21 3 METODOLOGI PENELITIAN 3.1 Kerangka Pemikiran Ubi kayu merupakan salah satu hasil pertanian dengan kandungan karbohidrat yang cukup tinggi sehingga berpotensi sebagai bahan baku pembuatan etanol. Penggunaan ubi kayu segar mempunyai kelebihan dibandingkan dengan penggunaan tepung ubi kayu, yaitu dapat memperpendek proses produksi etanol. Ubi kayu segar harus melalui proses hidrolisis untuk memecah komponen polisakarida menjadi gula-gula sederhana yang siap untuk digunakan sebagai sumber karbon yang akan diubah menjadi etanol oleh khamir. Proses hidrolisis yang digunakan adalah metode hidrolisis asam karena mempunyai kelebihan mampu menghidrolisis komponen pati dan serat secara bersamaan serta penanganannya yang mudah. Namun selama proses fermentasi etanol yang dihasilkan akan menghambat laju fermentasi sehingga tidak semua kandungan gula dapat dikonversi menjadi etanol. Sisa gula yang tidak terkonversi menjadi etanol akan tertinggal pada vinasse. Sebelum digunakan, vinasse harus diberi pretreatment. Proses pretreatment vinasse mempunyai tujuan untuk memperbaiki kualitas dari vinasse itu sendiri. Proses netralisasi selain bertujuan untuk menaikkan ph menjadi 4,5 juga dapat berfungsi untuk menurunkan kadar HMF (Susmiati 2010), sedangkan sentrifugasi bertujuan untuk menghilangkan partikel kotoran dan kelebihan garam yang terbentuk setelah proses netralisasi. Potensi sumber nutrien dalam vinasse tersebut akan didaur ulang sehingga dapat dimanfaatkan kembali sebagai sumber gula dengan campuran substrat hidrolisat yang segar. Kerangka pemikiran selengkapnya tersaji secara skematik pada Gambar 5. PRETREATMENT UBI KAYU HIDROLISIS FERMENTASI DESTILASI VINASSE ETANOL Gambar 5 Kerangka pemikiran penelitian.
22 3.2 Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilakukan mulai bulan Februari 2010 hingga bulan Agustus 2010 yang dilaksanakan di Laboratorium SBRC (Surfactant and Bioenergy Research Center), Laboratorium Bioindustri Departemen Teknologi Industri Pertanian Institut Pertanian Bogor dan laboratorium-laboratorium lainnya di lingkungan Departemen Teknologi Industri Pertanian, Institut Pertanian Bogor. 3.3 Bahan dan Alat 3.3.1 Bahan Bahan baku utama dalam penelitian ini adalah ubi kayu yang berasal dari Kabupaten Bogor, Jawa Barat. Mikroorganisme yang digunakan untuk fermentasi etanol adalah S. cerevisiae dalam bentuk dry baker yeast komersial. Bahan yang digunakan sebagai bahan tambahan untuk pertumbuhan mikroorganisme adalah pupuk NPK. Bahan kimia yang digunakan pada penelitian ini antara lain H 2 SO 4 pekat teknis, NH 4 OH 21%, etanol 70% dan bahan kimia untuk analisis. 3.3.2 Alat Peralatan utama yang digunakan dalam penelitian ini antara lain peralatan gelas, spektrofotometer merk Hach, otoklaf, ph meter merk Beckman, vortex mixer, density meter DMA 4500 merk Anton Paar, refraktometer merk Atago tipe Master-53M dan seperangkat alat produksi bioetanol skala laboratorium. Pengolahan data menggunakan bantuan software Microsoft Office Excel versi 2007. 3.4 Metode Penelitian Tahapan percobaan fermentasi untuk produksi etanol dengan melakukan proses daur ulang vinasse sebagai umpan balik dapat dibagi menjadi lima tahapan utama antara lain proses persiapan bahan baku, hidrolisis ubi kayu, fermentasi, persiapan vinasse dan proses daur ulang vinasse.
