BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1. Hasil 4.1.1. Uji Fitokimia daun Artabotrys sp Analisis uji fitokimia terhadap daun Artabotrys sp menunjukkan hasil positif terhadap senyawa golongan terpenoid/steroid, fenolik dan flavonoid. Uji steroid ditandai wama hijau/ungu setelah penambahan reagen Liebermann- Burchard. Uji fenolik ditandai dengan terbentuknya endapan hitam setelah penambahan FeCls, sedangkan uji flavonoid ditandai dengan terbentuknya wama merah setelah penambahan HCl pekat dan logam Mg. 4.1.2. Isolasi senyawa dari daun Artabotrys sp Serbuk halus daun Artabotrys sp sebanyak 1.400 gram dimaserasi dengan pelarut metanol. Hasil maserasi setelah diuapkan dengan alat rotary evaporator didapatkan ekstrak total metanol sebanyak 117,353 gram yang berwama hijau kehitaman. Ekstrak metanol dipartisi dengan heksan, etilasetat dan butanol p.a. maka dihasilkan ekstrak total heksana sebanyak 19,592 gram. Ekstrak etilasetat sebanyak 8,115 gram dan ekstrak total butanol sebanyak 14,501 gram. Fraksi air/metanol berwama merah kecoklatan sebanyak 542,813 gram. 4.1.3. Pemeriksaan ekstrak total heksana, etilasetat, butanol dan metanol dengan KLT Terhadap ektrak total heksana, etilasetat, butanol dan metanol masingmasing dilakukan analisis KLT untuk menentukan jumlah komponen senyawa yang ada didalamnya dan menentukan perbandingan eluen yang sesuai. Hasil uji KLT dapat dilihat pada Tabel 1, sedangkan kromatogramnya dapat dilihat pada Lampiran 2. 29

Tabel. 1. Hasil Uji KLT ekstrak heksana, etilasetat, butanol dan metanol dengan perbandingan pelarut yang berbeda. No Perbandingan eluen Heksana Harga Rf EtOAc BuOH MeOH 1. Heksan: etilasetat (9:1) Rf=0 Rf=0 Rf=0 Rf=0 2. Heksan : etilasetat (5:5) Rf=0 Rf=0 Rf=0 Rf=0 3. Heksan: etilasetat (3:7) Rf=0 Rf 1=0,3 Rf=0,16 Rf=0,2 Rf2 = 0,18 4. Heksan: Etilasetat (2:8) Rf=0 Rfi= 0,4 Rf = 0,28 Rf = 0,3 Rf2 = 0,3 5. Etilasetat (100%) Rf=0 Rf=0,9 Rf=0 Rfi = 0,58 Rf2 = 0,10 Berdasarkan hasil uji KLT di atas terhadap masing-masing ekstrak, didapat ekstrak total etilasetat dengan perbandingan eluen yang baik terlihat pada heksana : etilasetat (3:7) yang menunjukkan 2 noda yang terpisah dengan baik. Untuk memisahkan senyawa yang terkandung pada ekstrak etilasetat maka dilakukan pemisahan dengan kromatografi cair vakum. 4.1.4. Pemisahan dengan kromatografi cair vakum (VLC) Ekstrak etilasetat dilakukan pemisahan dengan kromatografi cair vakum menggunakan 4 gram ekstrak etilasetat dan silika gel TLC preparatif sebanyak 25 gram. Pengelusian dilakukan dengan berbagai eluen yang memiliki kepolaran yang meningkat yaitu dari «-heksan 100%, perbandingan heksan dangan etil asetat dan perbandingan etilasetat dengan metanol sampai 5:5. Hasil kromatografi cair vakum diperoleh 11 fi-aksi. Pelarut yang ada diuapkan hingga kering lalu ditimbang beratnya dan dilakukan uji dengan KLT. Hasil kromatografi cair vakum dapat dilihat pada Tabel 2. 30

