3. BAHAN DAN METODE 3.1 Waktu dan Lokasi Penelitian Penelitian ini dilakukan pada bulan Mei Juli 2010 di Laboratorium PT. Suri Tani Pemuka (Japfa), Unit Hatchery Udang Vannamei, Jalan Raya Gilimanuk km 35, Desa Pemutaran, Kecamatan Gerokgak, Kabupaten Singaraja, Propinsi Bali. 3.2 Alat dan Bahan Alat dan bahan yang digunakan pada penelitian ini disajikan pada Tabel 1. Tabel 1. Alat dan bahan yang digunakan pada penelitian Alat dan Bahan Spesifikasi Unit/Satuan Aerator Indoor Tekno Takatsuki 1/ - Autoklaf - 1/ Celcius Bambu 50 cm x 2 cm 3/ - Batu Aerasi - 36/ - Blower (Aerator Outdoor) 12 hp 2/ - Botol Gelas 1 L 9/ - Boks Stirofom Garuda Approved 73 x 42 x28.5 12/ - Bulb Assistent 2/ - Bunsen - 1/ - Erlenmeyer Schott Duran 250 ml 2/ - Erlenmeyer Schott Duran 500 ml 1/ - Filter bertingkat Hayward Pro Series 2/ - Filter ozon - 1/ - Filter UV - 1/ - Galon Aqua 19 L 3/ - Gelas Beker Schott Duran 150 ml 2/ - Gelas Ukur 50 ml Pyrex 2/ - Gelas Ukur 100 ml Pyrex 2/ - Gelas Ukur 1 L Pyrex 2/ - Haemocytometer Assistant (Neubauer) 25x10-4 mm 2 1/ sel/ml Hotplate Labinco L-32 1/ Celcius Kran Aerator - 24/ - Lampu TL Philips Lifemax TLD 36 watt 9/ - Luxmeter Konica Minolta T-10 Illuminance 1/ Lux Mikroskop Olympus CH-BI45-2 1:200x 1/ - Oven Memmert 1/ Celcius ph meter Eutech Cyberscan ph 310 1/ - Pipa Kaca - 3/ - 22
23 Tabel 1. Alat dan bahan yang digunakan pada penelitian (Lanjutan) Alat dan Bahan Spesifikasi Unit/Satuan Pipet mohr Pyrex 1 ml 3/ ml Pipet mohr Pyrex 5 ml 3/ ml Pipet mohr Pyrex 10 ml 3/ ml Pipet tetes - 3/ - Pipet Volumetrik Pyrex 10 ml 1/ - Pipet Volumetrik Pyrex 25 ml 1/ - Refraktometer Hand Refraktometer Atago 1/ - Selang aerasi - 45 meter/ - Sendok Plastik - 9/ - Sprayer 1 L 1/- Tabung reaksi Pyrex 16 x 150 ml 9/ - Teko Ukur Lion Star 600 ml 1/ - Teko Ukur Lion Star 1 L 2/ - Thermometer Air Raksa (Hg) 1/ Celcius Timbangan analitik AND EK-3000i 1/ gram Toples Plastik Jumbo 5 L 12/ - Wadah Es Krim 100 ml 3/ - Wadah Es krim 75 ml 12/ - Pipa Paralon ¾ inch 10 meter/ - Air laut - 800 L/ - Air Tawar - 200 L/ - Akuades - 10 L/ - Alkohol 100% 1 L / - Alumunium foil - 1/ - Azumit - 2.5 gram/ - Bibit Chaetoceros gracilis - 1/ - Bibit Skeletonema costatum - 1/ - Bibit Thalasiossira sp. - 1/ - EDTA - 25 gram/ - FeCl - 2 gram/ - HCl 10% 2 L/ - Klorin 12% 5 L/ - KNO 3-50 gram/ - Natrium tiosulfat 25% 3 L/ - Na 2 PO 4-4 gram/ - Pupuk analis F2 dan vitamin mix 2 L/ - Silikat - 10 gram/ - Tipol - 1 L/ -
24 3.3 Prosedur Penelitian Prosedur penelitian dilakukan secara bertahap untuk mencapai hasil yang baik dan benar. Prosedur penelitian yang dilakukan pada proses kultivasi secara umum terdiri dari sterilisasi alat dan bahan, persiapan media, proses kultivasi, dan penghitungan kelimpahan. Prosedur penelitian yang dilakukan disajikan pada Gambar 5. Sterilisasi Alat dan Bahan Klorinasi Perendaman HCl Pemanasan Persiapan Media Penurunan Salintas Pemberian Pupuk Proses Kultivasi Penuangan Bibit Penghitungan Parameter Fisika dan Kimia Penghitungan Kelimpahan Analisis Data Laju Pertumbuhan Uji Validitas Pearson Gambar 5. Diagram alir prosedur penelitian kultivasi diatom 3.3.1 Sterilisasi Alat dan Bahan Sterilisasi merupakan suatu metode yang dilakukan untuk membersihkan peralatan dan media yang digunakan untuk kultivasi dari hal-hal yang dapat