23 3.4.1 Persiapan Bahan Baku Persiapan bahan baku utama penelitian yang berupa ubi kayu diawali dengan membuang bagian pangkal tanaman yang masih melekat dengan umbi karena umbi yang dipakai dalam penelitian ini dibeli dari petani dalam keadaan masih melekat utuh dengan batang bawah untuk menjaga kesegaran umbi ketika dibawa dari tempat panen ke laboratorium. Ubi kayu kemudian diproses lebih lanjut di Laboratorium SBRC IPB Baranangsiang untuk membersihkan kotoran dan tanah yang masih menempel di umbi dengan cara pencucian. Umbi ubi kayu yang telah bersih kemudian dikupas lapisan kulit arinya yang berwarna cokelat menggunakan pisau. Proses pengupasan selain untuk membersihkan kulit ari sekaligus juga berfungsi untuk menyortir umbi yang jelek, membuang bagian pangkal umbi yang mengandung kayu dan bagian akar yang masih menempel di umbi. Ubi kayu yang telah bersih kemudian dicuci dengan air untuk menghilangkan tanah dan kotoran yang masih menempel pada umbi. Ubi kayu yang telah bersih kemudian digiling hingga halus menggunakan mesin parut hingga menjadi bubur. Bubur ubi kayu kemudian dikarakterisasi sifat kimia antara lain komponen proksimat (air, abu, lemak, protein, serat kasar dan karbohidrat (by difference) menurut metode AOAC (1995)), pati dan komponen serat (ADF, NDF, selulosa dan lignin menurut metode Van Soest (1963)). Prosedur analisis secara lengkap dapat dilihat pada Lampiran 1. 3.4.2 Hidrolisis Asam Metode hidrolisis yang digunakan merupakan hasil modifikasi metode hidrolisis yang dipergunakan oleh Susmiati (2010). Hasil hidrolisis tepung ubi kayu dengan total padatan substrat 30% dengan konsentrasi H 2 SO 4 0,4 M akan menjadi patokan bagi hasil hidrolisis bubur ubi kayu. Bubur ubi kayu dihidrolisis menggunakan larutan H 4 SO 4 0,4 M dengan total padatan substrat 30%, 35%, 20%, 18% dan 15%. Hasil hidrolisat kemudian diamati tingkat kesempurnaan proses hidrolisis berdasarkan warna hidrolisat yang merata dan tidak adanya gumpalan ubi kayu. Hasil hidrolisis bubur ubi kayu dengan total padatan substrat 18% dipilih karena menghasilkan total padatan terlarut hidrolisat tertinggi dan tidak adanya gumpalan ubi kayu yang di dalam hidrolisat. Bubur ubi kayu dengan
24 total padatan substrat 18% kemudian dihidrolisis dengan konsentrasi H 2 SO 4 0,4 M dan 1 M yang kemudian diukur nilai total padatan terlarut hidrolisatnya. Nilai total padatan terlarut hidrolisat yang didapatkan kemudian dibandingkan dengan nilai total padatan terlarut hidrolisat hasil hidrolisis tepung ubi kayu. Nilai hasil total padatan terlarut hidrolisat yang mendekati nilai total padatan terlarut tepung ubi kayu yang akan digunakan di dalam penelitian ini, yaitu kadar padatan bubur ubi kayu 18% dengan konsentrasi H 2 SO 4 1 M. Hidrolisis asam dalam penelitian ini dilakukan dalam satu tahap menggunakan otoklaf sederhana dimana suhu dan waktu hidrolisis diatur secara manual. Waktu hidrolisis dihitung ketika kondisi suhu telah tercapai. Bubur ubi kayu dihidrolisis dengan volume total 500 ml dalam erlenmeyer 1000 ml yang diberi sumbat kapas dan alumunium foil untuk mencegah larutan meluap keluar ketika dilakukan proses hidrolisis. Hidrolisis dilakukan dengan menambahkan asam H 2 SO 4 pekat teknis sebanyak 23 ml ke dalam 270,68 g bubur ubi kayu dan ditambahkan aquadest sebanyak 206,32 ml. Perbandingan yang dipakai tersebut untuk mencapai kondisi proses hidrolisis yang diinginkan yaitu kadar padatan 18% dan konsentrasi H 2 SO 4 sebesar 1 M. Campuran kemudian dihidrolisis menggunakan otoklaf pada suhu 121 o C selama 15 menit sehingga diperoleh hidrolisat asam yang berwarna merah tua. Proses hidrolisis ini ditujukan untuk memecah komponen pati dan serat yang ada di dalam bahan menjadi glukosa. Selanjutnya dilakukan pengukuran total gula dan gula pereduksi untuk melihat tingkat hidrolisis. 3.4.3 Fermentasi Etanol A. Persiapan Media Fermentasi Hidrolisat asam sebelum digunakan sebagai media fermentasi harus melalui proses netralisasi, penyaringan dan sentrifugasi. Proses netralisasi hidrolisat menggunakan NH 4 OH teknis 21% hingga ph 4,5. Tahap persiapan hidrolisat selanjutnya adalah proses pemisahan padatan dengan cairan hidrolisat yang terdiri dari dua tahapan proses yaitu penyaringan dan sentrifugasi. Proses penyaringan dilakukan menggunakan kain saring yang berfungsi untuk memisahkan ampas yang berukuran besar. Ampas yang didapatkan dilakukan karakterisasi yang
