutan nutrijeruk... 66 Tabel hasil analisa kadar Na siklamat dalam Nutrijeruk...... 69 Lampiran 14 Kromatogram dari larutan Vitacool... 70

Lampiran 15 Analisis data statistik untuk mencari kadar sebenarnya dari penyuntikkan larutan Vitacool... 73 Lampiran 16 Tabel hasil analisa kadar Na siklamat dalam Vitacool. 75 Lampiran 17 Kromatogram dari larutan Segar Sari... 76 Lampiran 18 Lampiran 19 Analisis data statistik untuk mencari kadar sebenarnya dari penyuntikkan larutan Segar Sari... 79 Tabel hasil analisa kadar Na siklamat dalam Segar Sari...... 81 Lampiran 20 Daftar Spesifikasi Sampel... 82 Lampiran 21 Tabel Nilai Distribusi t... 84 Lampiran 22 Sertifikat Na Siklamat BPFI... 85 Lampiran 23 Gambar alat alat yang digunakan... 86