LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI PEWARNAAN GRAM DAN PENGAMATAN MORFOLOGI BAKTERI Disusun Oleh : ALFIAN PRAMUDITYA DARIS DIAH OKTIVA FURI J310090068 J310090047 J310090050 PROGRAM STUDI GIZI S1 FAKULTAS ILMU KESEHATAN UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH SURAKARTA 2011 PEWARNAAN GRAM DAN PENGAMATAN MORFOLOGI BAKTERI
A. TUJUAN PRAKTIKUM 1. Mahasiswa mampu memahami dan melakukan pewarnaan gram terhadap jenis bakteri. 2. Mahasiswa mampu mengidentifikasi suatu jenis bakteri termasuk bakteri gram positif dan gram negatif. 3. Mahasiswa mampu mengamati berbagai morfologi bakteri. 4. Mahasiswa mampu menggolongkan berbagai morfologi bakteri. B. PENDAHULUAN 1. Latar Belakang Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), kokus, dan spirilum. Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil. Sedangkan pada kokus dibagi monokokus (satu buah bakteri berbentuk kotak), diplococcus, sampai staphylococcus (bentuknya mirip buah anggur. Khusus pada spirul hanya dibagi 2 yaitu setengah melengkung dan tidak melengkung. Bakteri juga dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan gram. Teknik pewarnaan gram tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu. Bakteri gram negatif ditandai dengan pewarnaan ungu sedangkan yang positif berwarna merah (jawetz, 2005). Hal ini bertujuan untuk memberikan warna pada bakteri pada akhirnya dapat diidentifikasi dengan mudah. Selain itu, ada endospore yang bisa diwarnai. Endospora adalah organisme yang dibentuk dalam kondisi yang stres karena kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut di lingkungan sampai kondisi menjadi baik (Jawetz, 2005). Teknik pewarnaan gram haruslah sesuai prosedur karena dapat mengakibatkan kesalahan identifikasi data apakah gram positif atau gram
negatif sehingga diperlukan adanya praktikum ini dilakukan agar mengetahui jalannya mekanisme pewarnaan gram. 2. Tinjauan Pustaka Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian gram pada tahun 1884. Dengan metode ini, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri gram positif dan gram negatif yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp. (Tryana, S.T, 2008). Struktur bakteri terbagi menjadi dua yaitu: 1. Struktur dasar (dimiliki oleh hampir semua jenis bakteri) Meliputi: dinding sel, membran plasma, sitoplasma, ribosom, DNA, dan granula penyimpanan. 2. Struktur tambahan (dimiliki oleh jenis bakteri tertentu) Meliputi kapsul, flagelum, pilus, fimbria, klorosom, Vakuola gas dan endospora. Staphylococcus adalah bakteri Gram-positif yang berbentuk bola. Bakteri ini ada yang berkoloni dan berbentu seperti buah buah anggur. Pada tahun 1884, Rosenbach menjelaskan ada dua jenis warna staphylococci yaitu: Staphylococcus Aureus yang berwarna kuning dan Staphylococcus albus yang berwarna putih. Beberapa karakterististik yang dimiliki Staphylococcus Aureus diantaranya hemolytic pada darah agar, catalase-oxidase-positif dan negatif, dapat tumbuh pada suhu berkisar 15 sampai 45 derajat dan lingkungan NaCl pada konsentrasi tinggi hingga 15 persen dan menghasilkan enzim coagulase. Selain itu,biasanya S. Aureus merupakan patogen seperti bisul, styes dan furunculosis beberapa infeksi (radang paru-paru, radang kelenjar dada, radang urat darah, meningitis, saluran kencing osteomyelitis
