BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratorium dengan metode rancangan eksperimental sederhana (posttest only control group design) menggunakan sampel sediaan ekstrak etanol daun salam. Cara yang digunakan dalam metode ini adalah subjek dibagi dalam lima kelompok yang terdiri dari dua kelompok kontrol yaitu kontrol negatif dan kontrol positif serta tiga kelompok perlakuan yang diberikan suspensi ekstrak etanol daun salam sesuai dengan konsentrasi dan dosis yang telah ditetapkan. B. Variabel Penelitian 1. Variable Bebas Variabel bebas dalam penelitian ini adalah konsentrasi ekstrak etanol daun salam dalam sediaan suspensi. 2. Variabel Terikat Variabel terikat dalam penelitian ini adalah efek antidiare pada tikus. 3. Variabel Terkendali Variabel terkendali dalam penelitian ini adalah hewan uji (galur, jenis kelamin, umur, berat badan, dan tempat pemeliharaan tikus) dan tanaman daun salam (bagian yang digunakan, daun yang sudah tua). C. Waktu dan Tempat Penelitian Tempat penelitian Laboratorium Farmakologi dan Toksikologi Universitas Muhammadiyah Purwokerto, dan Laboratorium Teknologi Sediaan Farmasi Universitas Muhammadiyah Purwokerto. D. Bahan dan Alat Penelitian Bahan-bahan penelitian meliputi: tikus jantan galur dengan BB (20-30g), ekstrak daun salam, larutan Na 2 CO 3 (Merck), reagen Folin-ciocalteau (Merck), K 3 Fe (Cn) 6 (Merck), FeCl 3 (Merck), aquadest, etanol 96% Na. 21
CMC, karboksimetal selulosa (CMC), loperamide HCl (tablet loperamide), asam galat, castor oil, pakan tikus dan sekam. Alat-Alat penelitian meliputi: blender kering, timbangan analitik, erlenmayer(pyrex), labu ukur(pyrex), tabung reaksi(pyrex), pipet ukur (Pyrex), pengering cabinet, kertas saring, corong plastik, bola hisap, vortex, rotary evapolator, alumunium oil, shaker, seperangkat alat spektrofotometer Uv-Vis merk Shimadzu, alat ukur jarak (penggaris), pinset, jarum suntik, dan kandang hewan coba (tikus). E. Prosedur Penelitian 1. Determinasi Determinasi tumbuhan daun salam (Syzygium polyanthum [Wight] Walp) dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui kebenaran dari sampel yang akan di gunakan sebagai bahan uji dalam penelitian ini. Determinasi dilakukan di Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman. 2. Pembuatan Ekstrak Daun salam Sampel daun salam yang diambil adalah daun yang sudah tua. Daun dibersihkan lalu dirajang, kemudian dikeringkan dengan menggunakan oven pada suhu 40 C. Sampel yang telah kering diblender lalu diayak dengan ayakan no 200 mesh. Serbuk daun salam sebanyak 150 g dimasukkan ke dalam beaker glass, kemudian ditambahkan pelarut etanol 96%, ditutup dan dibiarkan selama 3 hari. Rendaman tersebut disaring dengan menggunakan kertas saring (filtrat 1) dan sisanya diekstrak kembali dengan etanol 96% sebanyak 450 ml selama 2 hari. Filtrat 1 dan filtrat 2 digabung kembali diuapkan dengan menggunakan evapolator pada suhu 40 C yang bertujuan untuk menguapkan pelarutnya hingga berupa endapan tidak terlalu kental. Kemudian proses dilanjutkan dengan pemekatan ekstrak sampai menjadi ekstrak kental dengan menggunakan water bath pada suhu 50 C. 3. Penentuan Rendemen 22
Rendemen dinyatakan dalam presentase berat produk akhir yang dihasilkan per berat olahan, dapat dirumuskan sebagai berikut: % rendemen = x 100 % 4. Pembuatan Na CMC 1% (b/v) Sebanyak 1 gram Na.CMC ditimbang dilarutkan dengan 50 ml air hangat sambil diaduk menggunakan pengaduk elektrik hingga larut kemudian dicukupkan volumenya hingga 100 ml dengan aquadest dan diaduk hingga homogen. 5. Pembuatan Suspensi Ekstrak Etanol Daun Salam Larutan suspensi yang dibuat pada penelitian ini terdiri atas suspensi Carboxy Metil Cellulose (CMC) 1%. Pembuatan suspensi ekstrak etanol daun salam dengan konsentrasi 5, 10, dan 15%. Suspensi ekstrak daun salam 5% b/v dibuat dengan menimbang ekstrak etanol daun salam yang telah dibuat sebanyak 5 g kemudian disuspensikan dengan NaCMC 1% b/v sebanyak 100 ml, untuk 10% b/v dibuat dengan menimbang ekstrak etanol daun salam sebanyak 10 g kemudian disuspensikan dengan NaCMC 1% b/v sebanyak 100 ml, dan untuk 15% b/v dibuat dengan menimbang ekstrak etanol daun salam sebanyak 15 g kemudian disuspensikan dengan NaCMC 1% b/v sebanyak 100 ml. Tabel 3.1 Pembuatan Suspensi Ekstraki Daun Salam No Bahan Konsentrasi 5% Konsentrasi 10% Konsentrasi 15% 1 Ekstrak daun salam (g) 5 10 15 2 NaCMC 1% b/v 1 1 1 3 Aquabidest 100 ml 100 ml 100 ml (Hermayanti, 2013). 23