Tabel. 2. Hasil kromatografi cair vakum berdasarkan kenaikan kepolaran. No. Fraksi Perbandingan Eluen Berat (g) Keterangan F,-l Heksan (100%) 0 Bening F,-2 Heksan : Etilasetat (8:2) 0 Hijau muda F,-3 Heksan: Etilasetat (6:4) 0,3 Ekstrak Hijau tua F,-4 Heksan: Etilasetat (4:6) 2,4 Ekstrak Hijau lumut +2 Fr5 Heksan: Etilasetat (2:8) 0,3 Ekstrak Hijau lumut +3 F,-6 Etilasetat (100%) 2,2 Padatan Cokiat kehitaman Fr7 Etilasetat: Metanol (9:1) 4,7 Padatan Cokiat kehitaman +2 F,-8 Etilasetat: Metanol (8:2) 4,4 Ektrak Cokiat kehitaman +4 Fr9 Etilasetat: Metanol (7:3) 2,4 Ekstrak Cokiat kehitaman +3 Fi-10 Etilasetat: Metanol (6:4) 1,5 Ekstrak Cokiat kehitaman +2 Fi.ll Etilasetat: Metanol (5:5) 4,8 Ekstrak Cokiat kehitaman +1 4.1.5. Pemeriksaan hasil kromatografi cair vakum dengan KLT Hasil pemisahan dari kromatogarfi cair vakum dilakukan pengujian KLT dengan perbandingan eluen «-heksan : etilasetat (3:7) dan n-heksan : etilasetat (2:8). Hasil yang terbaik terlihat pada perbandingan eluen «-heksan : etilasetat (3:7). Hasil uji KLT dapat dilihat pada Tabel 3 dan Lampiran 3. Tabel 3. Hasil KLT kromatografi cair vakum berdasarkan perbandingan pelarut. No Harga Rf Keterangan Harga Rf Keterangan Heksan: EtOAc Heksan:EtOAc (3:7) (2:8) Frl 0 Tidak ada noda 0 Tidak ada noda F,-2 0 Tidak ada noda 0 Tidak ada noda Fr3 0 Tidak ada noda 0 Tidak ada noda Fr4 Rfi= 0,86; 2 noda terpisah Rf,= 0,90 ; 2 noda terpisah Rf2=0,66 Rf2=0,76 Fr5 Rf=0,56 1 noda Rf = 0,50 1 noda 31

F,-6 Rfi= 0,28 ; Rf2=0,16 Fr7 Rfi= 0,28; Rf2=0,16 Fr7i Rf,= 0,28; Rf2=0,16 F,-8 2 noda terpisah Rf,= 0,46; Rf2=0,34 2 noda terpisah 2 noda terpisah Rfi= 0,46 ; 2 noda terpisah Rf2=0,32 2 noda terpisah Rfi= 0,46 ; 2 noda terpisah Rf2=0,34 2 noda terpisah Rf=0,16 1 noda Rfi=0,10; Rf2=0,16 FrSi 0 Tidak ada noda Rf=0,22 1 noda Berdasarkan hasil VLC didapatkan hasil fraksi yang baik pada fraksi 6 (Fi-6) yang berbentuk padatan berwama cokiat kehitaman. Pada hasil KLT menunjukkan fraksi 6 terdapat noda yang terpisah dengan baik. Pada fraksi 6 dilakukan pemisahan dengan kromatografi radial. 4.1.6. Pemisahan dengan kromatografi radial (Chromatotron) Fraksi 6 (Fi-6) dari hasil VLC sebanyak 0,855 gram dilamtkan dengan pelamt etilasetat. Lamtan ini diteteskan pada alat kromatotron sebanyak ± 3 ml lalu dielusi dengan perbandingan pelamt «-heksan : etilasetat (4:6) dan dilanjutkan dengan etilasetat 100%. Setelah itu dilakukan pencucian dengan metanol: etilasetat (5:5). Hasil tetesan ditampung dan diperoleh sebanyak 48 vial. 4.1.7. Hasil KLT setelah di kromatografi radial Hasil pemisahan kromatotron pada fraksi 6 (Fi-6) dilakukan pengujian menggunakan KLT dengan perbandingan eluen etilasetat: metanol (19 :1). Hasil uji KLT dapat dilihat pada Lampiran 4. Pengujian KLT terhadap hasil kromatotron menunjukkan beberapa vial yang memiliki harga Rf yang sama dapat digabung menjadi satu fraksi. Hasil uji KLT dapat dilihat pada Tabel 4 dan 5 dibawah ini. 32

