40 HASIL DAN PEMBAHASAN Kandungan Senyawa Isoflavon Tepung Kedelai dan Tepung Tempe Hasil analisis tepung kedelai dan tepung tempe menunjukkan 3 macam senyawa isoflavon utama seperti yang tertera pada tabel 6. Total senyawa isoflavon merupakan penjumlahan kandungan isoflavon daidzein, glisitein dan genistein. Kromatogram HPLC isoflavon tepung kedelai dan tepung tempe dapat dilihat pada lampiran 5, 6, dan 7. Sedangkan contoh perhitungan kandungan senyawa isoflavon pada lampiran 8. Tabel 6. Hasil analisis kuantitatif senyawa isoflavon tepung kedelai dan tepung tempe dalam kg bahan. Tepung kedelai Tepung tempe Komponen (mg/kg bk) (mg/kg bk) Daidzein 113.63 555.55 Glisitein 27.59 95.04 Genistein 65.15 250.65 Total isoflavon 206.37 901.24 Keterangan: bk = berat kering Hasil analisis kromatrogram menunjukkan bahwa senyawa isoflavon yang paling dominan baik pada tepung kedelai dan tepung tempe adalah daidzein dan genistein. Menurut Zhang et al. (1999) genistein memiliki efek estrogenik 100% lebih besar dibandingkan dengan daidzein. Pada penelitian ini digunakan 10 kg kedelai, setelah diolah menjadi tepung menghasilkan 8.33 kg tepung kedelai. Sedangkan 20 kg kedelai yang diolah menjadi tempe menghasilkan 34.60 kg tempe. Selanjutnya 34.60 kg tempe diolah menjadi tepung menghasilkan 9.68 kg tepung tempe. Hal ini berarti bahwa 20 kg kedelai setara dengan 9.68 kg tepung tempe. Isoflavon dalam tepung tempe lebih banyak dari pada tepung kedelai, karena proses pembuatan tepung tempe membutuhkan lebih banyak kedelai. Semakin banyak kedelai maka semakin banyak kandungan isoflavonnya, hal ini dapat dilihat pada tabel 6. Kandungan total senyawa isoflavon tepung kedelai sebesar 206.37 mg/kg bk (20.637 mg/100g bk), sedangkan tepung tempe sebesar 901.24 mg/kg bk
41 (90.124 mg/100 g bk). Pada penelitian ini, pemberian tepung kedelai maupun tepung tempe sebanyak 10 g/ 100 g berat badan/ hari. 10 gram tepung kedelai mengandung 2.0637 mg isoflavon, sedangkan 10 gram tepung tempe mengandung 9.0124 mg isoflavon. Hal ini berarti bahwa isoflavon yang terkandung dalam tepung tempe lebih banyak dari pada tepung kedelai. Tepung tempe dan tepung kedelai mengandung genistein, sejenis asam amino isoflavon yang berfungsi sebagai fitoestrogen. Kandungan genistein dalam tepung tempe 250.65 mg/kg bk, lebih banyak dibandingkan tepung kedelai 65.15 mg/kg bk, sehingga tepung tempe lebih baik dari pada tepung kedelai. Menurut Cahyadi (2007) jika seluruh reseptor diblokir oleh genistein, maka estrogen endogen tidak berpeluang menempel pada reseptor. Kemiripan struktur genistein isoflavon dengan estrogen endogen, menunjukkan kemampuannya untuk berikatan dengan reseptor estrogen (Setchell dan Cassidy 1999). Menurut Winarsi (2005) besarnya kandungan isoflavon dalam kedelai sangat tergantung dari jenis, letak geografis, budi daya, umur panen serta proses pengolahannya. Menurut Qiju (2003) isoflavon sebagai antioksidan sangat berperan melawan adanya radikal bebas (free radical scavenger) yang secara langsung mencegah terhadap pembentukan kanker, mengatur fungsi biologis hormon reproduksi, serta proliferasi dan diffrensiasi sel. Sejumlah isoflavon terutama ditemukan dalam urine, feses, serum dan plasma (Adlercreutz 1995). Siklus Estrus dan Kadar Hormon Estrogen Tikus non ovariektomi Hasil penelitian terhadap panjang siklus estrus dan rataan kadar hormon estrogen tikus non ovariektomi pada semua perlakuan terlihat pada tabel 7. Hasil penelitian menunjukkan bahwa panjang siklus estrus tikus non ovariektomi yang diberi tepung tempe lebih lama bila dibandingkan dengan tikus non ovariektomi yang diberi pelet, sedangkan panjang siklus estrus tikus non ovariektomi yang diberi tepung kedelai lebih pendek bila dibandingkan dengan tikus non ovariektomi yang diberi pelet.