25 meliputi analisis kadar air, kadar abu, total N, kadar lemak, kadar serat, kadar karbohidrat. Prosedur analisis secara lengkap dapat dilihat pada Lampiran 1. Hasil penyaringan dilanjutkan dengan proses sentrifugasi untuk mengurangi jumlah padatan terlarut dan kelebihan garam yang terbentuk dari proses netralisasi. Proses sentrifugasi dilakukan pada kecepatan 2500 rpm selama 5 menit sehingga dihasilkan dua produk yaitu sludge dan filtrat. Filtrat digunakan sebagai media fermentasi etanol sedangkan sludge tidak digunakan. B. Fermentasi Etanol Fermentasi dilakukan dengan menambahkan S. cerevisiae sebagai agen yang melakukan fermentasi dalam bentuk dry baker yeast komersial (ragi roti) dan sumber nutrisi berupa pupuk NPK. Jumlah ragi roti dan NPK yang ditambahkan sebanyak 0,06% total gula dan ragi roti sebanyak 0,23% total gula. Proses fermentasi dilakukan selama 96 jam pada suhu ruangan dengan 24 jam pertama diberi perlakuan agitasi menggunakan orbital shaker (129 rpm) dengan sistem tertutup. Hasil fermentasi yang didapatkan dilakukan analisis mengenai kadar etanol, kadar gula, ph dan total asam. Prosedur analisis dapat dilihat secara lengkap pada Lampiran 1. Proses fermentasi diakhiri setelah 96 jam dan dilanjutkan dengan proses destilasi. Kaldu hasil fermentasi kemudian didestilasi untuk memisahkan produk utama yang berupa etanol dan cairan sisa destilasi sebagai produk samping akhir proses destilasi. Parameter yang diamati pada akhir fermentasi antara lain efisiensi pembentukan produk, efisiensi fermentasi dan efisiensi penggunaan substrat. Hasil dari destilasi yang berupa cairan berwarna cokelat gelap inilah yang menjadi bahan baku utama yang diteliti dalam penelitian ini. Cairan hasil destilasi ini kemudian disebut dengan istilah vinasse. 3.4.4 Persiapan Vinasse Vinasse sebelum digunakan sebagai umpan balik dilakukan karakterisasi sifat kimia yang meliputi meliputi analisis ph, total gula, total gula pereduksi, total padatan terlarut, total asam, kadar HMF, BOD 5 dan COD. Prosedur analisis
26 secara lengkap dapat dilihat pada Lampiran 1. Vinasse yang didapatkan dari hasil destilasi mempunyai nilai ph yang rendah. Vinasse harus diolah terlebih dahulu agar dapat dipergunakan kembali sebagai bahan fermentasi alkohol, yaitu dengan melakukan proses netralisasi dan sentrifugasi. Hasil karakterisasi vinasse menjadi acuan dalam melakukan proses pengolahan pretreatment sebelum dilakukan daur ulang. Vinasse dinetralkan dahulu menggunakan NH 4 OH 21% hingga mencapai ph 4,5 untuk menyesuaikan dengan kondisi ph yang digunakan dalam proses fermentasi. Vinasse kemudian disentrifugasi pada kecepatan 2500 rpm selama 5 menit untuk memisahkan sludge dengan filtrat (treated vinasse). Diagram alir pengolahan vinasse menjadi hidrolisat yang siap digunakan sebagai media fermentasi secara lengkap dapat dilihat pada Gambar 6. Vinasse Padatan Penyaringan Netralisasi ph 4,5 NH 4 OH 21% Sentrifugasi 2500 rpm, 5 menit Treated Vinasse Gambar 6 Diagram alir proses pengolahan vinasse. 3.4.5 Daur Ulang Vinasse Modifikasi yang dilakukan dalam penelitian ini adalah dengan melakukan pengolahan kembali produk samping yang keluar dan menggunakan kembali sebagai media fermentasi baru. Produk samping yang keluar, baik produk samping padat maupun vinasse, masih banyak mengandung kandungan karbohidrat yang dapat digunakan sebagai media fermentasi. Produk samping yang ada akan diproses untuk mendapatkan komponen gula sederhana sebagai bahan baku pembuatan etanol. Hasil pengolahan vinasse akan dikombinasikan dengan hidrolisat baru sehingga menjadi media fermentasi baru. Diagram alir proses daur ulang vinasse dapat dilihat secara lengkap pada Gambar 7.
