BAB III METODOLOGI PENELITIAN A. Jenis Rancangan Penelitian Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah gabungan antara metode non eksperimental dan metode eksperimental. Metode non eksperimental yaitu melakukan determinasi tanaman serai dan cengkih, destilasi daun cengkih dan serai, identifikasi kandungan senyawa kimia dalam minyak atsiri serai dan cengkih dengan menggunakan GC-MS. Metode eksperimental yaitu melakukan uji potensi minyak atsiri serai dan cengkih sebagai pengawet daging ayam berdasarkan aktivitasnya sebagai menghambat pertumbuhan bakteri dengan menggunakan perbandingan konsentrasi minyak atsiri serai dan cengkih. B. Variabel Penelitian 1. Variabel bebas Variabel bebas dari penelitian ini adalah perbandingan konsentrasi minyak atsiri serai dan cengkih dan waktu penyimpanan daging ayam. 2. Variabel tergantung Variabel tergantung dari penelitian ini adalah absorbansi sampel yang dikultur pada media NB dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 600 nm, dan pengamatan organoleptis sampel daging ayam. 3. Variabel terkendali Variabel terkendali dari penelitian ini adalah proses pengerjaan aseptis, sterilisasi, media kultur, suhu penyimpanan, waktu destilasi, preparasi sampel. C. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilakukan selama 5 bulan. Proses pengerjaan determinasi tanaman cengkih dan serai dilakukan di Laboratorium Taksonomi Tumbuhan Fakultas Biologi Universitas Jendral Soedirman Purwokerto, destilasi minyak atsiri serai dan cengkih dilakukan di Laboratorium Water and Waste Water 20
Treatment Fakultas Teknik Kimia Universitas Muhammadiyah Purwokerto (UMP), identifikasi kandungan senyawa minyak atsiri serai dan cengkih dilakukan di Laboratorium Microinstrument Terpadu UMP, dan uji potensi minyak atsiri serai dan cengkih sebagai pengawet makanan dilakukan di Laboratorium Bioprocess Fakultas Teknik Kimia UMP. D. Alat dan Bahan 1. Alat Alat yang digunakan pada penelitian ini yaitu timbangan analitik (Shimadzu), dandang uap destilasi, mikropipet (Socorex), GCMS-QP2010 SE dengan SH-Rxi-5Sil MS (Shimadzu), LAF/Laminar Air Flow (Mascotte model LH-S), Spektrofotometer UV-Vis (Shimadzu UV-1240), ph meter, autoklaf, oven (Memmert) dan alat-alat gelas (Pyrex). 2. Bahan Bahan yang digunakan pada penelitian ini yaitu simplisia batang dan daun serai, simplisia daun cengkih, akuades, natrium sulfat anhidrat, n-heksan, daging ayam segar, formalin, dimetil solfoksida (DMSO), natrium benzoat, media Nutrient Broth (NB) dan alkohol. E. Cara Penelitian 1. Pengumpulan Tanaman Daun cengkih yang dipakai diambil dari daerah Pemalang, Jawa Tengah. Serai (aerial parts) yang digunakan diambil dari daerah Sokaraja, Banyumas, Jawa Tengah. 2. Determinasi Tanaman Determinasi tanaman dilakukan di Laboratorium Taksonomi Tumbuhan Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman Purwokerto mengunakan buku acuan Flora of Java Volume III (Backer dan Bakhuizen Van Den Brink, 1968). 3. Penyiapan Simplisia Sampel yang telah dikumpulkan, dilakukan pengeringan di bawah sinar matahari sampai menjadi simplisia kering. 21
4. Pengambilan Minyak Atsiri (Destilasi) Pengambilan minyak atsiri serai dan cengkih dilakukan dengan metode destilasi uap dan air. Simplisia serai dan cengkih masing-masing dimasukkan ke dalam dandang uap berbeda yang telah diisi dengan akuades. Proses destilasi berlangsung selama 5-6 jam. Minyak yang didapat yang masih tercampur dengan air dipisahkan dengan Na 2 SO 4 anhidrat sebanyak 10% dari cairan. Minyak yang telah dipisahkan, disaring dan disimpan dalam botol vial dalam lemari pendingin suhu rendah 5±2 o C dalam botol kaca dibungkus aluminium foil (Oliveira et al., 2013). 5. Identifikasi Kandungan Kimia Minyak Atsiri (GC-MS) Minyak atsiri dianalisis dengan menggunakan GCMS-QP2010 SE dengan SH-Rxi-5Sil MS, dilengkapi dengan kolom HP-5 5% fenilmetilsiloksan ukuran 30 m x 0,25 mmid x 0,25 µm df. Suhu oven diprogram dari suhu 50 o C selama 2 menit, lalu dinaikkan sampai 100 o C dengan laju 2 o C/menit, dan langsung dinaikkan lagi sampai 280 0 C dengan laju 5 o C/menit dan ditahan sampai 10 menit. Gas pembawa berupa gas helium dengan laju alir sebesar 1ml/menit. Rasio injeksinya yaitu 1:50 dan voltasi ionisasi yaitu 70 ev. Suhu injektor dan deterktor masing-masing 280 o C dan 230 o C. Volume minyak atsiri atau sampel yang diinjeksi sebanyak 1µL 10000 ppm dengan n-heksan sebagai pelarutnya. Waktu tunggu pembacaan pelarut selama 2 menit dan analisis satu sampel berlangsung selama 73 menit. Identifikasi konstituen dari spektrum massa dibandingkan dengan library Wiley 9.0 (Adam, 2001). 6. Uji Potensi minyak atsiri serai dan cengkih sebagai bahan pengawet daging ayam a. Pembuatan media NB Melarutkan 4 g NB dalam 500 ml akuades, diaduk dan dipanaskan di atas hot plate sampai homogen, lalu tutup rapat dengan aluminium foil. Kemudian dilakukan sterilisasi basah (Pratiwi, 2008). b. Sterilisasi alat 22