dan endocarditis serta menyebabkan keracunan makanan yaitu dengan melepakan enterotoxins menjadi makanan sehingga menjadi toksik dengan melepasan superantigens ke dalam aliran darah (Lubis, 2007). Bacillus subtilis merupakan bakteri gram-positif yang berbentuk batang, dan secara alami sering ditemukan di tanah dan vegetasi. Bacillus subtilis tumbuh di berbagai mesophilic suhu berkisar 25-35 derajat Celsius. Bacillus subtilis juga telah berevolusi sehingga dapat hidup walaupun di bawah kondisi keras dan lebih cepat mendapatkan perlindungan terhadap stres situasi seperti kondisi ph rendah (asam), bersifat alkali, osmosa, atau oxidative kondisi, dan panas atau etanol Bakteri ini hanya memilikin satu molekul DNA yang berisi seperangkat set kromosom. DNAnya berukuran BP 4214814 (4,2 Mbp) (TIGR CMR). 4,100 kode gen protein. Beberapa keunggulan dari bakteri ini adalah mampu mensekresikan antibiotik dalam jumlah besar ke luar dari sel (Scetzer, 2006). Menurut Kenneath tahun (2008), Escherichia coli termasuk dalam famili Enterobacteraceae yang termasuk gram negatif dan berbentuk batang yang fermentatif. E. coli hidup dalam jumlah besar di dalam usus manusia, yaitu membantu sistem pencernaan manusia dan melindunginya dari bakteri patogen. Akan tetapi pada strain baru dari E.coli merupakan patogen berbahaya yang menyebabkan penyakit diare dan sindrom diare lanjutan serta hemolitik uremic (hus). Peranan yang mengguntungkan adalah dapat dijadikan percobaan limbah di air, indikator pada level pencemaran air serta mendeteksi patogen pada feses manusia yang disebabkan oleh Salmonella typhi. (Mc. Clenny, 2008). Endospore adalah organisme yang dibentuk dalam kondisi yang stres karena kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut di lingkungan sampai kondisi menjadi baik (Ncbi, 2008). Bakteri juga dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan gram. Teknik pewarnaan gram tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu. Bakteri
gram negatif ditandai dengan pewarnaan ungu sedangkan yang positif berwarna merah (Textbook, 2008). Pengenalan bentuk mikroba (morfologi), kecuali mikroalgae harus dilakukan pewarnaan terlebih dahulu agar dapat diamati dengan jelas (Lubis dkk, 2007). Pada umumnya bakteri bersifat tembus cahaya, hal ini disebabkan karena banyak bakteri yang tidak mempunyai zat warna (Waluyo, 2004). Tujuan dari pewarnaan adalah untuk mempermudah pengamatan bentuk sel bakteri, memperluas ukuran jazad, mengamati struktur dalam dan luar sel bakteri, dan melihat reaksi jazad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat fisik atau kimia jazad dapat diketahui (Lubis dkk, 2007). Berhasil tidaknya suatu pewarnaan sangat ditentukan oleh waktu pemberian warna dan umur biakan yang diwarnai (umur biakan yang baik adalah 24 jam). Umumnya zat warna yang digunakan adalah garam-garam yang dibangun oleh ion-ion yang bermuatan positif dan negatif dimana salah satu ion tersebut berwarna. Zat warna dikelompokkan menjadi dua, yaitu zat pewarna yang bersifat asam dan basa. Jika ion yang mengandung warna adalah ion positif maka zat warna tersebut disebut pewarna basa. Dan bila ion yang mengandung warna adalah ion negatif maka zat warna tersebut disebut pewarna negatif (Ramona, 2008). Beberapa jenis pewarnaan antara lain adalah pewarnaan langsung dengan pewarnaan basa, pewarnaan tidak langsung atau pewarnaan negatif dengan pewarnaan asam, pewarnaan gram, dan pewarnaan endospora. Pewarna basa akan mewarnai dinding sel bakeri yang relatif negatif, contohnya metiline blue dan kristal violet. Sedanglan pada pewarnaan tidak langsung, yang terwarnai adalah lingkungan sekitar sel, tetapi tidak mewarnai sel karena daya mewarnai pada zat ini berada pada ion negatif dan tidak bereaksi dengan ion negatif lainnya dari sel bakteri (Ramona, 2008). Bakteri merupakan organisme yang paling banyak jumlahnya dan lebih tersebar luas dibandingkan mahluk hidup yang lain.