Tabel. 4. Hasil KLT kromatografi radial dengan pelarut EtOAc :MeOH (19:1) (Lampiran 4). No. Harga Rf Vial EtOAcrMeOH (19:1) Keterangan 1 0-5 0,32 Satu noda 10 0,34 Satu noda 15 0,34 Satu noda 20 Rf,=0,40; Rf2=0,34; Rf3=0,26 Tiga noda terpisah 25 0,36 Satu noda 30 0,32 Satu noda 35 0,34 Satu noda 40 0-45 0 - Tabel. 5. Hasil uji KLT vial nomor 21 sampai 24, 26 sampai 29 dan 36 sampai 38 dengan pelarut EtOAc:MeOH (19:1) (Lampiran 5). No. Vial 21 Harga Rf Rf,=0,42 ; Rf2=0,32 Keterangan 2 noda terpisah 22 Rf,=0,44; Rf2=0,36 2 noda terpisah 23 Rfi=0,44; Rf2=0,32 2 noda terpisah 24 Rf,=0,44; Rf2=0,34 2 noda terpisah 26 Rf,=0,44 ; Rf2=0,36 2 noda terpisah 27 Rfi=0,36; Rf2=0,32 2 noda terpisah 28 Rfi=0,36; Rf2=0,34 2 noda terpisah 29 Rfi=0,36; Rf2=0,28 2 noda terpisah 36 Rfi=0,42 ; Rf2=0,28 2 noda terpisah 37 0,28 Satu noda 38 0,18 Satu noda 33

Hasil uji KLT menunjukkan vial nomor 20, 25, 30 dan 35 mempunyai harga Rf yang sama. Oleh karena itu vial nomor 21 sampai 24, vial nomor 26 sampai 29 dan vial nomor 36 sampai 39 masing-masing diklt dengan eluen etilasetat : metanol (19:1). Hasilnya vial nomor 21 sampai 26 mempunyai harga Rf yang sama dan jumlah noda yang sama. Pada vial nomor 27 sampai 36 juga mempunyai harga Rf yang sama dan jumlah noda masing-masing ada dua. Maka vial nomor 21 sampai 26 digabung menjadi fraksi F2-I dan vial nomor 27 sampai 36 digabung menjadi fraksi F2-2. fraksi-fraksi ini dilakukan pemumian dengan uji KLT preparatif 4.1.8. Hasil uji KLT preparatif Sebanyak 0,0061 gram fraksi F2-I dan 0,0075 gram fraksi F2-2 masingmasing dilakukan uji KLT preparatif Uji ini menghasilkan dua pita pada masingmasing fraksi. Pita ini dikeruk dengan spatula dan dimasukkan ke dalam vial lalu dilarutkan dengan etilasetat dan disaring dengan kapas. Filtrat yang didapat dimasukkan ke dalam vial dan dibiarkan menguap lalu ditimbang beratnya dan diuji KLT. Hasil uji KLT memperlihatkan fraksi F2-I dan fraksi F2-2 terdapat noda dengan harga Rf yang sama, sehingga dapat digabung dan di KLT dengan perbandingan eluen etilasetat: metanol (19 :1). Hasilnya menunjukkan satu noda tunggal dengan harga Rf = 0,44 dan diberi nama senyawa dengan kode ART-1. Senyawa ART-1 berbentuk minyak dan dikarakterisasi menggunakan spektrometer 'H NMR. 4.1.9. Hasil karakterisasi NMR senyawa ART-1 Karakterisasi senyawa ART-1 menggunakan spektroskopi *H NMR. Spektroskopi NMR dilakukan di Laboratorium Centre for Phytochemistry and Pharmacology, Southern Cross University, Australia. Spektrum 'H NMR direkam pada frekuensi 500.13 MHz dengan pelarut kloroform (CHCI3) terdeuterasi. Spektrum 'H NMR memperlihatkan pergeseran kimia proton. 34