42 Tabel 7. Pengaruh pemberian tepung kedelai dan tepung tempe pada panjang siklus estrus dan kadar rataan estradiol tikus non ovariektomi. Kelompok Perlakuan Jenis Pengamatan Non Ov K Non Ov Kd Non Ov T PSSE (jam) 108 96 180 RE ± SE (pg/ml) 21.58 ± 0.438 ab 18.294 ± 2.192 b 25.621 ± 1.822 a Keterangan : PSSE = PanjangAsatuAsiklusAestrus; RE = Rataan estradiol; SE = Standar error. Angka-angka yang diikuti oleh huruf yang berbeda pada baris yang sama menunjukkan berbeda nyata ( p<0.05). Lebih lanjut, hasil penelitian menunjukkan bahwa fase proestrus dan estrus pada tikus non ovariektomi yang diberi tepung kedelai dan tepung tempe lebih panjang dibandingkan tikus non ovariektomi kontrol (gambar 6). Panjang waktu fase metestrus pada tikus non ovariektomi yang diberi tepung kedelai sama dengan tikus non ovariektomi kontrol, sedangkan panjang waktu fase metestrus pada tikus non ovariektomi yang diberi tepung tempe lebih lama dibandingkan dengan tikus non ovariektomi kontrol, hal ini diduga penurunan kadar estrogen pada fase metestrus berlangsung lebih lama untuk menuju ke fase berikutnya. Panjang waktu fase diestrus pada tikus non ovariektomi yang diberi tepung kedelai dan tikus non ovariektomi yang diberi tepung tempe lebih pendek dari pada tikus non ovariektomi kontrol, hal ini disebabkan kadar estrogen pada level rendah hanya sebentar kemudian sel akan segera berproliferasi kembali. Perpendekan fase diestrus pada tikus non ovariektomi menguntungkan karena pada fase ini bukan fase yang potensial dalam fertilitas. Lama setiap fase (jam) 70 60 50 40 30 20 10 0 60 48 48 48 36 24 24 24 24 24 12 12 Proestrus Estrus Metestrus Diestrus Non-Ov K Non-Ov Kd Non-Ov T Gambar 6. Diagram rataan panjang setiap fase siklus estrus (jam) tikus non ovariektomi.
43 Isoflavon yang terdapat dalam tepung tempe dan tepung kedelai mempunyai efek pada epitel vagina yaitu terjadinya proliferasi dan kornifikasi sel epitel vagina. Hal ini nyata terlihat dengan adanya perpanjangan fase proestrus dan fase estrus, dimana fase proestrus menyebabkan proliferasi sel epitel vagina dan fase estrus menyebabkan kornifikasi sel epitel vagina. Tikus non ovariektomi yang diberi tepung tempe mengalami perpanjangan siklus estrus yaitu perpanjangan pada fase proestrus dan fase estrus. Hal ini berpotensi dalam fertilitas karena memiliki waktu kawin yang panjang dan probabilitas kawin yang tinggi. Menurut Tou et al. (2003) perpanjangan siklus estrus pada tikus mempunyai implikasi yang penting pada reproduksi karena dapat mengurangi jumlah kumulatif siklus dan berpotensi dalam hal fertilitas. Hasil uji ANOVA menunjukkan bahwa kadar harmon estrogen tikus non ovariektomi dipengaruhi oleh perlakuan (P < 0.05) (Tabel 7 dan Lampiran 16). Uji lanjut Duncan menunjukkan bahwa rataan kadar hormon estrogen pada tikus non ovariektomi yang diberi tepung tempe dan yang diberi tepung kedelai sama dengan tikus non ovariektomi kontrol, namun rataan kadar hormon estrogen pada tikus non ovariektomi yang diberi tepung tempe lebih tinggi bila dibandingkan tikus non ovariektomi yang diberi tepung kedelai. Hal ini berarti bahwa isoflavon yang terdapat pada tepung tempe dan tepung kedelai dapat mengoptimalkan kadar hormon estrogen sehingga keseimbangan hormonal dapat tercapai. Hal ini sesuai dengan penelitian Persky et al. (2002) yang mengungkapkan bahwa isoflavon dapat bertindak sebagai estrogen antagonis pada saat estrogen endogen dalam konsentrasi tinggi, dan bertindak sebagai estrogen agonis pada saat hormon estrogen endogen dalam konsentrasi rendah. Menurut Hafez (1987) estrogen mempunyai aksi umpan balik positif dan negatif. Aksi umpan balik positif seiring dengan stimulasi sekresi dari hormon hypophysa atau hypothalamus dibawah pengaruh hormon spesifik atau stimulus lainnya, sedangkan aksi umpan balik negatif berarti menghambat aksi dari substansi spesifik hasil sekresi hormon hypophysa atau hypothalamus. Secara fisiologis efek isoflavon seperti estrogen yaitu tergantung pada respon yang terjadi, dapat bersifat agonis (menstimulir) atau antagonis (menghambat) terhadap reseptor dalam sel targetnya (Ruggiero et al. 2002).
