BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Mikologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor, dari bulan Februari sampai bulan Juli 2011. Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah sampel tanah rizosfer yaitu sekitar perakaran tanaman sehat di antara tanaman yang terserang embun bulu, media triptone soya agar (TSA), water agar (WA), media luria bertani (LB), gliserol 40%, KOH 3%, aquades, formulasi komersial PGPR yang mengandung bakteri Pseudomonas fluorescens dan Bacillus polymixa dengan merek dagang Actigrow produksi PT. Agrotech Sinarindo. Alat-alat yang digunakan adalah cawan petri, tabung reaksi, labu erlenmeyer, jarum inokulasi, tabung eppendorf, laminar air flow, autoklaf, vortex, mikroskop compound, pipet mikro, spektrofotometer, shaker, haemacytometer, polybag, dan penggaris. Metode Penelitian Isolasi Bakteri Tanah diambil dari perakaran tanaman sehat di sekitar pertanaman yang terserang penyakit embun bulu. Sampel tanah diambil dari sekitar perakaran tanaman mentimun, paria, dan jagung. Pengambilan sampel tanah dilakukan pada tanah yang menempel pada perakaran tanaman. Sampel tanah tersebut lalu dimasukkan sebanyak 10 g ke dalam labu erlenmeyer yang telah diisi 90 ml air steril dan dikocok selama 15 menit. Suspensi yang dihasilkan diambil 1 ml dengan pipet mikro dan diencerkan berseri hingga pengenceran 10-7. Masingmasing seri pengenceran tersebut diambil sebanyak 0,1 ml dan dicawankan pada media TSA. Koloni bakteri yang tumbuh dimurnikan berdasarkan bentuk dan warna koloni pada media TSA.
9 Uji Pendahuluan Penghitungan Kerapatan Bakteri Bakteri diambil sebanyak 1 lup lalu dibiakkan ke dalam media LB 5 ml. Kemudian suspensi tersebut dikocok selama 24 jam. Setelah itu suspensi diencerkan berseri hingga 10-8, masing-masing pengenceran diukur nilai OD (optical density) menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 610 nm dan dicawankan sebanyak 0,1 ml ke media TSA. Hal ini bertujuan untuk mengetahui nilai OD saat kerapatan bakteri 10 7 cfu/ml, sehingga mempermudah metode percobaan selanjutnya Seleksi Awal Bakteri Rizosfer terhadap Kecambah Mentimun Seleksi awal dilakukan dengan merendam benih mentimun ke dalam suspensi bakteri. Bakteri diambil sebanyak 1 lup dari media TSA, lalu dibiakkan pada media LB dan dikocok selama 24 jam. Suspensi bakteri diukur tingkat kekeruhannya pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 610 nm hingga diperoleh OD 0,25 atau kerapatan bakteri ±10 7 cfu/ml. Benih mentimun direndam selama 1 jam di dalam suspensi bakteri, lalu ditanam pada media WA di dalam cawan petri lalu diinkubasi selama lima hari. Masing-masing perlakuan diulang tiga kali, satu cawan berisi 10 benih mentimun. Selanjutnya dilakukan pengukuran panjang batang dan panjang akar. Dari uji tersebut, diambil lima bakteri terbaik yang bersifat nonpatogen dan memacu pertumbuhan batang dan akar. Bakteri yang menekan daya kecambah dan pertumbuhan kecambah berpotensi menjadi patogen sehingga tidak digunakan pada uji selanjutnya. Uji Reaksi Hipersensitif PGPR Terpilih Pengujian reaksi hipersensitif bakteri dilakukan pada daun tembakau (Suwanto 1996). Bakteri dibiakkan pada LB dan dikocok 24 jam, lalu disuntikkan ke daun tembakau sebanyak 1 ml. Bakteri yang mempunyai sifat patogen akan menimbulkan gejala nekrosis pada daun tembakau. Pengamatan dilakukan 24 jam setelah inokulasi.
10 Uji Gram dan Penyimpanan PGPR Terpilih Uji gram pada bakteri digunakan untuk mengetahui jenis gram positif atau negatif suatu bakteri. Pengujian gram menggunakan KOH 3% yang diletakkan pada gelas preparat, lalu dicampurkan bakteri sebanyak satu lup. Gram ditentukan dengan melihat ada atau tidaknya lendir dari campuran bakteri dan KOH 3%. Jika terdapat lendir maka bakteri tergolong ke dalam gram negatif. Jika tidak terbentuk lendir maka bakteri tergolong ke dalam gram positif. Bakteri yang bersifat nonpatogen yaitu T5, T6, T8, J8, P14 (Tabel 2) dibiakkan ke dalam media LB dan dikocok selama 24 jam. Selanjutnya diambil sebanyak 0,5 ml ke dalam tabung eppendorf lalu ditambah gliserol 40%. Selanjutnya biakan disimpan pada suhu -4 C. Pengaruh PGPR terhadap Pertumbuhan Tanaman Mentimun tanpa Inokulasi Patogen Penyiapan Media Tanam Media untuk perlakuan adalah tanah dan kompos (masing-masing dengan perbandingan 2:1). Selanjutnya tanah dimasukkan ke dalam polybag dan disiram terlebih dahulu supaya lembab sebelum digunakan sebagai media tanam. Perendaman Benih Mentimun Perlakuan yang diujikan adalah perendaman benih ke dalam suspensi bakteri T5, T6, T8, J8, dan P14 yaitu bakteri yang diperoleh dari seleksi awal, sebagai pembanding adalah kontrol tanpa perlakuan bakteri dan PB yaitu PGPR yang telah diformulasi komersial oleh PT. Agrotech Sinarindo yang merupakan formulasi kombinasi bakteri Pseudomonas fluorescens dan Bacillus polymixa. Bakteri diambil sebanyak 1 lup dari media TSA, lalu dibiakkan pada media LB dan dikocok selama 24 jam. Suspensi bakteri diukur tingkat kekeruhannya pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 610 nm hingga diperoleh OD 0,25 atau kerapatan bakteri ±10 7 cfu/ml. Benih mentimun direndam selama 1 jam di dalam suspensi bakteri. Perlakuan benih dengan PGPR dilakukan untuk pengolonian PGPR seawal mungkin pada akar, sehingga akan mencegah pengolonian akar oleh mikroba patogen (Khalimi & Wirya 2009).
