BAB III BAHAN DAN METODE PENELITIAN 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilaksanakan pada April 2013 sampai dengan Mei 2013 di laboratorium Nutrisi Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Padjadjaran, Jatinangor. 3.2 Alat dan Bahan Penelitian 3.2.1 Alat-Alat Penelitian 3.2.1.1 Proses Isolasi Bakteri Probiotik - Gelas ukur 500 ml dan 1000 ml untuk wadah media cairan. - Mikropipet dengan skala 100-1000 µ1 merek Bio-Rad, yang digunakan untuk memindahkan cairan yang bervolume cukup kecil. - Sentrifuge untuk memisahkan senyawa dengan berat molekul berbeda. - Tabung reaksi ukuran 15x150 mm untuk tempat media padat dan cair. - Rak tabung reaksi untuk tempat meletakkan tabung reaksi. - Vortex mixer untuk menghomogenkan larutan. - Inkubator sebagai tempat mengkultur atau mengikubasi mikroba pada suhu yang disesuaikan. - Laminar flow sebagai tempat steril untuk proses isolasi, inokulasi dan pemurniaan mikroba. - Labu Erlenmayer untuk wadah pembuatan media agar. - Autoclave untuk mensterilkan media dan peralatan yang akan digunakan dengan suhu 121 o. - Bunsen untuk mensterilkan udara. - Botol semprot 15 ml untuk menyemprotkan larutan mikroba ke pakan. - Cawan petri untuk media inkubasi. - Jarum ose untuk menginokulasi mikroba. - Batang L untuk meratakan mikroba di media padat. 18
19 - Alumunium foil untuk menimbang bahan-bahan media juga sebagai panutup labu Erlenmayer. - Hot plate dan stir plate untuk memanaskan dan mengaduk media. - Kapas dan kain kasa sebagai penutup tabung reaksi atau labu Erlenmayer. - Pisau bedah, gunting, pinset untuk pengambilan inokulum dari saluran pencernaan ikan. - Spektrofotometer sebagai alat penghitung kepadatan bakteri. 3.2.1.2 Alat Uji - Akuarium dengan ukuran (60x35x30) cm 3 sebanyak 15 buah (Lampiran 2) dengan volume air 20 L. - Blower sebanyak 1 buah, yang diberi selang dan batu aerasi sebanyak 30 buah untuk disebar pada setiap akuarium. - Timbangan digital dengan ketelitian 0,1 gr untuk menimbang bobot dan pakan ikan (Lampiran 3). - Thermostat untuk menstabilkan suhu air. - Termometer air raksa untuk mengukur suhu air. - ph meter untuk mengukur kadar ph air. - DO meter untuk mengukur kadar oksigen terlarut. - Selang untuk penyiponan dan untuk mengganti air. - Serok kain kasa sebanyak 1 buah untuk mengambil ikan uji. 3.2.2 Bahan Penelitian Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini diantaranya adalah: - Ikan uji Ikan uji yang digunakan adalah benih ikan lele dumbo sebanyak 400 ekor yang diperoleh dari Balai Benih Ikan (Ciparay), 300 ekor digunakan untuk bahan penelitian dan 100 ekor untuk stok. Bobot ikan yang digunakan kurang lebih sekitar 1 g dengan panjang berkisar 2-3 cm. Pada setiap akuarium ditebar 20 ekor benih.
20 - Pakan Uji Pakan ikan yang digunakan adalah pakan komersial berupa pelet yang memiliki kandungan protein sekitar 39-41%. - Larutan Fisiologi Saline (0,9 % NaCl). - Isolat murni bakteri Bacillus sp. - Media kultur padat MRS agar (Man Ragosa Sharpe Agar) dan media kultur cair MRSB (Man Ragosa Sharpe Broth). 3.3 Metode Penelitian Metode yang digunakan dalam penelitian ini yaitu Metode Eksperimen dengan Rancangan Acak Lengkap (RAL) 5 perlakuan dan 3 kali ulangan. Pemberian dosis Bacillus sp. yang dicampur berdasarkan berat pakan komersil dengan perlakuan yaitu: Perlakuan A = kontrol / tanpa pemberian probiotik pada pakan. Perlakuan B = pemberian Bacillus sp. sebanyak 15 ml/kg pakan Perlakuan C = pemberian Bacillus sp. sebanyak 30 ml/kg pakan Perlakuan D = pemberian Bacillus sp. sebanyak 45 ml/kg pakan Perlakuan E = pemberian Bacillus sp. sebanyak 60 ml/kg pakan 3.4 Prosedur Penelitian 3.4.1 Persiapan Akuarium - Membersihkan akuarium ukuran 60 cm x 40 cm x 40 cm sebanyak 15 buah dan bak fiber untuk menampung ikan lalu dikeringkan. - Memberi tanda setiap akuarium sesuai dengan perlakuan dan peletakkan dilakukan secara acak. - Setiap akuarium diisi dengan air PAM sebanyak 20 L. - Memasang water heater thermostat pada setiap akuarium dengan suhu 28ºC.