44 Seperti yang dilaporkan Kuiper et al. (1996) bahwa didalam tubuh terdapat dua macam reseptor, yaitu reseptor estrogen beta dan reseptor estrogen alfa. Menurut Paech et al. (1997) dua reseptor estrogen memainkan peran yang berbeda, demikian pula terdistribusi dalam jaringan dan afinitas binding dengan ligand yang berbeda. Reseptor estrogen beta terdistribusi dalam jaringan otak, tulang, kandung kemih dan epitel pembuluh darah. Selanjutnya menurut (warner et al. 1999) reseptor alfa terdistribusi dalam jaringan uterus, payudara, liver dan ginjal. Kadar hormon estrogen yang berada pada level normal ambang tinggi pada tikus non ovariektomi yang diberi tepung tempe menyebabkan tikus dapat mempertahankan fase estrus, oleh karena itu fase estrusnya menjadi lebih panjang. Kadar hormon estrogen yang berada pada level normal ambang rendah pada tikus non ovariektomi yang diberi tepung kedelai juga menyebabkan perpanjangan fase estrus, namun panjang fase estrus tikus non ovariektomi yang diberi tepung tempe lebih panjang dibandingkan dengan tikus non ovariektomi yang diberi tepung kedelai. Hal ini dikarenakan jumlah isoflavon yang terdapat dalam tepung tempe lebih banyak dari pada tepung kedelai. Siklus Estrus dan Kadar Hormon Estrogen Tikus Ovariektomi Hasil penelitian terhadap panjang siklus estrus dan rataan kadar hormon estrogen tikus ovariektomi pada semua perlakuan terlihat pada tabel 8. Hasil penelitian menunjukkan bahwa panjang siklus estrus tikus non ovariektomi yang diberi tepung tempe lebih lama bila dibandingkan dengan tikus ovariektomi kontrol, sedangkan panjang siklus estrus tikus ovariektomi yang diberi tepung kedelai sama dengan tikus ovariektomi kontrol. Tabel 8. Pengaruh pemberian tepung kedelai dan tepung tempe pada panjang siklus estrus dan kadar rataan estradiol tikus ovariektomi. Kelompok Perlakuan Jenis Pengamatan Ov K Ov Kd Ov T PSSE (jam) 72 72 108 RE ± SE (pg/ml) 13.478 ± 0.659 b 14.791 ± 0.127 ab 16.288 ± 1.127 a Keterangan : PSSE = PanjangAsatuAsiklusAestrus; RE = Rataan estradiol; SE = Standar error. Angka-angka yang diikuti oleh huruf yang berbeda pada baris yang sama menunjukkan berbeda nyata ( p<0.01).