Bakteri memiliki ratusan ribu spesies yang hidup di darat hingga lautan dan pada tempat-tempat yang ekstrim. Bakteri ada yang menguntungkan tetapi ada pula yang merugikan. Bakteri memiliki ciri-ciri yang membedakannya dengan mahluk hidup yang lain. Bakteri adalah organisme uniselluler dan prokariot serta umumnya tidak memiliki klorofil dan berukuran renik (mikroskopis). a. Morfologi Bakteri Secara harafiah, morfologi berarti 'pengetahuan tentang bentuk' (morphos). Morfologi dalam cabang ilmu biologi adalah ilmu tentang bentuk organisme, terutama hewan dan tumbuhan dan mencakup bagian-bagiannya. Morfologi bakteri dapat dibedakan menjadi dua yaitu : 1. Morfologi makroskopik (Kolonial morfologi) Karakteristik koloni : pengamatan pada plate agar Colony's Shape, Ukuran, Edge / Margin, Chromogenesis / pigmentasi, Opacity, Ketinggian, Permukaan, Konsistensi, Emulsifiability, Bau 2. Morfologi mikroskopis (Seluler morfologi) Struktur sel bakteri : pengamatan di bawah mikroskop dinding sel, membran plasma, sitoplasma, ribosom, DNA, dan granula penyimpanan, kapsul, flagelum, pilus(pili), klorosom, Vakuola gas dan endospora b. Morfologi Makroskopik Populasi bakteri tumbuh sangat cepat ketika mereka disertakan dengan gizi dan kondisi lingkungan yang memungkinkan mereka untuk berkembang. Melalui pertumbuhan ini, berbagai jenis bakteri kadang-kadang akan menghasilkan koloni yang khas dalam penampilan. Beberapa koloni mungkin akan berwarna, ada yang
berbentuk lingkaran, sementara yang lain tidak teratur. Karakteristik koloni (bentuk, ukuran, warna, dll) yang diistilahkan sebagai "koloni morfologi". Morfologi koloni adalah cara para ilmuwan dapat mengidentifikasi bakteri. Morfologi koloni dapat ditinjau dari berbagai aspek, yaitu : Shape : Bentuk Edge : Tepi;pinggir Elevation : Ketinggian Size : Ukuran Surface : Permukaan Consistency : Kekentalan ; kepadatan Odor : Bau Opacity : Transparansi Chromogenesis : Pigmentasi b. Morfologi mikroskopik Morfologi mikroskopik adalah karakteristik bakteri yang dilihat melalui pengamatan dibawah mikroskop. Bentuk bakteri sangat bervariasi, tetapi secara umum ada 3 tipe, yaitu : 1. Bentuk batang / basil. 2. Bentuk bulat / kokus 3. Bentuk spiral / spirilium.
Variasi bakteri atau koloni bakteri dipengaruhi oleh arah pembelahannya, umur, dan syarat pertumbuhan tertentu misalkan makanan, suhu, dan keadaan yang tidak menguntungkan bakteri. Bentuk basil (batang) Dibedakan atas: 1. Basil tunggal, berupa batang tunggal, contohnya Escherchia coli dan Salmonella typi. 2. Diplobasil; berbentuk batang bergandengan dua-dua. 3. Streptobasil; berupa batang bergandengan seperti rantai, contohnya Streptobacillus moniliformis dan Azotobacter sp. b) Bentuk bulat (kokus)
Bakteri berbentuk bulat (kokus = sferis/tidak bulat betul) dibagi mejadi bentuk- bentuk sebagai berikut: 1. Monokokus,berbentuk bulat, satu-satu, contohnya Monococcus gonorhoe. 2. Diplokokus, bentuknya bulat bergandengan dua-dua, misalnya Diplococcus pneumonia. 3. Streptokokus, memiliki bentuk bulat bergandengan seperti rantai, sebagai hasil pembelahan sel kesatu atau dua arah dalam satu garis. 4. Tetrakokus, berbentuk bulat terdiri 4 sel yang tersusun dalam bentuk bujur sangkar sebagai hasil pembelahan sel kedua arah. 5. Sarkina, berbentuk bulat terdiri atas 8 sel yang tersusun dalam bentuk kubus sebagai hasil pembelahan sel ketiga arah, contohnya Sarcia sp. 6. Stafilokokus, berbentuk bulat, tersusun seperti kelompok buah anggur sebagai hasil pembelahan sel ke segala arah. 7. Mikrococcus, jika kecil dan tunggal c) Bentuk Spiral
Di bagi menjadi: 1. Koma (vibrio); berbentuk lengkungan kurang dari setengah lingkaran, contoh nya Vibrio coma, penyebab penyakit kolera. 2. Spiral; berupa lengkunagn lebih dari setengah lingkaran, contohnya Spirillium minor yang menyebabkan demam dengan perantara gigitan tikus atau hewanpengerat lainnya. 3. Spiroooseta; berupa spiral yang halus dan lentur, contohnya Treponema pallisum, penyebab penyakit sifilis. Bentuk tubuh bakteri dipengaruhi oleh keadaan lingkungan, medium dan usia. Oleh karena itu untuk membandingkan bentuk serta ukuran bakteri, kondisinya harus sama. Pada umumnya bakteri yang usianya lebih muda ukurannya relatif lebih besar daripada yang sudah tua. C. ALAT DAN BAHAN ALAT : a. Obyek glass b. Cover glass c. Mikroskop d. Ose e. Bunsen f. Penjepit BAHAN : a. Biakan kuman murni g. Kapas b. Gram A (Carbol gentian violet) h. minyak imersi c. Gram B ( Iodium) i. Xilol d. Gram C (Alkohol) e. Gram D (Safranin) f. Air