6. Pembuatan Suspensi Loperamide HCl Tiap 1 tablet loperamide mengandung 2 mg loperamide HCl. Dosis Loperamide HCl 2 mg/60 kg berat badan manusia = 0,03 mg/kg berat badan. Bila dikonversikan ke dalam dosis hewan maka dosis manusia (0,03 mg/kgbb) dikalikan km faktor dari manusia (37) dan dibagi km faktor hewan tikus (3) sehingga diperoleh hasilnya sebesar 0,41 mg/kg. Berdasarkan dosis tersebut maka diperoleh dosis untuk tiap ekor tikus dengan berat 25 g yaitu sebesar 0,01 mg dan dilarutkan dengan NaCMC 1% sebanyak 0,40 ml sehingga menghasilkan konsentrasi 0,03 mg/ml. Untuk lebih mempermudah dalam pengenceran maka 1 tablet loperamide mengandung 2mg loperamide HCl dihaluskan dan ditambahkan NaCMC 1% 78,43 ml kemudian diinduksikan sebanyak 0,40 ml tiap ekor tikus (Purwaningdyah, dkk., 2015). Tabel 3.2 Pembuatan Suspensi Loperamide HCl No Bahan Penimbangan 1 Tablet Loperamide HCl (mg) 2 (1 tablet) 2 Na CMC 1% b/v (g) 78,43 ml (Purwaningdyah, dkk., 2015). 7. Penetapan Kadar Tanin a. Pembuatan Larutan Standar Asam Galat Larutan stok asam galat dengan konsentrasi 100 ppm (mg/l), yang dibuat dengan melarutkan 0,01 g asam galat dalam labu ukur 100 ml dan ditambahkan aquabidest sampai tanda batas. Kemudian dibuat serangkaian larutan standar dengan konsentrasi 2;4;6;8;10 dan 12 ppm. b. Penentuan Panjang Gelombang Maksmimum Larutan standar asam galat 4 ppm diukur serapannya pada panjang gelombang 400-800 nm dengan interval tertentu. Hasil yang diperoleh dibuat dalam bentuk spektrum, sebagai sumbu y adalah absorbansi dan panjang gelombang cahaya sebagai sumbu x. Berdasarkan spektrum tersebut dapat ditentukan panjang gelombang yang memberikan serapan maksimum. 24
c. Pembuatan Kurva Baku Kurva baku dibuat dengan menghubungkan konsentrasi larutan standar dengan hasil serapannya yang diperoleh dari pengukuran dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 620 nm. d. Pembuatan Kurva Standar Asam Galat Larutan stok asam galat 100 ppm sebanyak 0,2;0,4;0,6;0,8;1,0 dan 1,2 ppm dimasukkan ke dalam labu ukur 10 ml, lalu ditambahkan dengan reagen Folin Ciocalteu, dikocok dan didiamkan selama 5 menit, ke dalam larutan tersebut ditambah 2 ml larutan Na 2 CO 3 75g/L dikocok homogen dan didiamkan selama 5 menit. Tambahkan aquabidest sampai tepat volume 10 ml, dikocok homogen dan didiamkan selama 90 menit. Lalu absorbansi pada panjang gelombang maksimum. Dengan mengalurkan absorbansi terhadap konsentrasi, dapat diperoleh kurva kalibrasi dengan persamaan regresi y=bx+a. e. Penentuan Kadar Tanin Total Sampel esktrak etanol daun salam diambil sebanyak 1 ml dan dilakukan pengenceran dengan etanol sampai volume 10 ml. Selanjutnya diambil 1 ml kedalam tabung reaksi dan ditambahkan FeCl 3 1 M dan K 3 Fe(Cn) 6 0.08 M sebanyak 1 ml. Ditambahkan aquadest 7 ml dan divortex hingga homogen. Pengukuran absorbansi pada panjang gelombang 620 nm. Hasil yang diperoleh dikalibrasi dengan kurva standar galat. 8. Penetapan Kadar Fenol a. Pembuatan Larutan Standar Asam Galat Larutan stok asam galat dengan konsentrasi 100 ppm (mg/l), yang dibuat dengan melarutkan 0,01 g asam galat dalam labu ukur 100 ml dan ditambahkan aquabidest sampai tanda batas. Kemudian dibuat serangkaian larutan standar dengan konsentrasi 2;4;6;8;10 dan 12 ppm. 25