- 7.193! - 7.2867-7.0752

4.1.10. Hasil identifikasi GC-MS terhadap ekstrak n-heksan dan ekstrak metanol Sebanyak 1,4235 gram ekstrak «-heksana (AR-H) dan 2,0566 gram ekstrak metanol (AR-M) hasil partisi diidentifikasi menggunakan GC-MS. Hasil spektrum GC-MS dapat dilihat pada Gambar 5 dan Gambar 6 di bawah ini. I- i I ' f >lji: I rj I (J r A^;<^ij i rod Tn.'il riirnont Ml:^(.: V i.j t. Into Niimt>et l>: \ i ; C - M i ; l > A r A \ D A l A \ 0 7 0 1 i ' / \ 0 i ; 0 l O O l. D II Y T 2 7 A p r 0 7 1 2 : 4 0 pm u s i n g A c q M e U h o d I S O - E X T I nt; t r u m e n A R - I I Kbiinclancf TIC:02fll«l1.D 2200000 2100000 2000000 1900000 1800000 1700000 1600000 1500000 1400000 1300000 1200000 1100000 1000000 900000 800000 700000 600000 500000 400000 300000 200000, 100000 139.0C 34 00 3600 38.00 4000 42-00 4400 46:00 48.00 50.00 52.00 5400 5600 58.00 60.00 6200 64.00 66.00 BB.OO 7o!oO Gambar 5. Spektrum ekstrak it-heksan (AR-H) 36

1-L 1 < A(:<iu.i r*-,-d I n s t r i i m e n t wunp t f'li^nt'^ M 1 ;i t: 1 111 o V j,(1 Nijinbt? r I): \GC-M.'JLiA-rA\DATA\0/0'127\0H0J 0 0 1. I) I I Y T 2 7 A p r 2 0 0 7 11:32 u s i n g A c q M e t h o d ISO-EXT 1 n s t r u m o n AR-M ' ^bundai TIC: 0301001 D 4ft35, rime-> 36 00 SgXjO 40,22 izm 4122 46J!!2 46.00 50.00 52 00 54:00 56 00 58.00 Gambar 6. Spektrum ekstrak metanol (AR-M) 37

Berdasarkan informasi Search Libraries: WILEY275, NBS75K dan ADAM yang terdapat pada Centre for Phytochemistry and Pharmacology, Southern Cross University, Lismore, Australia. Pada ekstrak sampel «-heksan (AR-H) dan ekstrak sampel metanol (AR-M) telah dilakukan identifikasi GC-MS menggunakan metoda akuisisi ISO-EXT. Hasilnya dapat dilihat pada Tabel 6 dan 7 di bawah ini. Tabel 6. Hasil Analisis GC-MS pada sampel AR-H dari daun Artabotrys sp No. Waktu Retensi Nama Senyawa % Area t- 1 39.00 (-)-kopaena 0.83 2 40.77 p-karyopilena 8.42 3 42.01 a-karyopilena 1.33 4 46.06 (-)-Spathulenol 0.97 5 46.19 P -karyopilena epoksida 0.32 6 46.37 p -karyopilena epoksida 48.88 7 46.77 Unknown 0.34 8 51.78 neopitadiena 2.53 9 54.25 14-metil, metil pentadekanoat 0.98 10 56.73 metil heptadekanoat 0.19 11 58.55 metil, -9,-12-oktadekadienoat 0.20 12 58.62 Unknown 0.49 13 59.09 metil oktadekanoat 0.40 I _ Tabel 7. Hasil analisis GC-MS pada sampel AR-M dari daun Artabotrys sp No. Waktu Retensi Nama Senyawa % Area 1 40.79 P -karyopilena 7.65 2 42.04 bisiklo [4.2.0] okt-7-ena 1.30 3 46.20 Unknown 1.17 4 48.37 Unknown 7.82 38