21 3.4.2 Persiapan Ikan Uji - Ikan uji di aklimatisasi didalam bak fiber selama 1 minggu. - Menimbang bobot ikan sebelum dipindahkan ke akuarium. - Masing-masing akuarium ditebar 20 ekor benih ikan. 3.4.3 Persiapan Bacillus sp. 3.4.3.1 Prosedur Kultur Padat Bacillus sp. yang Akan Digunakan Dalam Pakan (Anggraini, 2012) - Mengambil isolat dari saluran pencernaan ikan tagih (Hemibagrus nemurus) dengan cara digerus. - Isolat bakteri Bacillus sp. yang didapat dimasukkan kedalam tabung reaksi yang berisi larutan NaCl sebesar 9 ml. - Bacillus sp. diambil dari tabung reaksi sebesar 1 ml dan dikultur pada media MRS agar (Man Ragosa Sharpe Agar) dan diinkubasi selama 48 jam pada suhu 35 C. 3.4.3.2 Prosedur Kultur Cair dan Penghitungan Koloni Bacillus sp. - Bakteri Bacillus sp. yang telah tumbuh di media padat diambil sebanyak satu ose bakteri dan dikultur pada media MRS Broth dan diinkubasi selama 48 jam pada suhu 35 C. - Hasil inkubasi Bacillus sp. pada MRS Broth selama 48 jam dimasukkan ke dalam microtube berkapasitas 10 ml sebanyak dosis yang dibutuhkan. - Disentrifuge selama 15 menit dengan kecepatan 3000 rpm. - Pemisahan antara peletting dan supernatan. - Setelah peletting dan supernatan dipisahkan lalu peletting dicampurkan dengan menggunakan larutan NaCl secukupnya hingga kepadatan bakteri mencapai 10 8 cfu/ml dengan menggunakan spetofotometer. - Penghitungan koloni dilakukan dengan menggunakan alat spektrofotometer dengan panjang gelombang 620 nm dan nilai absorbant 1 untuk mencapai kepadatan 10 8 cfu/ml.
22 3.4.3.3 Prosedur Penambahan Bacillus sp. ke Dalam Pakan (Lampiran 1) - Pakan ditimbang sesuai dengan perlakuan yang akan diberikan. - Bakteri Bacillus sp. yang telah diukur dengan jumlah kepadatan 10 8 cfu/ml dicampurkan ke pakan sesuai dengan dosis masing-masing perlakuan dengan cara disemprotkan. - Pakan yang telah disemprotkan bakteri Bacillus sp. sesuai dengan dosis perlakuan diberi kuning telur 2% sebagai bahan perekat dan dianginkan selama 5 menit. 3.5 Pelaksanaan Penelitian - Pemberian pakan setiap 3 kali sehari dengan jumlah pakan 5% dari bobot biomassanya (Sahwan, 2004). Pemberian pakan dilakukan pukul 09.00 wib, 13.00 wib, 17.00 wib. - Penyiponan sisa pakan dilakukan setiap pagi. 3.6 Parameter Penelitian Parameter yang diamati dalam penelitian yaitu kelangsungan hidup, laju pertumbuhan, dan kualitas air. 3.6.1 Kelangsungan Hidup Tingkat kelangsungan hidup merupakan salah satu parameter yang akan diamati dalam penelitian ini, perhitungan berdasarkan Effendie (1997) yakni : KH= Nt x 100% No Keterangan: KH = Kelangsungan Hidup (%) Nt = Jumlah ikan yang hidup pada akhir pengamatan (ekor) No = Jumlah ikan pada awal pengamatan (ekor)
23 3.6.2 Pertumbuhan Biomassa Menurut Mudjiman (2004), pertumbuhan didefinisikan sebagai perubahan ikan dalam berat, ukuran, seiring dengan berubahnya waktu. Untuk mengukur pertumbuhan mutlak sebagai berikut : h = Wt Wo (Effendi,1997) h = Pertumbuhan bobot mutlak (g) Wt = Bobot rata-rata pada akhir penelitian (g) Wo = Bobot rata-rata pada awal penelitian (g) 3.6.3 Kualitas Air Kualitas air yaitu sifat air dan kandungan makhluk hidup, zat energi atau komponen lain di dalam air. Kualitas air dinyatakan dengan beberapa parameter yaitu parameter fisika, parameter kimia dan parameter biologi (Effendi, 2003). Parameter kualitas air yang akan diamati dan alat yang akan digunakan serta frekuensi pengukuran dalam penelitian ini dapat dilihat pada Tabel 1. Tabel 1. Parameter Kualitas Air yang Diamati Parameter Satuan Alat Suhu ( ºC ) Termometer ph - ph meter DO (mg/l) DO meter
24 3.7 Analisis Data Data hasil pengamatan dianalisis dengan menggunakan uji F pada taraf kepercayaan 95%, dan jika terdapat perbedaan nyata pada perlakuan uji F maka dilanjutkan dengan uji jarak berganda Duncan pada tingkat kepercayaan 95%. Sedangkan data kualitas air dianalisis secara deskriptif.