25 menggangu pertumbuhan mikroalga yang dikultivasi. Sterilisasi bertujuan untuk membersihkan alat serta bahan yang akan digunakan untuk isolasi maupun kultivasi mikroalga dari mikroorganisme ataupun bahan kimia yang dapat mengganggu pertumbuhan mikroalga. Sterilisasi dalam kultivasi mikroalga skala indoor terdiri atas sterilisasi ruang, peralatan kultivasi, dan media cair. Sterilisasi ruang dilakukan dengan cara menyiapkan ruang dan rak yang akan digunakan sebagai laboratorium kultivasi. Ruangan dibersihkan dari debu dan kotoran lainnya dengan cara menyapu, mengelap, dan mengepel ruangan, termasuk rak kultivasi hingga bersih dengan menggunakan larutan klorin 1%. Terakhir, ruangan yang sudah bersih dan kering disemprot alkohol 70% menggunakan sprayer. Peralatan kultivasi yang disterilisasi meliputi peralatan gelas, peralatan plastik, selang dan wadah kultivasi. Peralatan kultivasi mula-mula disterilisasi dengan cara mencuci terlebih dahulu dengan tipol yang kemudian dibilas dengan air tawar. Kemudian dilakukan perendaman dengan HCl 0.2% selama 24 jam dan dibilas kembali dengan air tawar. Sterilisasi alat-alat gelas dilanjutkan dengan menggunakan oven pada suhu 120 o C selama 1,5 jam. Sedangkan untuk sterilisasi selang aerasi dan batu aerasi dilakukan pada autoklaf dengan suhu 121 o C selama 15 menit. Peralatan gelas yang telah dipanaskan kemudian dikeringkan dan dibungkus dengan alumunium foil. Sterilisasi peralatan yang tidak tahan panas dan berukuran besar, misalnya galon dan toples plastik, dilakukan dengan merendamnya dalam larutan klorin 40 ppm. Sterilisasi media cair dilakukan dengan menggunakan penembakan sinar UV dan ozonisasi yang terlebih dahulu dilakukan filtrasi bertingkat 50 µm, 10
26 µm, 5 µm, dan 2 µm. Sterilisasi media cair untuk fase test tube, Erlenmeyer, dan botol kaca menggunakan autoklaf dengan cara dipanaskan pada suhu 121 o C kurang lebih selama 1 jam untuk mensterilkan 10 L media cair. Kemudian Media cair disimpan dalam wadah steril yang tertutup rapat. Sterilisasi media cair untuk fase toples dan galon juga dilakukan menggunakan filter bertingkat 50 µm, 10 µm, 5 µm, 2 µm namun hanya diklorinasi dengan konsentrasi 25 ppm dan diaerasi selama 24 jam. Kemudian media cair tersebut dinetralisir dengan natrium tiosulfat 25 ppm untuk menghilangkan kandungan klorin pada media cair tersebut. Pupuk yang digunakan pada kultivasi indoor disterilisasi dengan menggunakan autoklaf yang sama halnya dengan media cair yang digunakan pada fase test tube, Erlenmeyer, dan botol kaca. Sterilisasi laboran dilakukan dengan menyemprotkan alkohol 70% pada kedua tangan untuk menghindari kontaminasi pada mikroalga ketika laboran berinteraksi dengan kultivan. Sama halnya dengan sistem indoor, sterilisasi pada sistem outdoor terbagi menjadi sterilisasi ruang dan bak, sterilisasi peralatan kultivasi, dan sterilisasi media cair. Sterilsasi mula-mula dilakukan dengan cara menyiapkan ruang dan bak yang akan digunakan. Ruangan dan bak dibersihkan dari debu dan kotoran lainnya dengan cara mencuci, membilas, dan mengelap ruangan beserta bak yang akan digunakan untuk kultivasi hingga bersih menggunakan cairan klorin 1%. Ruang dan bak dikeringkan dengan cara dijemur langsung di bawah sinar matahari selama satu hari. Peralatan kultivasi yang disterilisasi meliputi peralatan gelas, peralatan plastik, selang dan wadah kultivasi. Peralatan kultivasi mula-mula disterilisasi dengan cara mencuci terlebih dahulu dengan tipol yang kemudian dibilas dengan