11 Penanaman Benih Mentimun Penanaman dilakukan di dua lokasi, percobaan pertama penanaman bertujuan untuk mengukur pengaruh perlakuan PGPR terhadap aspek agronomis, sedangkan percobaan kedua penanaman bertujuan untuk mengetahui pengaruh perlakuan PGPR terhadap masa inkubasi, kejadian penyakit, keparahan penyakit embun bulu, dan aspek agronomis. Benih yang telah direndam di dalam suspensi bakteri dengan kerapatan ±10 7 cfu/ml selama 1 jam lalu ditanam di dalam polybag yang berisi tanah steril. Pengujian dilakukan dengan 7 perlakuan (Tabel 1). Masing-masing perlakuan dilakukan dalam 3 blok sebagai ulangan, dan masing-masing ulangan terdiri dari 5 unit tanaman. Pengamatan pertumbuhan tanaman dilakukan setelah tanaman berumur 12 HST (hari setelah tanam) hingga 32 HST. Pemeliharaan dilakukan dengan menyiram tanaman setiap hari untuk menjaga tanah tetap lembab. Ajir dipasang setelah tanaman berumur satu minggu. Parameter yang diamati yaitu tinggi tanaman, diameter batang, jumlah daun, panjang daun, volume akar, serta bobot basah dan bobot kering tanaman. Tabel 1 Perlakuan PGPR yang diujikan Percobaan K T5 T6 T8 J8 P14 PB Perlakuan yang diujikan benih tanpa perlakuan bakteri (kontrol) bakteri T5 bakteri T6 bakteri T8 bakteri J8 bakteri P14 Pseudomonas fluorescens + Bacillus polymixa Keterangan: T= bakteri dari perakaran tanaman mentimun, J= bakteri dari perakaran tanaman jagung, P= bakteri dari perakaran tanaman paria, K= kontrol Pengaruh PGPR terhadap Penyakit Embun Bulu pada Tanaman Mentimun Inokulum P. cubensis diperoleh dari pertanaman mentimun di Kelurahan Situgede, Kec. Bogor Barat, Kota Bogor. Inokulasi patogen dilakukan setelah tanaman berumur 20 HST, dimana daun pertama hingga daun ketiga telah terbuka sempurna. Daun mentimun yang bergejala dikerok untuk mendapatkan spora dari
12 P. cubensis, lalu dicampur dengan air steril untuk mendapat suspensi spora. Suspensi diencerkan hingga mendapatkan kerapatan spora 9,25 x 10 4 spora/ml. Kerapatan spora dihitung menggunakan haemacytometer. Suspensi spora dengan kerapatan 9,25 x 10 4 spora/ml lalu disemprotkan ke permukaan atas dan permukaan bawah daun mentimun sebanyak 25 ml/10 tanaman. Tanaman diinkubasi dalam suatu ruang yang setelah diukur memiliki suhu minimum 24,5ºC dan suhu maksimum 35ºC, dengan kelembaban minimun 33% dan kelembaban maksimum 90%. Pengamatan dilakukan setiap hari dengan parameter yang diamati yaitu masa inkubasi, kejadian penyakit, dan keparahan penyakit. Sedangkan tinggi tanaman, diameter batang, jumlah daun, dan bobot tanaman diukur setelah 32 HST atau hari terakhir pengamatan. Rumus-rumus yang digunakan adalah sebagai berikut (Sinaga 2006): Kejadian penyakit = x 100% Keparahan penyakit = NV nivi x 100% keterangan: ni = jumlah tanaman dengan skor ke-i vi = nilai skor penyakit dari i = 0, 1, 2, 3, 4, 5 N = jumlah tanaman yang diamati V = skor tertinggi Skor yang digunakan adalah sebagai berikut: Skor Luasan bercak (%) 0 0 1 0 < x 5 2 5 < x 10 3 10 < x 25 4 25 < x 50 5 x > 50
13 Analisis Data Percobaan disusun dalam Rancangan Acak Kelompok Lengkap (RAKL). Data penelitian ditabulasi dengan program Microsoft Office Excel 2007 dan Statistical Analysis System (SAS) for windows versi 9.1.3, lalu dilanjutkan dengan uji selang berganda Duncan pada taraf nyata 5%.