4.2. Pembahasan Sampel berupa serbuk halus daun tumbuhan Artabotrys sp sebanyak 1.400 gram dimaserasi dengan menggunakan pelarut polar yaitu metanol. Maserasi merupakan metoda isolasi yang cocok untuk bagian tumbuhan yang lunak seperti bunga dan daun. Maserasi ini dilakukan selama ± 48 jam secara berulang-ulang hingga maseratnya agak jemih. Sebelum disaring hasil maserasi dilakukan ultrasonikasi selama ± 30 menit gunanya untuk mengeluarkan senyawa kimia yang masih ada di dalam sampel dengan cara diletakkan pada alat ultrasonik. Gelombang ultrasonik ini menggetarkan sampel sehingga kandungan yang ada di dalam sampel akan keluar dan larut dengan pelarut metanol. Hasil maserasi ini disaring dengan kapas, filtratnya diuapkan dengan alat rotary evaporator sehingga diperoleh ekstrak kental metanol yang berwama hijau kehitaman sebanyak 117,353 gram. Ekstrak ini dilamtkan dengan 300 ml metanol lalu dipartisi dengan heksan 200 ml yang bertujuan untuk memisahkan senyawa nonpolar dan polar dalam sampel. Setelah dibiarkan sehari semalam tidak nampak pemisahannya maka ditambahkan air 200 ml. Berdasarkan perbedaan kelamtannya, senyawa yang nonpolar akan terdistribusi ke dalam pelamt yang nonpolar yaitu «-heksan, sedangkan senyawa yang bersifat polar akan terdistribusi kepelamt polar yaitu metanol. Partisi ini dilakukan tiga kali dengan volume heksan 200 ml. Hasil partisi yaitu bagian heksan diuapkan dan ditimbang. Maka didapatkan berat total ekstrak n-heksan sebanyak 19,592 gram. Fraksi air (metanol) dipartisi dengan etilasetat 200 ml karena tidak ada pemisahan maka ditambahkan air 150 ml. Partisi ini dilakukan sebanyak tiga kali, hasil partisi yaitu bagian etilasetat diuapkan dan ditimbang sehingga didapat beratnya yaitu 8,115 gram. Fraksi air (metanol) yang tersisa dipartisi lagi dengan butanol p.a 200 ml sebanyak dua kali karena tidak ada pemisahan maka ditambahkan air 200 ml. Hasil partisi bagian butanol diuapkan dan ditimbang maka didapatkan beratnya 14,501 gram. Sebelum dilakukan pemisahan dengan kromatografi cair vakum, terlebih dahulu dilakukan uji KLT terhadap masing-masing ekstrak. Untuk mengetahui jumlah komponen dan perbandingan eluen yang sesuai pada kromatografi cair 39