27 air tawar. Kemudian dilakukan perendaman dengan HCl 0,2% selama 24 jam dan dibilas kembali dengan air tawar. Sterilisasi alat-alat gelas dilanjutkan dengan menggunakan oven pada suhu 120 o C selama 1,5 jam. Sterilisasi selang dan batu aerasi dilakukan dengan perendaman menggunakan larutan HCl 10% selama 24 jam. Peralatan gelas yang telah dipanaskan kemudian dikeringkan dan dibungkus dengan alumunium foil. Sterilisasi peralatan yang tidak tahan panas dan berukuran besar misalnya boks stirofom dilanjutkan dengan melakukan perendaman menggunakan larutan klorin dengan konsentrasi 40 ppm. Sterilisasi media cair dilakukan dengan menggunakan ozonisasi yang terlebih dahulu dilakukan filtrasi bertingkat 50 µm, 10 µm, 5 µm, dan 2 µm dan diklorinasi dengan konsentrasi 50 ppm yang diaerasi selama 24 jam. Kemudian media cair tersebut dinetralisir dengan natrium tiosulfat 50 ppm untuk menghilangkan kandungan klorin pada media cair tersebut. Pupuk yang digunakan pada kultivasi outdoor juga disterilisasi dengan menggunakan autoklaf yang sama halnya seperti pupuk yang digunakan pada sistem indoor. 3.3.2 Persiapan Media Media air untuk fase botol gelas 1 L dan Erlenmeyer 250 ml pada sistem indoor dibuat dengan cara menurunkan salinitas air laut menjadi 28 dengan menambahkan air tawar atau akuades terlebih dahulu. Kemudian dilanjutkan dengan sterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121 o C selama 15 menit. Setelah dingin, air dapat digunakan sebagai media kultivasi mikroalga. Media air untuk fase toples dan galon pada sistem indoor dipersiapkan dengan cara menembakan sinar UV, ozonisasi, dan menyaring air laut dengan filter bertingkat terlebih dahulu. Kemudian air laut dimasukan ke dalam toples
28 dan galon dan disterilisasi menggunakan klorin 25 ppm. Sebelum digunakan sebagai media kultivasi, air laut diaerasi selama 24 jam dan dinetralkan klorinnya dengan cara menambahkan natrium tiosulfat 25 ppm. Media yang digunakan dalam sistem outdoor adalah air laut dengan salinitas 28. Air laut yang digunakan terlebih dahulu dilakukan penyaringan secara bertingkat dan penembakan sinar UV. Kemudian, media disterilisasi dengan klorin sebanyak 50 ppm dan selanjutnya diaerasi, keesokan harinya dinetralkan dengan natrium tiosulfat 50 ppm. 3.3.3 Proses Kultivasi Kultivasi mikroalga pada penelitian ini disajikan pada Gambar 6. Kultur pada Tes Tube 10 ml Kultur pada Erlenmeyer 250 ml Kultur pada Botol Kaca 1 L Sistem Indoor Kultur pada Galon 10 L Kultur pada Toples 4 L Kultur pada Galon 18 L Pengamatan Kelimpahan Harian Kultur pada Bak Stirofom 45 L Sistem Outdoor Gambar 6. Diagram alir kultivasi diatom
29 Proses kultivasi sistem indoor memiliki beberapa tahapan. Kultivasi pada Erlenmeyer dilakukan dengan cara menyiapkan Erlenmeyer ukuran 250 ml. Strain yang berasal dari test tube dipindahkan pada Erlenmeyer yang berukuran 250 ml sebanyak 10% dari volume media dan diisi air laut hingga mencapai 200 ml dan ditutup dengan alumunium foil. Setelah 7 hari strain dipindahkan ke botol kaca yang berukuran 1 L dengan persentase 10% strain mikroalga dari botol kaca. Setelah 3 hari mikroalga siap dipindahkan ke galon dengan media sebanyak 10 L dan juga dengan persentase 10% dari media air pada