D. CARA KERJA PEWARNAAN GRAM Obyek glass (Aseptiskan) Ambil biakan murni 1-2 ose (setipis mungkin) Fiksasi Letakkan dibak pengecatan Ditetesi dengan KV(gram A) hingga tercelup Dicuci dengan air mengalir Tetesi gram B(mordan) 30 detik Cuci air mengalir Tetesi gram C Cuci air mengalir Tetesi alkohol Cuci (keringkan) Tetesi gram D(safranni) 1 menit Cuci den keringkan Amati mikroskop 40x-100x
MORFOLOGI BAKTERI Obyek glass (tetesi 1 tetes laktofenol) 1 ose takar jamur Tetes 1 tetes alkohol Tutp deckglass Amati dengan mikroskop 10x-40x E. HASIL PENGAMATAN 1. PEWRANAAN GRAM Nama Bakteri Gambar Pewarnaan Gram dan bentuk Bentuk Basil/batang Susunan bakteri (diplobasil) Bascillus sp. Warna merah muda (gram negatif)
2. MORFOLOGI KAPANG Nama Kapang Gambar Morfologi Bentuk pohon atau kipas Warna hijau Kepala konidia uniseriate Aspergillus sp. konidia seperti rantai F. PEMBAHASAN Pewarnaan Gram (metode Gram) adalah suatu cara untuk mewarnai sel bakteri menggunakan zat warna berupa Gram, untuk lebih mudah diamati dibawah mikroskop untuk mengetahui sifat fisiologisnya. Empat bahan reaksi yang digunakan untuk pewarnaan Gram yaitu: 1. Carbol gentian violet, pewarna pertama (warna ungu). 2. Iodium, pewarna untuk mempertajam pewarna pewarna pertama (suatu kompleks dengan crystal violet). 3. alkohol, penghilang warna. 4. Safranin, suatu counterstain. Setelah melakukan berbagai proses pengecatan diatas maka bakteri dapat dibagi menjadi dua katagori utama yaitu bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif. Bakteri Gram positif adalah bakteri yang tahan terhadap alkohol sehingga
tetap mengikat warna cat pertama dan tidak mengikat zat kontras sehingga bakteri akan berwarna ungu. Sedangkan bakteri Gram negatif adalah bakteri yang tidak tahan terhadap alkohol sehingga warna cat pertama dilunturkan dan bakteri mengikat warna kontras sehingga tampak merah. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan tidak kontras dengan air, di mana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Oleh karena itu pengamatan tanpa pewarnaan menjadi lebih sukar dan tidak dapat digunakan untuk melihat bagianbagian sel dengan teliti. Pewarnaan akan menyebabkan bakteri-bakteri tersebut kontras berwarna dengan sekelilingnya, sehingga akan terlihat jelas. Pada pewarnaan gram, sampel yang digunakan adalah bakteri Bascillus sp. Untuk pewarnaan bakteri secara langsung, digunakan empat larutan pewarna yaitu Carbol gentian violet, Iodium, Alkohol, safranin. Hasil yang didapatkan setelah diamati dengan mikroskop dengan perbesran 40x-100x didapatkan dari bakteri Bascillus sp. adalah bakteri gram positif. Hal ini ditandai dengan terbentuknya warna ungu pada pewarnaan tahap akhir menggunakan Safranin pada bakteri bascillus sp.dan berbentuk batang/basil. Bascillus sp. merupakan salah satu bakteri berbentuk batang (basil) yang termasuk Gram positif karena Bascillus sp. dapat menahan zat pewarna ungu (crystal violet) ketika dicuci dengan zat penghilang warna. Sehingga warna tetap ungu ketika ditetesi pewarna safranin. Pada bakteri gram postif akan terbentuk persenyawaan kompleks Kristal yodium-violet ribonukleat yang tidak larut dalam larutan pemucat alkohol karena sebagian besar dinding sel bakteri gram positif terdiri dari peptidoglikan. Penambahan zat pewarna safranin tidak menyebabkan perubahan warna pada bakteri Gram positif karena persenyawaan Kristal violet yodium tetap terikat pada dinding sel. Akan tetapi pada pengamatan Bascillus sp terlihat juga bakteri dengan bentuk berbeda yang merupakan kontaminan. Adanya kontaminan ini kemungkinan disebabkan pada saat pemindahan isolat ke kaca objek terjadi kontaminasi karena kurangnya pemanasan jarum ose pada saatpengambilan
biakan sehingga masih ada bakteri lain dari udara yang ikut dalam apusan atau telah terkontaminasinya isolat bakteri yang digunakan. Pada pengamatan morfologi kapang pada roti yang sudah berjamur dilakukan pengamatan menggunakan mikroskop dengan perbesaran 10x-40x diperoleh kapang jenis aspergillus. Pengamatan dimulai dengan meneteskan larutan laktofenol pada obyek glass agar mempermudah mengamati kapang yang diletakkan pada obyek glass. Penggunaan laktofenol bertujuan untuk mempermudah melihat jamur, apabila berwarna biru menunjukkan positif, apabila berwarna merah berarti negatif. Pengamatan yang dilakukan pada jamur roti setelah ditetesi laktofenol berwarna biru. Kemudian mengambil 1 ose kapang pada roti dan ditetesi alkohol. Alkhol berfungsi sebagai penghilang warna. Setelah ditetesi alkohol tetap berwarna biru dan bersifat gram positif. Kemudian dilakukan pengamatan dengan mikroskop dan didapatkan kapang jenis Aspergillus sp, terdapat 4 bagian yaitu, hifa, Strigma, konida dan konidiofor, dan berbentuk pohon atau kipas, warna hijau, kepala konidia uniseriate, konidia seperti rantai.