45 Lebih lanjut, hasil penelitian menunjukkan bahwa panjang waktu fase proestrus pada tikus ovariektomi yang diberi tepung kedelai sama dengan tikus ovariektomi kontrol, sedangkan panjang fase proestrus pada tikus ovariektomi yang diberi tepung tempe lebih lama dibandingkan dengan tikus ovariektomi kontrol (gambar 7). Lama setiap fase (jam) 70 60 50 40 30 20 10 0 24 12 12 12 0 60 36 24 24 24 12 12 Proestrus Estrus Metestrus Diestrus Ov K Ov Kd Ov T Gambar 7. Diagram rataan panjang setiap fase siklus estrus tikus ovariektomi (jam). Pada tikus ovariektomi yang diberi tepung tempe terjadi perpanjangan fase proestrus, hal ini diduga pada fase proestrus kadar hormon estrogen meningkat dalam waktu yang lama sehingga proliferasi sel menjadi lebih banyak. Panjang fase estrus pada tikus ovariektomi yang diberi tepung tempe sama dengan tikus ovariektomi yang diberi tepung kedelai, sedangkan pada tikus ovariektomi kontrol tidak terjadi fase estrus karena kadar estrogennya sangat rendah. Panjang fase metestrus pada tikus ovariektomi yang diberi tepung kedelai sama dengan tikus ovariektomi kontrol, sedangkan panjang fase metestrus pada tikus ovariektomi yang diberi tepung tempe lebih pendek dari pada tikus ovariektomi kontrol. Hal ini diduga pada saat metestrus kadar estrogennya sangat cepat menurun. Waktu fase diestrus pada tikus ovariektomi yang diberi tepung tempe lebih panjang dari pada tikus ovariektomi kontrol dan tikus ovariektomi yang diberi tepung kedelai. Hal ini disebabkan pada fase diestrus kadar estrogennya berada pada level rendah lebih lama untuk menuju ke fase berikutnya. Perpanjangan fase diestrus
46 menguntungkan pada tikus ovariektomi karena fase ini merupakan fase istirahat dan bukan fase yang potensial dalam fertilitas. Ovariektomi yang dilakukan pada penelitian ini merupakan model tikus pascamenopouse. Ovariektomi menyebabkan hilangnya ovarium dan estrogennya rendah sehingga proliferasi dan kornifikasi sel-sel epitel vagina terganggu dan menyebabkan tidak terjadinya fase estrus pada tikus ovariektomi yang diberi pelet (kontrol). Isoflavon yang terdapat pada tepung tempe dan tepung kedelai dapat meningkatkan estrogen, hal ini terbukti bahwa tikus ovariektomi yang diberi tepung kedelai dan tikus ovariektomi yang diberi tepung tempe masih terjadi siklus estrus, namun jumlah isoflavon yang terdapat dalam tepung tempe lebih banyak sehingga efektif dalam menggertak terjadinya siklus estrus. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pada tikus ovariektomi yang diberi tepung kedelai dan tepung tempe terjadi perubahan pada epitel vagina yaitu proliferasi dan kornifikasi sel epitel vagina. Hal ini diduga dapat menurunkan tingkat kekeringan vagina. Seperti yang dikemukakan oleh Winarsi (2005) bahwa manfaat isoflavon kedelai dapat meningkatkan kekebalan tubuh, menurunkan tingkat kekeringan vagina, menurunkan keluhan menopause, memperbaiki memori (ingatan), menurunkan kelelahan dan mencegah kanker. Hasil uji ANOVA menunjukkan bahwa kadar harmon estrogen tikus ovariektomi dipengaruhi oleh perlakuan (P < 0.05) (Tabel 8 dan Lampiran 17). Uji lanjut Duncan menunjukkan bahwa kadar hormon estrogen pada tikus ovariektomi yang diberi tepung tempe sama dengan tikus ovariektomi yang diberi tepung kadelai, namun lebih tinggi bila dibandingkan dengan tikus ovariektomi kontrol. Kadar hormon estrogen tikus ovariektomi kontrol sangat rendah karena kekurangan estrogen endogen sehingga tidak terjadi fase estrus, karena fase estrus memerlukan kadar estrogen yang optimal. Kadar hormon estrogen pada tikus ovariektomi yang diberi tepung tempe dan yang diberi tepung kedelai berpengaruh terhadap siklus estrus, dimana panjang fase estrusnya sama dengan tikus non ovariektomi yang diberi pelet. Pemberian tepung tempe dan tepung kedelai pada tikus ovariektomi dapat mengoptimalkan hormon estrogen dalam memunculkan fase estrus.