27 Vinasse diformulasikan dengan jumlah 60% (V1), 50% (V2) dan 40% (V3) sedangkan sisanya adalah hidrolisat ubi kayu segar untuk mencari komposisi yang dapat menghasilkan kadar etanol terbaik. Hasil formulasi diatur total padatan terlarutnya hingga mencapai 15% ( o brix). Media fermentasi sebelum difermentasi dilakukan proses sterilisasi selama 5 menit pada suhu 105 o C untuk mematikan mikrob lain yang dapat mengganggu pertumbuhan S. cerevisiae kemudian ditambahkan NPK sebanyak 0,06% total gula dan khamir sebanyak 0,23% total gula. Proses fermentasi selama 24 jam pertama dilakukan di atas shaker dengan kecepatan 129 rpm dan setelah 24 jam, fermentasi dilanjutkan tanpa pengadukan. Kaldu hasil fermentasi dianalisis kadar etanol, kadar gula dan ph dimana prosedur analisis secara lengkap dapat dilihat pada Lampiran 1. Proses fermentasi dengan melakukan daur ulang vinasse dilakukan berulang hingga tiga kali tingkatan (T1, T2 dan T3). T0 adalah fermentasi awal menggunakan hidrolisat ubi kayu tanpa penambahan vinasse. Treated Vinasse Hidrolisat Media Fermentasi Persiapan Vinasse Fermentasi Vinasse Destilasi Etanol Gambar 7 Diagram alir proses daur ulang vinasse. 3.5 Rancangan Percobaan Rancangan percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap faktorial yang terdiri dari dua faktor yaitu kandungan vinasse (V) dan tingkat daur ulang (T) dengan dua kali ulangan (Gaspersz 1991). Faktor kandungan vinasse terdiri dari kandungan vinasse 60% (V1), kandungan vinasse 50% (V2) dan kandungan vinasse 40% (V3). Faktor tingkat daur ulang yang dianalisis meliputi daur ulang tingkat pertama (T1), daur ulang tingkat kedua (T2) dan daur ulang
28 tingkat ketiga (T3). Model matematis yang digunakan untuk percobaan ini adalah sebagai berikut: Yijk ( ) i j ij ijk Keterangan: Y ijk = nilai variabel respon unit percobaan yang dikenai taraf ke-i faktor kandungan vinasse dan tingkat daur ulang ke-j. µ = nilai rata-rata pengamatan yang sesungguhnya. α i β j αβ ij ε ijk = pengaruh aditif dari kandungan vinasse ke-i = pengaruh aditif dari tingkat daur ulang ke-j = pengaruh interaksi antara kandungan vinasse ke-i dan tingkat daur ulang ke-j. = pengaruh galat dari satuan percobaan ke-k yang memperoleh kombinasi perlakuan ij. Parameter yang diamati meliputi kadar etanol, efisiensi fermentasi, yield etanol, Δ total asam dan efisiensi penggunaan substrat. Uji lanjut Duncan dilakukan untuk menentukan pengaruh perlakuan terhadap parameter (Setiawan 2009).