vakum. Hasil uji KLT terhadap ekstrak etilasetat dapat dilihat pada Tabel 1 dan kromatogramnya pada Lampiran 2, menunjukkan bahwa terdapat dua noda yang terpisah dengan baik pada perbandingan eluen heksan : etilasetat (3:7). Perbandingan eluen heksan:etilasetat (3:7) digunakan imtuk KLT senyawa hasil kromatografi cair vakum. Untuk memisahkan senyawa yang terdapat pada ekstrak etilasetat dilakukan kromatografi cair vakum. Sebelum sampel dimasukkan ke dalam kolom, sampel terlebih dahulu dipreadsorpsi agar silika gel menyerap senyawa yang ada didalam sampel secara merata sehingga proses pemisahan lebih baik. Kepolaran pelarut ditingkatkan secara bergradien dimulai dari tingkat kepolaran yang terendah yaitu heksan 100%, perbandingan heksan dengan etilasetat, sampai etilasetat metanol (5:5) agar pemisahan senyawa-senyawa yang ada di dalam sampel berjalan baik sesuai tingkat kepolarannya. Pengujian hasil pemisahan kromatografi cair vakum terhadap ekstrak etil asetat didapatkan sebelas fraksi, kemudian dilakukan uji KLT terhadap fraksifraksi tersebut (Lampiran 3 dan 4). Pada Fi-6 terdapat dalam bentuk padatan berwama cokiat kehitaman (Tabel 2). Hasil uji KLT menunjukkan noda-noda yang terpisah dengan baik. Sehingga Fi-6 dilanjutkan pemisahan kromatografi radial. Berdasarkan hasil pemisahan kromatografi radial terhadap Fi-6 didapatkan 48 vial, kemudian dilakukan uji KLT. Hasil uji KLT menunjukkan vial nomor 20, 25, 30 dan 35 mempunyai harga Rf yang sama sehingga dapat digabung. Penggabungan dilakukan dengan cara vial nomor 21 sampai 24, vial nomor 26 sampai 29 dan vial nomor 36 sampai 39 masing-masing digabung. Hasil uji KLT menunjukkan vial nomor 21 sampai 26 memiliki harga Rf yang sama dan jumlah noda yang sama, sedangkan vial nomor 27 sampai 36 juga mempunyai harga Rf yang sama dan jumlah noda yang sama (Tabel. 5). Harga Rf yang sama dapat digabung dan dilakukan pemisahan KLT preparatif Hasil pemisahan KLT preparatif dari F2-I yaitu gabungan vial nomor 21 sampai 26 dan F2-2 yaitu gabungan vial nomor 27 sampai 36 didapatkan masingmasing 2 pita. Pita ini dikemk, disaring dan ditimbang lalu diuji KLT. Hasil uji KLT menunjukkan masing-masing 1 noda dengan harga Rf yang sama sehingga 40

dapat digabung dan dilakukan uji KLT. Dari hasil uji KLT menunjukkan noda tunggal dengan harga Rf 0,44 yang menandakan senyawa ini telah mumi. Hasil KLT preparatif didapat dalam bentuk minyak yang diberi nama dengan kode ART-1 dan berat 1 mg yang berwama bening kekuningan. Hasil uji KLT menunjukkan satu noda yang dapat dilihat pada Lampiran 7. Analisis 'H NMR pada senyawa ART-1 dengan pelamt CDCI3 menunjukkan beberapa jumlah puncak. Spektmm 'H NMR (Gambar 4 dan 4a) memperlihatkan adanya satu triplet proton pada 0.90 ppm yang mempakan proton dari gugus metil, satu singlet proton pada 1.28 ppm yang mempakan proton dari gugus metilen dan satu singlet proton 2.12 ppm yang mempakan proton dari gugus metil. Berdasarkan hasil NMR, satu senyawa yang berhasil diisolasi yaitu ART-1 yang kemungkinan bempa asam lemak rantai pendek. Analisis spektmm GC-MS terhadap ekstrak n-heksan (AR-H) dan ekstrak metanol (AR-M) menunjukkan puncak-puncak dan waktu retensi tertentu. Puncak-puncak dan waktu retensi dibandingkan dengan data library sehingga dapat diketahui nama senyawanya. Untuk sampel AR-H terdapat 2 senyawa yang tidak dikenal dan 10 senyawa yang telah dikenal sedangkan pada sampel AR-M terdapat 2 senyawa yang tidak dikenal dan dua senyawa yang telah dikenal. Senyawa-senyawa yang didapat termasuk golongan seskuiterpenoid dan golongan asam lemak rantai lums. Stmktur senyawa-senyawa ini dapat dilihat pada gambar di bawah ini. (-)-a-kopaena P-karyopilena (-)-spathulenol 41

o metil heptadekanoat bisiklo [4.2.0] okt-7-ena 42