G. KESIMPULAN 1. Pewarnaan Gram pada bakteri dilakukan dengan cara obyek glass di asepstiskan, diambil biakan murni bakteri dan dilakukan fiksasi. Setelah itu bakteri ditetesi Carbol gentian violet, pewarna pertama (warna ungu) sebagai pewarna primer, Iodium sebagi pewarna sekunder, alkohol sebagai pemucat, dan safranin sebagai pembanding. Sebelum ditetesi larutan ke-2 dicuci air mengalir dan dikeringkan. 2. Pada pewarnaan bakteri ada bakteri gram positif dan dan gram negatif. Bakteri gram postif merupakan bakteri yang mampu menahan kompleks pewarna primer carbol gentian violet sampai akhir pewarnaan, sehinga bakteri tetap berwarna ungu/biru, karena bakteri garam postif memilki diniding sel berupa petidoglikan yang tebal. Sedangkan bakteri Gram negatif adalah bakteri yang tidak tahan terhadap alkohol sehingga warna cat pertama dilunturkan dan bakteri mengikat warna kontras sehingga tampak merah. 3. Morfologi bakteri antara lain memiliki kapsul, dinding sel, membrane sel, pili, flagella, kromosom, plasmid, ribosom. 4. Berdasarkan berntuknya, bakteri dibagi menjadi tiga golongan besar, yaitu: a. Kokus (Coccus) dalah bakteri yang berbentuk bulat seperti bola, dan mempunyai beberapa variasi sebagai berikut: Monococcus,Diplococcus, Tetracoccus, Sarcina, Staphylococcus, Streptococcus. b. Basil (Bacillus) adalah kelompok bakteri yang berbentuk batang atau silinder, dan mempunyai variasi sebagai berikut: Diplobacillus, Streptobacillus. c. Spiril (Spirilum) adalah bakteri yang berbentuk lengkung dan mempunyai variasi sebagai berikut: Vibrio, Spiral.
H. DAFTAR PUSTAKA Chiu, Annie. 2010. Aspergillosis. http://emedicine.medscape.com/article/1092247-overview 29 April 2011. Jawetz, E., J.L. Melnick, dan E.A. Adelberg. 2005. Mikrobiologi kedokteran. Penerbit Buku Kedokteran. Jakarta. Lubis, R.D. 2008. Aspergilosis. http://repository.usu.ac.id/bitstream/123456789/3432/1/08e00886.pdf diakses tanggal 27 April 2011 pukul 21.34. Martinko JM, Madigan MT (2005). Brock Biology of Microorganisms (edisi ke- 11th ed.). Englewood Cliffs, N.J: Prentice Hall. ISBN 0-13-144329-1 Morphological Characteristics dalam Pak J Med Sci 2007 Vol. 23 No. 6 http://www.pjms.com.pk/issues/octdec207/pdf/aspergillus.pdf diakses tanggal 28 april 2011 pukul 12.34. McClenny, N. 2005. Laboratory detection and identification of Aspergillus species by microscopic observation and culture: the traditional approach dalam Medical Mycology Supplement 1 2005, 43, S125-/S128 http://www.aspergillus.org.uk/secure/articles/pdfs/16110804.pdf Waluyo. L.2004. Mikrobiologi Umum. UMM Press. Malang