Alat yang digunakan disterilkan dengan metode sterilisasi kering menggunakan oven bersuhu 170 o C selama 1 jam (Pratiwi, 2008). Alat yang digunakan dicuci dan dibungkus rapat baru dimasukkan ke dalam oven. c. Sterilisasi bahan Bahan yang digunakan disterilkan dengan metode sterilisasi basah menggunakan autoklaf 121 0 C 1 atm selama 20 menit (Pratiwi, 2008). Bahan diletakkan dalam wadah yang sesuai dan ditutup rapat dengan aluminium foil, lalu di masukkan ke dalam autoklaf. d. Persiapan daging ayam Daging ayam segar diperoleh dari pasar Tambaksogra- Purwokerto, Jawa Tengah. Daging ayam segar dipotong dadu kecil (1cm x 1cm x 1cm), kemudian dicuci dengan akuades steril. e. Persiapan kelompok perlakuan Penelitian ini menggunakan 9 kelompok perlakuan. Masingmasing kelompok perlakuan disiapkan dalam volume 500 ml. Terdapat 3 kelompok yang menggunakan kombinasi minyak atsiri dengan perbandingan minyak atsiri serai dengan cengkih sebesar 0.2:2, 1:1, dan 2:0.2 %. Dan terdapat 2 kelompok perlakuan dengan minyak atsiri tunggal konsentrasi 1%. Sebagai kontrol positif digunakan formalin 10% dan Na benzoat 0.12%. Sebagai kontrol negatif yaitu DMSO dan air steril. Sejumlah volume minyak atsiri tertentu dipipet, ditambah DMSO dengan volume yang sama dan ditambahkan akuades steril sampai 500 ml. Formalin diambil 50 ml dan ditambahkan akuades steril sampai 500 ml. Na benzoat ditimbang 0.6 g dan dilarutkan dengan akuades steril sampai 500 ml. Diambil DMSO 5 ml dan ditambahkan dengan akuades steril sampai 500 ml. Air steril disiapkan dalam wadah sebanyak 500 ml (tabel 3.1). Perlakuan dilakukan secara aseptis. 23
Tabel 3.1. Jumlah pemipetan cairan kelompok perlakuan Pemipetan Bahan (ml) Kelompok Perlakuan Minyak Minyak Na Atsiri Atsiri Formalin Benzoat serai cengkih DMSO Kontrol negatif (aquades) - - - - - DMSO - - - - 5 Minyak serai 1% 5 - - - 5 Minyak cengkih 1% - 5 - - 5 Minyak serai cengkih 0,2:2 % 1 10 - - 11 Minyak serai cengkih 1:1 % 5 5 - - 10 Minyak serai cengkih 2:0.2 % 10 1 - - 11 Kontrol positif (formalin) - - 50 - - Na benzoat 0,12% - - - 0,6 - Aqua steril ad 500 Pengawetan daging ayam dengan cara memasukkan potongan daging ayam yang telah dicuci bersih ke dalam 9 kelompok perlakuan selama 1 menit dan dibantu dengan pengadukan. Setiap 6 potong daging ayam dipindahkan ke dalam gelas steril untuk dilakukan penyimpanan pada hari ke-0, 3, 6, 9, 12 dan 15. Semua disimpan di dalam lemari pendingin (2-7 0 C), kecuali untuk penyimpanan hari ke- 0. f. Pengamatan potensi minyak atsiri serai dan cengkih sebagai pengawet alami pada daging ayam Setiap waktu penyimpanan dilakukan pengamatan. Pengamatan tersebut ada 2 aspek, yaitu pengamatan secara organoleptis dan absorbansi bakteri pada media NB. 1) Organoleptis Pengamatan uji organoleptis pada sampel daging ayam yang telah diawetkan dengan kelompok perlakuan. Uji dilakukan dengan diambil sampel potongan daging ayam kemudian diamati keberadaan lendir, tekstur, bau dan warna (Andayani et al., 2014). 2) Absorbansi bakteri pada media NB 24
Perhitungan absorbansi bakteri diambil dari sampel daging ayam yang telah diawetkan dengan kelompok perlakuan. Diambil 1 potong daging ayam dan dimasukkan dalam erlenmeyer yang berisi 25 ml media NB steril. Homogenkan campuran tersebut selama 1 menit. Diambil 1 ml cairan yang telah homogen dan tuangkan pada tabung reaksi yang berisi 9 ml media NB steril. Tabung reaksi diinkubasi pada suhu 37 0 C. Ukur absorbansi media setelah 24 jam dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 600 nm. Sebagai blanko digunakan media NB steril. Perlakuan dilakukan replikasi sebanyak 3x dan semua dalam keadaan aseptis (De Oliveira et al., 2013; Rialita, 2014). F. Analisis Data Analisis deskriptif dilakukan untuk deskripsi data hasil organoleptis sampel daging ayam hasil penyimpanan. Sedangkan data hasil absorbansi diolah secara statistik. Sebelum dianalisis harus dilakukan uji homogenitas dan normalitas. Data yang tidak homogen dan tidak normal, kemudian dianalisis secara non-parametrik menggunakan metode Kruskal-Wallis. Jika terdapat perbedaan yang signifikan maka dilanjutkan analisis Post Hoc menggunakan tes Mann-Whitney untuk mengetahui perbedaan antar kelompok perlakuan, bermakna (p <0.05) atau tidak bermakna (p>0.05) (Dahlan, 2011). 25