b. Penentuan Panjang Gelombang Maksmimum Larutan standar asam galat 4 ppm diukur serapannya pada panjang gelombang 400-800 nm dengan interval tertentu. Hasil yang diperoleh dibuat dalam bentuk spektrum, sebagai sumbu y adalah absorbansi dan panjang gelombang cahaya sebagai sumbu x. Berdasarkan spektrum tersebut dapat ditentukan panjang gelombang yang memberikan serapan maksimum. c. Pembuatan Kurva Baku Kurva baku dibuat dengan menghubungkan konsentrasi larutan standar dengan hasil serapannya yang diperoleh dari pengukuran dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 765 nm. d. Pembuatan Kurva Standar Asam Galat Larutan stok asam galat 100 ppm sebanyak 0,2;0,4;0,6;0,8;1,0 dan 1,2 ppm masing-masing ditambahkan dengan reagen Folin Ciocalteu sebanyak 0,8 ml, dimasukkan pada labu ukur 10 ml. Selanjutnya ditambahkan Na 2 CO 3 75g/L hingga tanda batas, sehingga menghasilkan larutan standar dengan konsentrasi 2, 4, 6, 8, 10, dan 12 ppm. Masing-masing larutan didiamkan selama 60 menit, dan serapannya diukur pada panjang gelombang maksimum. Dengan mengalurkan absorbansi terhadap konsentrasi, dapat diperoleh kurva kalibrasi dengan persamaan regresi y=bx+a. e. Penetuan Total Senyawa Fenol Sampel ekstrak etanol daun salam yang akan diuji dengan volume 1 ml kemudian tambahkan NaCO 3 75g/L 4 ml dan reagen Folin-Ciocalteau (diencerkan 1:10) 5 ml. Divortex hingga homogen dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu ruang. Pemipetan 3 ml kedalam kuvet dan dilakukan pengukuran absorbansi pada panjang gelombang 765 nm hasil yang diperoleh dikalibrasi dengan kurva standar asam galat. 26
9. Uji Aktivitas Antidiare Ekstrak Etanol Daun Salam Tikus diadaptasi terlebih dahulu dalam suasana laboratorium selama satu minggu. Lima belas ekor tikus jantan (150-200 g) yang dipilih secara random dibagi menjadi 5 kelompok ( kontrol dan perlakuan). Tiap kelompok terdiri dari 3 ekor tikus dengan penggelompokkan sebagai berikut: Kelompok I : kelompok kontrol negatif diberi suspensi NaCMC 1% per oral Kelompok II : kelompok kontrol positif diberi suspensi loperamide HCl 0,40 ml secara per oral Kelompok III : kelompok perlakuan I diberi suspensi ekstrak etanol 96% dengan dosis 200 mg/kgbb tikus jantan Kelompok IV : kelompok perlakuan II diberi suspensi ekstrak etanol 96% dengan dosis 400 mg/kgbb tikus jantan Kelompok V : kelompok perlakuan III diberi suspensi ekstrak etanol 96% dengan dosis 800 mg/kgbb tikus jantan Satu jam setelah pemberian sediaan uji, tikus diberikan 1,0 ml castor oil peroral yang merujuk pada penelitian yang dilakukan oleh Hossain, et al,. (2012). Selanjutnya, tikus diletakkan ke dalam kandang dengan alas kertas saring yang sebelumnya telah ditimbang dan dibiarkan selama empat jam. Munculnya diare ditandai dengan adanya feses yang cair dan tidak berbentuk. Feses yang berbentuk (tidak hancur) dipisahkan dan selanjutnya kertas saring yang ditempeli oleh feses cair dan tidak berbentuk ditimbang (berat kertas saring sebelumnya sudah ditimbang). F. Analisis Data Presentase efek antidiare suspensi ekstrak etanol daun salam dihitung dengan menggunakan persamaan yang merujuk pada penelitian yang dilakukan oleh Shiramane et al., (2011): % efek Antidare = k - p k x 100% Keterangan : 27
p = rata-rata berat feses cair dan tidak berbentuk tikus kelompok suspensi ekstrak etanol daun salam dan loperamide HCl k = rata-rata berat feses cair dan tidak berbentuk tikus kelompok kontrol Pada penelitian ini data uji antidiare dianalisis dengan ANOVA SPSS 17.0 yaitu ANOVA satu arah (One Way Anova) sebelum uji ANOVA dilakukan uji normalitas dan homogenitass. Anova dapat digunakan untuk menganalisis sejumlah sampel dengan jumlah data yang sama pada tiap-tiap kelompok sampel, atau dengan jumlah data yang berbeda. Uji ANOVA satu arah dilakukan untuk mengetahui perbedaan berat feses cair dan tidak berbentuk antar kelompok perlakuan (p<0,05). 28