galon. Setelah 3 hari, strain pada media galon dipindahkan ke toples dengan volume media 4 L. Strain yang dituangkan sebanyak 10% dari media yang digunakan pada toples yaitu 400 ml. Volume inilah dilakukan pengamatan selama 15 hari dengan 3 kali pengulangan. Proses kultivasi pada sistem outdoor merupakan tahapan lanjutan dari sistem indoor. Kultivasi sistem outdoor diawali dengan penuangan strain sebanyak 10% dari ukuran bak yang digunakan pada kultivasi. Media air yang akan digunakan pada sistem outdoor memiliki volume 45 L sehingga strain yang dituang adalah sebanyak 4,5 L. Strain mikroalga yang dituang berasal dari kultivasi pada sistem indoor. Sistem outdoor juga dilakukan pengamatan selama 15 hari dan juga dilakukan sebanyak 3 kali pengulangan. 3.3.4 Penghitungan Kelimpahan Mikroalga (Jumlah Sel) Monitoring kelimpahan dilakukan sebanyak 1 kali dalam 24 jam dan dimulai pada hari ke-0 (t 0 ) hingga hari ke-15 (t 15 ). Monitoring kelimpahan dilakukan pada setiap sampel spesies dan pada kedua sistem (indoor dan outdoor). Tujuan monitoring kelimpahan adalah mengetahui jumlah sel dan laju
30 pertumbuhan mikroalga dengan menghitung nilai kelimpahannya. Peralatan yang digunakan adalah mikroskop dan Haemocytometer. Monitoring kelimpahan dilakukan dengan melihat jumlah mikroalga pada kotak kecil Haemocytometer yang dilakukan pada 5 titik pandang dan 3 kali ulangan. Adapun formulasi yang digunakan ada pada persamaan (1).... (1) Dimana N adalah jumlah sel mikroalga yang teramati 3.3.5 Pengukuran Parameter Fisika dan Kimia Media Pengukuran parameter fisika dan kimia dilakukan pada toples yang berisi media air laut sebanyak 4 L dan pada bak stirofom yang berkapasitas 45 L. Parameter fisika yang diukur adalah suhu, salinitas, dan cahaya, sedangkan parameter kimia yang diukur adalah ph. Pengukuran suhu, salinitas dan ph dilakukan dilakukan sebanyak 1 kali dalam 24 jam dan dimulai pada hari ke-0 (t 0 ) hingga hari ke-15 (t 15 ). Pengukuran cahaya yang dilakukan pada sistem indoor hanya 1 kali sedangkan pada sistem outdoor sebanyak 9 kali dalam waktu 24 jam, dengan rentang waktu 1 jam pada pukul 09.00 18.00 WITA. 3.4 Analisis Data Analisis data dilakukan dengan cara membandingkan kepadatan pada ketiga spesies diatom (Chaetoceros gracilis, Skeletonema costatum, dan Thalassiosira sp.) dan juga pada kedua sistem (sistem indoor dan sistem outdoor. Perbandingan tersebut digambarkan dengan menggunakan grafik, laju pertumbuhan spesifik (µ), dan laju pertumbuhan spesifik maksimum (µ maks ). Kualitas air dianalisis
31 menggunakan uji validitas Pearson untuk melihat korelasi yang terjadi dan uji lanjut regresi untuk melihat pengaruh parameter kualitas air terhadap kelimpahan dengan selang kepercayaan 0,05. Laju pertumbuhan spesifik (µ) mikroalga dihitung dengan rumus menurut Krichnavaruk et al (2004), pada persamaan (2)....(2) Dimana N t adalah kepadatan populasi pada waktu ke-t, N 0 adalalah kepadatan populasi sel pada waktu 0, T 0 adalah waktu awal dan T t adalah waktu pengamatan. Laju pertumbuhan spesifik maksimum (µ maks ) dihitung dari kelimpahan pada saat awal kultivasi hingga puncak kelimpahan maksimum, dimana N t adalah puncak kelimpahan maksimum, N 0 adalah kelimpahan pada awal kultivasi sedangkan T t adalah waktu pada saat kelimpahan maksimum dan T 0 adalah kelimpahan pada saat awal kultivasi.