47 Penurunan kadar estrogen pada tikus ovariektomi dapat diatasi dengan pemberian pakan berupa tepung tempe dan tepung kedelai yang mengandung isoflavon. Isoflavon yang terkandung dalam tepung tempe dan tepung kedelai mempunyai aktivitas estrogen yang dapat menyebabkan produksi estrogen meningkat dan menstimulir inisiasi proliferasi dan kornifikasi sel epitel vagina. Konsumsi tepung tempe dan tepung kedelai dapat memperbaiki hormon estrogen pada tikus ovariektomi. Jika kekurangan estrogen endogen maka dapat mengkonsumsi tepung tempe dan tepung kedelai sebagai terapi estrogen alami yang relatif aman. Pada saat memasuki menopause tingkat estrogen menurun namun tidak seluruhnya menghilang, estrogen dihasilkan tidak berasal dari ovarium, namun dihasilkan dari kelenjar adrenal, lemak, kulit, otot, dan liver (Sibuea et al. 1996). Menurut Pomfrey (2004) penurunan kadar hormon estrogen pada wanita menopouse, mengakibatkan banyaknya kelebihan reseptor estrogen yang tidak terikat. Menurut Setchell (1998) kemampuan isoflavon berikatan dengan reseptor estrogen yang disebut Sex Hormone Binding Globulin (SHBG), berperan untuk meningkatkan produksi hormon steroid dan bertanggungjawab dalam pengikatan estrogen serta mengedarkannya melalui pembuluh darah. Selanjutnya Aldercreutz (2002) menyatakan genistein dapat meningkatkan sirkulasi tingkat estrogen dengan cara merangsang transkripsi SHBG. Menurut Hudson (2003) keterlibatan isoflavon meniru kerja estrogen tergantung pada beberapa faktor, yaitu jumlah reseptor yang dapat berikatan dengan isoflavon, letak reseptor, jenis reseptor dan konsentrasi estrogen yang mampu bersaing dengan isoflavon. Fungsi estrogen dalam tubuh bukan hanya untuk reproduksi, tetapi juga diperlukan untuk kesehatan terutama pada hewan menopause. Estrogen memiliki efek menurunkan kolesterol plasma secara bermakna, ikut berperan menurunkan kejadian infark miokardium dan menurunkan kejadian penyakit kardiovaskular setelah menopause (Ganong 2003). Menurut Wylie dan Rosett (2005) pemberian isoflavon dapat mengurangi keluhan menopause seperti hot flushes (rasa panas) dan vaginal dryness sebesar 30-50%. Menurut Vincent dan Fitzpatrick (2000) isoflavon dapat menurunkan kolesterol LDL (Low Density Lipoprotein) sebesar 30-40%, dan meningkatkan HDL (High Density Lipoprotein) sebesar 50%.
48 Isoflavon mampu berikatan dengan reseptor estrogen jaringan urogenital, yang selanjutnya memacu kerja estrogen sehingga tercapai kondisi restorasi estrogen endogen. Interaksi antara isoflavon dengan reseptor estrogen dalam saluran genitalia dapat menggantikan kerja estrogen pada saluran tersebut, sehingga simptom menopause menurun (Winarsi et al. 2004). Selanjutnya Biben (2001) menyatakan bahwa dengan tercapainya restorasi estrogen, maka kelembaban vagina dapat dipertahankan serta menghilangkan simptom dryness vaginal. Isoflavon bekerja dengan cara mengikat reseptor estrogen pada saluran genitalia dan menstimulir aktivitas estrogen endogen (Warner et al. 1999). Hubungan Panjang Siklus Estrus dengan Kadar Hormon Estrogen pada Tikus Berdasarkan uji korelasi menunjukkan bahwa terdapat hubungan antara kadar hormon estrogen terhadap panjang siklus estrus pada tikus non ovariektomi dan tikus ovariektomi (Lampiran 18). Hubungan antara kadar estrogen terhadap panjang siklus estrus berkorelasi positif dan signifikan, maka diharapkan semakin tinggi kadar hormon estrogen maka semakin panjang siklus estrus. Grafik hubungan rataan kadar hormon estrogen terhadap rataan panjang siklus estrus dapat dilihat pada gambar 8. 27.5 25.0 Rataan kadar estradiol (pg/ml) 22.5 20.0 17.5 15.0 60 80 100 120 140 Rataan panjang siklus estrus (jam) 160 180 Gambar 8. Grafik hubungan rataan kadar estrogen terhadap rataan panjang siklus estrus (y = 7.232 + 0.1048x)
49 Panjang siklus estrus pada tikus non ovariektomi berkaitan dengan kemampuan reproduksi, tetapi tergantung pada fasenya. Perpanjangan fase proestrus dan fase estrus menguntungkan pada tikus non ovariektomi karena fase ini merupakan fase yang potensial dalam hal fertilitas. Sedangkan pada tikus ovariektomi panjang siklus estrus berkaitan dengan kesehatan. Perpanjangan fase proestrus dan fase estrus menguntungkan pada tikus ovariektomi karena dapat mempertahankan kelembaban vagina sehingga mengatasi keluhan dryness vaginal.